Ingeniero Civil Químico / El presente trabajo tiene como objetivo principal, idear e implementar un algoritmo para guiar el diseño de proteínas recombinantes. Para lo anterior se recopiló y conformó una base de datos de uso de codones y abundancia de ARNt para un variado grupo de organismos, que incluyó eucariontes y procariontes. El algoritmo opera sobre una secuencia de ADN codificante, de manera que: identifica, analiza cuantitativa y cualitativamente, sugiere mutaciones de acuerdo a las bases de datos designadas automática o manualmente, analiza el plegamiento del ARNm, posibilita la disminución de la estabilidad de estructuras secundarias y permite la visualización gráfica del plegamiento. El algoritmo de mutación trabaja bajo el criterio que el sesgo en el uso de codones refleja la selección para la optimización del proceso de traducción guiado por la abundancia de ARNt. El algoritmo está diseñado para maximizar la expresión recombinante de la proteína codificada sin cambiar su secuencia de aminoácidos. Las mutaciones sugeridas son específicas para cada gen y para cada organismo hospedero en donde dicho gen se desea expresar. La principal tarea y mayor desafío del presente trabajo fue trascender los mecanismos de evolución y los inconvenientes asociados a la producción de proteínas recombinantes. Esto se realizó mediante la información y evaluación de resultados experimentales de diversas investigaciones focalizadas a la genética molecular. De este modo, se logró complementar estudios desarrollados en: el uso de codones, abundancia de ARNt, baja eficiencia de traducción en los primeros ~30-50 codones del ARNm, apareamiento de codones sinónimos en el ARNm, uso de codones mayoritarios y formación de estructuras secundarias en el ARNm. Estas características de presencia transversal en la biología celular, se utilizaron como base en el diseño e implementación de la presente herramienta bioinformática, para el análisis de secuencias codificantes de ADN y mutación sinónima en el proceso de optimización de la expresión de proteínas recombinantes.

Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.

Ingeniera Civil en Biotecnología / Ingeniera Civil en Química / Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado "Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography", cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coli BL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantes Cutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimientoequivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.

La biotecnología ha adquirido un rol fundamental en la industria de producción de biofármacos, la cual ofrece nuevas alternativas para el tratamiento de diversas enfermedades. Entre los más utilizados están los anticuerpos monoclonales, los cuales se utilizan para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, cáncer, rechazo de transplante renal, tratamiento de cardiopatía coronaria, prevención de enfermedades infecciosas, diagnóstico clínico, aplicaciones industriales e investigación. Son producidos principalmente por células modificadas genéticamente, como por ejemplo la línea celular CHO-K1. En este caso, se produce el anticuerpo monoclonal recombinante anti factor de necrosis tumoral alfa, el cual se utiliza en el tratamiento de artritis reumatoide y otras enfermedades. Es por ello que se planteó desarrollar un cultivo celular en suspensión libre de componentes animales para realizar ensayos preclínicos, para la posterior administración de este anticuerpo a pacientes que lo necesitan. Se purificaron desde un cultivo bacteriano de Escherichia coli DH5α los plasmidios que contienen los genes que codifican para las cadenas del anticuerpo, se co-transfectaron células CHO-K1 con aquellos plasmidios, se seleccionó el mejor clon productor, y se caracterizó su crecimiento en adherencia suplementado con 10%, 0% v/v suero fetal bovino (FBS), y en suspensión en matraces Erlenmeyer sin FBS, proceso que fue realizado luego de muchos pasajes sucesivos. El estado metabólico de cada condición se puede apreciar en la razón lactato producido sobre glucosa consumida. Se observó que al cambiar el FBS por diversos suplementos alimenticios, la concentración de células viables máxima (de 1,87∙106 cels/ml a 1,17∙106 cels/ml), viabilidad y tasa específica de crecimiento (de 0,038 hr-1 a 0,027 hr-1) disminuyeron ligeramente, y la productividad de anticuerpo medida en absorbancia a 405 nm (de 0,155 a 0,414) y la tasa específica de absorbancia (de 0,0083 [106 /(hr x cels)] a 0,012 [106 /(hr x cels)]) aumentaron ligeramente, lo cual muestra que el cambio de medio de cultivo hizo que el clon creciera más lentamente, pero fuera un mejor productor. Los cambios más drásticos en las variables medidas fueron observados en el cultivo en suspensión sin FBS, las cuales siguieron la misma tendencia anterior (concentración de células viables máxima de 0,34∙106 cels/ml y tasa específica de crecimiento de 0,009 hr-1), con la excepción de la productividad de anticuerpo, ya que la concentración de células viables fue demasiado baja para mostrar una producción de anticuerpo significativa. Además, la concentración de lactato estuvo en niveles inhibitorios al segundo día de cultivo. Analizando los perfiles metabólicos, se observó que las células en suspensión utilizaron la energía sólo para mantención, crecieron muy poco y luego murieron. Este fenómeno pudo haber ocurrido porque no se utilizó el medio de cultivo, concentración de nutrientes, suplementos, estrategia de alimentación, modo de operación del biorreactor, protocolo de adaptación y/o vectores de expresión adecuados, con lo cual queda propuesta una serie de estrategias para mejorar el comportamiento de los clones en cultivos futuros.

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T12:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goes_LidianaCristinade_M.pdf: 4033239 bytes, checksum: 07d68044592d217e51b3096b35496c87 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho visou investigar o efeito dos quelatos IDA-Ni(II), CM-Asp-Ni(II), TED-Ni(II) e TREN-Ni(II) na purificação de pró-insulina humana recombinante com cauda de poli(histidina) (PIS) a partir de solução clarificada, obtida após solubilização dos corpos de inclusão e sulfitólise, proveniente do processo de produção de insulina (BIOMM, MG). Dentre os adsorventes estudados, Sepharose-TREN-Ni (II) apresentou a maior capacidade de adsorção em termos de PIS, cerca de 50% da proteína alimentada. Os demais adsorventes apresentaram a seguinte ordem de capacidade de adsorção IDA > HisTrap > CM-Asp > TED. Em termos de seletividade, os adsorventes com CM-Asp-Ni (II) e TEDNi (II) imobilizados apresentaram maior seletividade. Os dados de adsorção de PIS no equilíbrio a 25°C foram bem representados pelo modelo de Langmuir-Freundlich., fornecendo valores de capacidade máxima de adsorção entre 43,14 mg e 154,56 mg de PIS/g de adsorvente e valores de constante aparente de dissociação entre 10-5 a 10-7 M. O estudo termodinâmico para adsorção de PIS nos adsorventes estudados na faixa de 4 a 25°C (exceto para TED-Ni(II), faixa de temperatura de 25 a 45°C) mostrou diminuição dos valores de Kd com o aumento da temperatura, fornecendo valores de ?H° positivos para todos os casos, indicando que a adsorção de PIS nos quelatos estudados é um processo endotérmico. Os valores de ?Gº foram negativos para todos os sistemas, indicando que a adsorção é espontânea. Os valores de ?Sº encontrados foram positivos e pouco alterados com o aumento de temperatura em todos os casos, favorecendo a complexação proteína-íon metálico. / Abstract: This work sought to investigate the effect of the chelating groups IDA-Ni(II), CMAsp- Ni(II), TED-Ni(II) and TREN-Ni(II) in the purification of a recombinant human proinsulin poly-histidine tagged (PIS) starting from clarified solution, obtained from the dissolution of inclusion bodies and oxidative sulfitolysis, originating from the process of insulin production (BIOMM, MG). Among of the studied adsorbents, Sepharose-TREN-Ni (II) it presented the largest adsorption capacity in terms of PIS, about 50 % of the fed protein. The other adsorbents presented the following order in adsorption capacity IDA > HisTrap > CM-Asp > TED. In selectivity terms, the adsorbents with the chelating groups CM-Asp-Ni (II) and TED-Ni (II) immobilized presented a larger selectivity. The data of adsorption of PIS in the equilibrium to 25°C were well represented by the model of Langmuir-Freundlich, supplying values of maximum adsorption capacity between 43, 14 mg and 154, 56 mg of PIS / g adsorbent and values of apparent constant of dissociation among 10-5 to 10-7 M. The thermodynamic study for adsorption of PIS in the adsorbents considering the range from 4 to 25°C (except for TED-Ni (II), temperature range from 25 to 45°C) showed decrease of the values of Kd with the increase of temperature, providing positive values of ?H° for all of the cases, indicating that the adsorption of PIS in the studied chelating groups is a endothermic process. The values of ?Gº were negative for all of the systems, indicating that the adsorption is spontaneous. The values of ?Sº founded were positive and had little alteration due to temperature increase in all of the cases, favoring the formation of complex protein-metallic ion. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Paulo Mazzafera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schimpl_FlaviaCamila_M.pdf: 3074978 bytes, checksum: 589ce5b09a9c5f294c4bd4eaaff896b1 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Alguns grupos de plantas caracterizam-se por acumularem cafeína. Chá, café e guaraná, que acumulam cafeína, são algumas dessas plantas. As sementes de guaraná possuem o maior teor de cafeína já descrito em plantas, entre 2,5 e 6%. A popularização dos produtos a base de guaraná e a alta demanda por cafeína natural (obtida por descafeinação de plantas) destacam o interesse comercial pela espécie. A biossíntese de cafeína em plantas foi extensivamente estudada em café e chá e ambas espécies têm as mesmas vias chave da biossíntese da cafeína. O terceiro passo da via ocorre na presença de teobromina sintase (TS), enzima com atividade específica na conversão de 7-metilxantina em teobromina, e/ou dependendo da espécie, na presença de cafeína sintase (CS), uma enzima bifuncional que atua nos dois últimos passo da síntese de cafeína, na conversão da 7-metilxantina para teobromina e posteriormente desta para cafeína. O objetivo desta tese foi caracterizar os níveis de metilxantinas, atividade e expressão de CS em frutos de guaraná, sendo que para isto foram realizadas análises bioquímicas e moleculares nos tecidos de cinco cultivares (BRS-Amazonas, BRS-CG372, BRS-CG611, BRS-Maués, BRS-Luzéia). Teobromina acumulou preferencialmente em folhas (estádios jovem, intermediária e madura), caule (porção apical e basal), inflorescência, pericarpo de frutos nos estádio verde, intermediário e maduro. Nas sementes, a cafeína foi o alcaloide que acumulou em maior quantidade e atingiu níveis entre 3,3 e 5,8%. Nos tecidos analisados, seja teobromina ou cafeína, a maior concentração do alcaloide foi em tecidos novos, reduzindo com o desenvolvimento. Enquanto que teofilina foi encontrada em quantidades baixas em todos os materiais. A maior concentração de cafeína em frutos imaturos foi confirmada pela maior atividade de CS e maior expressão de PcCS. A busca do gene da CS de guaraná no banco de sequências EST Realgene gerou uma sequencia de nucleotídeos (PcCS) com 1080 pb, que apresenta semelhança filogenética com proteínas de CS de cacau (BCS1) e chá (TCS1 e TCS2). A produção da proteína recombinante permitiu a caracterização funcional de PcCS como uma CS bifuncional, capaz de catalisar os dois últimos passos de metilação da biossíntese de cafeína. PcCS mostrou afinidade para 7-metilxantina e teobromina (maior afinidade), diferindo das CS descritas para outras espécies acumuladoras de cafeína, que possuem maior afinidade por paraxantina. Provavelmente isto se deve aos resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo da proteína predita, quando comparada com a de café / Abstract: Some plants are characterized by presenting high contents of caffeine. Tea, coffee and guarana, which accumulate the alkaloid caffeine, are some of these plants. Guarana seeds have the highest caffeine content (2.5 and 6%) among plants accumulating methylxanthine alkaloids. The increase in popularity of products made from guarana and the high demand for natural caffeine (obtained by decaffeination plant) justify the commercial interest for this species. The biosynthesis of caffeine in plants has been extensively studied in coffee and tea and both species present high similarity regarding the caffeine biosynthesis pathway. The third step of the pathway occurs in the presence of the enzyme theobromine synthase (TS), which converts 7-methylxanthine to theobromine but depending on the species, this step is also mediated by caffeine synthase (CS), an bifunctional enzyme that in addition to convert 7-methylxanthine to theobromine, also convert the later to caffeine. The aim of this study was to characterize the levels of methylxanthine alkaloids, activity and expression of caffeine synthase in the guarana fruit, and for this biochemical and molecular analyses were carried out in tissues of five cultivars of guarana (BRS-Amazonas, BRS-CG372, CG611-BRS, Maués-BRS, BRS-Luzéia). Theobromine was preferentially accumulated in the leaves (young, intermediate and mature stages), stems (apical and basal sections), inflorescence, and pericarp of fruits (green, intermediate and mature stages). However caffeine accumulated in the seeds as the main alkaloid and reached levels between 3.3 and 5.8%. In all tissues analyzed, whether theobromine or caffeine, the alkaloid concentration was higher in new tissues, reducing with the development/maturation. While theophylline was found in low amounts in all materials. The highest concentration of caffeine in immature fruits was confirmed by the highest activity of CS and highest expression of PcCS. The search for the CS gene of guarana in the EST guarana database Realgene generated a sequence of nucleotides (PcCS) with 1080 bp, which presented phylogenetic similarity with proteins of caffeine synthase from cocoa (BCS1) and tea (TCS1 and TCS2). The production of the PcCS recombinant protein allowed the functional characterization of the enzyme as a bifunctional CS, able to catalyze the two last methylation steps in the biosynthesis of caffeine. PcCS showed affinity for 7-methylxanthine and theobromine (highest), differing from the CS described for other species accumulating caffeine, which have highest affinity paraxanthine. This is probably due to the amino acid residues present in the active site of the predicted protein when compared to coffee / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T01:42:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_M.pdf: 2208429 bytes, checksum: 860e813410e0f18d21e22d51ca77e727 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os trabalhos realizados utilizando plantas transgênicas como biorreatores para produção de proteínas recombinantes indicam que a cano Ia, o milho e a soja são candidatos de grande potencial. Apesar da semente de soja e suas proteínas serem sistemas bem estudados, não existem estudos sistemáticos e comparativos sobre da utilização da soja como um biorreator, no tocante à extração e purificação de proteínas recombinantes. Até hoje, segundo a literatura consultada, só existe uma tentativa de usar soja como biorreator (Russel et al., 2005), mas por causa da baixa expressão da proteína recombinante (hormônio de crescimento humano), este estudo aparentemente não teve continuidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar, sob o ponto de vista de recuperação (extração) e purificação, sementes de soja como biorreatores para produção de proteínas recombinantes, usando b-glucuronidase recombinante (rGUS) como proteína modelo / Abstract: The work done on the field of using trasgenic plants as bioreactors indicates the soybean, canola and corn as a plants of choice. Although the extraction and purification of soybean seed proteins is well studied and the plant is relatively easy to transform, there is practically no study done with transgenic soybean seeds expressing recombinant proteins in terms of downstream processing. To our knowledge, soybean was used to produce human growth hormone (Russel et al., 2005), but the study of purification was not done due to the low expression level of that recombinant protein. The objective of this work to evaluate the soybean seeds, in terms of recuperation (extraction) and purification, as a bioreactor for production of recombinant proteins using b-glucuronidase (rGUS) as a model protein / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Autorizada por el autor para ser publicada a texto completo a contar de noviembre de 2011 / La producción de proteínas recombinantes utilizando células animales es un proceso clave en la elaboración de productos terapéuticos de uso mundial. Para optimizar este proceso se debe tomar en cuenta una serie de factores como la línea celular utilizada, los vectores de expresión de la proteína recombinante y el medio de cultivo. Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la optimización del medio de cultivo de células embrionarias de riñón humano (HEK-293) para la producción de un anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral (TNF-α). La estrategia general de trabajo consistió en transfectar células HEK-293 con un vector de expresión, que codifica para las cadenas liviana y pesada de un anticuerpo anti-TNF-α. Utilizando diluciones al límite de las células transfectadas, se seleccionaron seis clones productores del anticuerpo. Estos clones fueron caracterizados durante 7 días de cultivo en un medio DMEM/F12 y posteriormente en un medio mejorado, ambos con 10% de suero fetal bovino (SFB). La velocidad máxima de crecimiento en el medio mejorado fue de 0,033 hrs-1 con una máxima densidad celular de 19x106 cel/ml, siendo ésta siete veces mayor que la alcanzada en el medio DMEM/F12. Además, la producción de anticuerpo en este medio fue 1,07 unidades de absorbancia [405 nm], un 200% mayor que en el medio DMEM/F12. Utilizando un análisis factorial se obtuvo un clon capaz de crecer en estas condiciones usando una concentración de 3 mg/l de dexametasona. Este cultivo tuvo una máxima densidad celular de 2,8x106 cel/ml, una velocidad máxima de crecimiento de 0,018 hrs-1 y una producción de anticuerpo de 0,33 unidades de absorbancia. Para este clon, se obtuvieron disminuciones de un 38 y 70% en la densidad celular y producción de anticuerpo respectivamente, comparados con el medio con 10% de SFB. Finalmente se obtuvo una adaptación parcial a un crecimiento en suspensión. Este cultivo tuvo una máxima densidad celular de 0,48x106 cel/ml, una velocidad máxima de crecimiento de 0,01 hrs-1 y una producción de anticuerpo de 0,166 unidades de absorbancia. Se calcularon las tasas específicas de consumo de glucosa y producción de lactato para los crecimientos antes descritos. Se observó que las células en presencia de suero utilizan menos glucosa como fuente de energía, generando menos lactato en el medio de cultivo. Además, las células en suspensión tienen mayores tasas específicas de consumo de glucosa y producción de lactato, comparado con células en adherencia en un medio libre de suero y son capaces de utilizar lactato como fuente de carbono. Con el propósito de aumentar la producción del anticuerpo recombinante se utilizaron distintos suplementos en el medio de cultivo como ácido linoleico, insulina, extractos de levadura, sulfato de zinc, butirato de sodio y ácido valproico. Este último resultó fundamental para la producción del anticuerpo, aumentando en alrededor de un 90% la expresión en células adheridas. En conclusión, se obtuvo información del estado de las células en distintas fases de cultivo, generando una mayor comprensión del estado metabólico de células HEK-293 al generar un anticuerpo recombinante.

El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado “Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography”, cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coliBL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantesCutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimiento equivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Medici_MarceladosAnjos_M.pdf: 9527499 bytes, checksum: 3e5801335af84a91e3a95359e36cb43b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A neuromielite ótica (NMO) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central. Por muito tempo, a NMO foi considerada uma variante da Esclerose Múltipla (EM). Atualmente, as duas doenças são distinguidas por meio de exames da neuroimagem e achados laboratoriais. Em 2004, mostrou-se a presença de um anticorpo, inicialmente nomeado de anti-NMO, em 85% dos pacientes portadores de NMO. Pacientes com EM clássica não apresentam esse anticorpo em seu soro. Através de técnicas de imunofluorescência indireta, em que o soro do paciente entra em contato com tecido de SNC de camundongos ou de macacos, mostrou-se que o alvo desse anticorpo era a aquaporina-4 (AQP4). Alguns pacientes podem apresentar também autoanticorpos que reconhecem a mielina de oligodendrócito (MOG). A obtenção da AQP4 recombinante seria de grande importância para aplicação em imunodiagnóstico e pesquisa científica. Como a AQP4 é uma proteína transmembrânica, visamos nesse trabalho melhorar o rendimento e a solubilização da proteína recombinante. Buscando maximizar o processo de expressão da AQP4 em E. coli, foram escolhidos vetores de expressão e linhagens apropriadas para expressão de proteínas heterólogas recombinantes. Ainda, foram utilizados alguns artifícios moleculares, como a utilização de proteínas e tags de fusão e o aprimoramento do processo de extração protéica. Desta forma, neste estudo descrevemos a clonagem e expressão da AQP4 humana e a detecção de anticorpos anti-MOG no soro de pacientes com diagnóstico de NMO / Abstract: Neuromyelitis optica (NMO) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS). For a long time, NMO was considered a Multiple Sclerosis (MS) variant. Nowadays, the two diseases are differentiated by neuroimaging exams and laboratorial findings. In 2004 was shown the presence of an antibody, initially named anti-NMO, in 85% of NMO patients. Classic MS patients were tested seronegative for this antibody. Through indirect immunofluorescence techniques, in which patient's serum and CNS tissue from mice and monkeys are in contact with each other, was shown that the antibody's target was aquaporin-4 (AQP4). Some patients can also present autoantibodies against myelin oligodendrocyte protein (MOG). The attainment of recombinant AQP4 would be of great importance for immunodiagnosis and scientific research applications. As the AQP4 is a transmembranic protein, the improvement of the recombinant protein yields and its solubility were envisioned for this study. Seeking to maximize the AQP4 expression process in E. coli, we chose expression vectors and specific safe lineages for heterologous recombinant protein expression. Moreover, molecular artifice was utilized, as fusion proteins and tags and the enhancement of protein extraction process. Therefore, the purpose of this study was to clone and express human AQP4 and the detection of anti-MOG antibodies in NMO patients' serum / Mestrado / Imunologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular