Resumo: A butirilcolinesterase (BChE; EC 3.1.1.8) é uma esterase sérica, sintetizada por células hepáticas e amplamente distribuída no organismo. Peptídeos ricos em poliprolina derivados da lamelipodina (Lpd) foram observados dirigindo a formação e fazendo parte da estrutura tetramérica da BChE. A Lpd é uma proteína que atua na formação de protrusões da membrana celular e, é codificada pelo gene RAPH1, localizado no mesmo sítio cromosssomico do loco CHE2 (2q33). A coincidente localização no cromossomo e a relação com o tetrâmero da BChE levou à hipótese do gene RAPH1 ser o loco CHE2. O presente trabalho estudou a variabilidade do gene RAPH1 em amostras de euro (N = 100) e afro-brasileiros (N = 66), buscando também encontrar a mutação responsável pelo fenótipo CHE2 C5+, avaliando em 34 indivíduos CHE2 C5+ e 92 CHE2 C5-, os SNPs encontrados encontrados no estudo da variabiliade do RAPH1. Nos exons estudados foram encontrados apenas 2SNPs (rs3813365 e rs2465520), ambos já descritos nos grupos etnicos estudados. A genotipagem de um tagSNPs selecionado (rs2246118, íntron 6) e os observados nos exons mostrou que apenas o rs3814365 apresentou frequência alélica diferente entre afro e euro-brasileiros. Quando as frequências dos SNPs nas populações de estudo foram comparadas com frequências européias e africanas (disponíveis no NCBI), os resultados indicaram, para os três SNPs, um gradiente de frequência entre as populações, que reflete, provavelmemente, as variantes alélicas presentes nas populações fundadoras. A avaliação da região codificadora do RAPH1entre diferentes espécies indicou um alto grau de homologia e conservação. A frequência dos três SNPs estudados foi avaliada entre os fenótipo CHE2 C5+ e CHE2 C5-. Foi observada associação apenas quando as combinações dos alelos em haplótipos foram avaliadas, sendo dois haplótipos observados associados ao fenótipo CHE2 C5+. Quando o fenótipo CHE2 C5+ foi separado em fenótipo fraco e forte, com relação à intensidade da banda C5, os mesmos haplótipos mostraram associação, um ao fenótipo forte e o outro ao fraco. A atividade da BChE também foi avaliada nesses fenótipos, e mostrou ser, em média, maior em CHE2 C5+ forte quando comparado com fraco e CHE2 C5-. Estes resultados corroboram a hipótese de que o gene RAPH1 seja o loco CHE2 e que a interação entre Lpd e BChE parece interferir na atividade enzimática apenas em CHE2 C5+ forte.

Orientador : Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T01:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bergamo_RogerioFaria_M.pdf: 6051631 bytes, checksum: 9711522de3b435ba4b70b90f01650401 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador : Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T09:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caldana_Camila_M.pdf: 4777195 bytes, checksum: 3b75b91e6c97233cfc8bb424d04196d2 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Xy/ella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, limitada ao xilema, responsável por doenças em culturas de grande importância econômica, como a clorose variegada dos citros no Brasil e a doença de Pierce em videira. Devido à colonização de micro ambientes específicos sujeitos a uma forte pressão, supõe-se que a bactéria possua mecanismos de agregação entre células e entre essas e a parede dos vasos colonizados. Tal interação pode estar associada com sua patogenicidade. Assim, este trabalho teve por objetivo a avaliação dos genes diferencialmente expressos de X. fastidiosa em resposta a uma condição de simulação de adesão in vitro, através da análise de "microarrays" e do padrão 2D-PAGE de proteínas. A estirpe 9a Sc foi cultivada nas seguintes condições: bactérias planctônicas (C) x bactérias crescidas em suspensão em meio com lâminas de lenho (S) e C x bactérias aderidas às lâminas de lenho (L). Foram realizadas curvas de crescimento para padronização da fase exponencial, determinada de 4 a 6 dias para C e S e de 6 a 8 dias para L. Para a análises de microarranjos, os experimentos C x S, não foram encontradas diferenças significativa na de expressão no conjunto de genes avaliados. Enquanto em C x L , foram encontrados genes do metabolismo intermediários e componentes estruturais, como os que codificam proteínas de membrana e de transporte. No padrão 2D-PAGE, não foi possível a extração de proteínas das células bacterianas aderidas às lâminas de lenho pela presença de contaminante. Na análise C x S, nós identificamos algumas proteínas diferencialmente expressas, duas proteínas de membrana e uma cisteína-protease, esta última em sua forma funcional, ou seja, sem a porção N-terminal, que parecem estar envolvidas na adesão em outros organismos. Os resultados indicaram novos genes e proteínas que podem estar envolvidas no processo inicial de adesão de X. fastidiosa / Abstract: Xy/ella fastidiosa is a gram-negative and xylem-limited bacterium, which is the causal agent of diseases of several important crops, such as the Citrus Variegated Chlorosis in Brazil and the Pierce's disease in grapevine. Due the colonization in environment under high pressure, it is believed that the bacterium presents mechanisms of aggregation among the cells and between the cells and the wall of the colonized vessels. This interaction appears to be associated with its pathogenicity. This work aimed the evaluation of differentially expressed genes of Xy/ella fastidiosa in response to an in vitro adhesion condition through microarrays and pattern of proteins in 2D-PAGE. The strain 9a5c was grown as a planldonic population (C), planktonic population in medium containing pieces of wood (5), and bacteria adhered to the wood (L). Growth curves were done in order to standardize the exponential growth phase, which was determined to be between 4 and 6 days for C and 5 and between 6 and 8 days for L. In the microarray analysis, 5 did not show any significant difference from C in the expression pattern of the pool of genes evaluated. On the other hand, in the experiment L versus C, we identified genes belonging to the intermediary metabolism and structural components like membrane and transport proteins. For 2D-PAGE, the extraction of proteins from cells adhered to the wood was not possible because of a contaminant present in the preparation. In the analysis of C versus 5, we identified some proteins differentially expressed, two membrane proteins and a cysteine protease without the N-terminal portion (functional form), which seem to be involved in adhesion in other organisms. The results uncovered new genes and proteins that could be involved in the initial process of adhesion of X. fastidiosa / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_KarenCristianeMartinezde_D.pdf: 5254739 bytes, checksum: 0ad62e8da65f64eb496edbbea59a467f (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Orientador : Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_VictorGenu_M.pdf: 8695049 bytes, checksum: f7325aca5bdba7aa3cdaac798284d2ec (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A expressão de genes da classe II (codificadores de proteínas) em organismos eucariotos é regulada de uma maneira altamente complexa, de modo a assegurar que genes específicos sejam adequadamente "ligados" ou "desligados" em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, disponibilidade de nutrientes ou temperatura) ou a estágios do desenvolvimento do organismo (por exemplo, diferenciação em metazoários). De maneira geral, apenas os genes cujos produtos são requeridos em uma determinada condição são expressos, permanecendo aqueles "supérfluos" silenciados. Essa é uma forma comum de economia de energia, pois evita o dispêndio com a transcrição de genes que não são necessários de imediato. Um modelo interessante de estudos sobre regulação gênica em eucariotos é derivado do metabolismo de metanol (metabolismo C1) de leveduras metilotróficas, como Hansenula polymorpha (sinônimo: Pichia angusta). A utilização de metanol como fonte única de carbono e energia depende basicamente dos produtos de quatro genes (MOX, CAT, DAS, FMD) , que são fortemente reprimidos na presença de glicose e intensamente ativados quando as células entram em contato com metanol. Nesse trabalho, foram estudados diferentes aspectos da regulação do metabolismo C1, em especial, da expressão do gene MOX, codificador da primeira enzima dessa via metabólica, Metanol Oxidase (MOXp). Será descrita a existência de dois Pontos de Iniciação da Transcrição alternativos controlando a expressão do gene MOX em diferentes condições metabólicas, e também a dependência da atividade mitocondrial para a ativação gênica. Possíveis relações evolutivas desse processo com o metabolismo C1 serão apontadas. A dinâmica de posicionamento de nucleossomos em situações de repressão e indução também foi estudada e importantes implicações para a regulação gênica foram detectadas. Em uma busca por fatores adicionais que controlam a expressão de MOX, foram clonados fragmentos de genes homólogos a SW/2/SNF2 e SW/3, que codificam subunidades do complexo remodelador de cromatina SWI/SNF, envolvido com a ativação de uma série de genes regulados por glicose em Saccharomyces cerevisiae. Em H. polymorpha, mutações swi2 e swi3 levaram a deficiências na utilização de metanol (e de outras fontes de carbono) e também a uma redução drástica do nível de expressão normal de MOX. Finalmente, foi detectada a restauração da habilidade de células de H.polymorpha crescerem em galactose, como decorrência das mutações swi2 e swi3 introduzidas / Abstract: The expression of protein-coding genes in eukaryotic organisms is regulated in a highly orchestrated and elaborated fashion to ensure that specific genes are turned on and off in response to different environmental stimuli (e.g. food availability or temperature) or to temporal and developmental requirements (e.g. differentiation in metazoans). Generally, only the genes whose products are required under a certain circumstance are expressed, while those "unneeded" are kept silent. This is an ordinary way of saving energy, since it avoids useless wasting with the expression of genes unessential in a given metabolic situation. An interesting model for studies on eukaryotic gene regulation is derived from the methanol metabolism (C1 metabolism) of methylotrophic yeasts, as Hansenula polymorpha (synonym: Pichia angusta). The utilization of methanol as a sole carbon and energy source depends mainly of the products of four genes (MOX, CA T, DAS, FMD), which are strongly repressed by glucose and fully activated when the cells are grown in methanol. In this work, different issues on the regulation of C1 metabolism in H. polymorpha were studied, specially on the transcriptional regulation of the MOX gene encoding the first enzyme of this particular metabolic pathway, Methanol Oxidase (MOXp). It will be described the existence of two alternative Transcription Starting Points controlling MOX expression under different physiological conditions and also the dependence on mitochondrial activity for gene activation. Possible evolutionary implications of this process with C1 metabolism will be considered. The dynamics of nucleosome positioning on the MOX promoter under repressing and derepressíng conditions was also studied and important implications on gene regulation were detected. In a search for additional factors controlling the MOX gene expression in H. polymorpha, gene fragments homologous to the Saccharomyces cerevisiae SW/2ISNF2 and SW/3 genes encoding subunits of the SWI/SNF chromatin-remodeling complex were cloned. In H. po/ymorpha,swi2 and swi3 mutations led to a deficiency on the utilization of methanol (as of other carbon sources) and also to a drastic reduction of the normal levels of MOX expression on cells growing on methanol. At last, the restoration of the ability of H. po/ymorpha cells to grow on galactose was detected, as a consequence of the swi2 and swi3 mutations introduced. Possible evolutionary considerations and also the repressive role played by the SWI/SNF complex on the galactose utilization pathway in normal cells will be discussed. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:34:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assmann_ElianaMaria_D.pdf: 6880566 bytes, checksum: ba97551fb74962986e52c8fef76dad11 (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Orientador : Michael Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:25:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gauer_Luciane_D.pdf: 3550679 bytes, checksum: 87a2693a27d27965fcd3ac17128f8533 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: O locus Opaco-2 codifica um fator de regulação da transcrição do tipo bZIP que atua no controle coordenado do metabolismo do carbono, nitrogênio e da síntese das prolaminas de reserva durante o desenvolvimento da semente de milho. Prováveis proteínas ortólogas e várias bZIPs similares a OPACO-2 foram identificadas e parcialmente caracterizadas em outras monocotiledôneas. A análise filogenética de um grupo e não redundante de bZIPs de plantas, incluindo os quatros genes de A. thaliana, Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 e Bzo2h4, permitiu identificar um grupo de 20 proteínas homólogas à proteína O2, denominada de família O2. Bzo2h2 é um gene único que provavelmente representa uma função comum a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Genes quiméricos a fim de promover o silenciamento gênico ou a superexpressão de Bzo2h2, assim como fusões traducionais da seqüência promotora desse gene com o gene marcador gusA foram introduzidos em A. thaliana. Um mutante nulo para Bzo2h2 também foi obtido a partir de um banco de mutantes de inserção de T-DNA. Bzo2h2 encontra-se expresso nos feixes vasculares, mais especificamente no floema de cotilédones, folhas, hipocótilo, raízes, flores e vagens. A localização in situ da presença do mRNA para Bzo2h2 através da técnica de hibridação in situ permitiu confirmar os resultados obtidos através da avaliação da atividade de GUS. Uma análise detalhada do padrão de expressão de Bzo2h2 ao longo do desenvolvimento revelou que a atividade de GUS já se encontra presente no procâmbio no estágio de maturação do embrião, indicando que mesmo antes de haver a diferenciação de xilema e floema, o gene Bzo2h2 já se encontra expresso, caracterizando assim um marcador de diferenciação do floema. A expressão específica de Bzo2h2 no floema sugere um possível envolvimento deste gene em algum aspecto da diferenciação deste tecido, já que ele se encontra expresso no procâmbio e no ápice de raízes, regiões onde o xilema e o floema ainda não se diferenciaram. Entretanto, análises histológicas da anatomia do feixe vascular de plantas superexpressando Bzo2h2 e do mutante nulo bzo2h2-1 não revelaram diferenças na organização e na estrutura do tecido vascular em relação a plantas selvagens. A ausência de fenótipo diferencial nas plantas silenciando Bzo2h2 e no mutante nulo bzo2h2-1 pode estar relacionada com o fato de que as condições testadas não permitiram evidenciar o processo no qual Bzo2h2 está envolvido, ou que as modificações são sutis e consequentemente de difícil percepção, ou ainda que algum grau de redundância funcional pode estar mascarando os efeitos das mutações em Bzo2h2. Juntos, os resultados levam à identificação de um gene que se mantém expresso ao longo de praticamente todos os estágios do desenvolvimento, exceto nos primeiros estágios embrionários, em todos os órgãos; e que parece não responder aos principais reguladores do crescimento e desenvolvimento, como fitohormônios, açúcares e estresses abióticos, como estresse osmótico, ausência de luz e baixa temperatura / Abstract: Opaque-2 (O2) is an important regulatory locus of maize seed endosperm development. O2 is involved in coordinated regulation of storage protein synthesis, nitrogen and carbon metabolism in developing seeds. O2 homologous genes were identified in both monocots and dicots, but probable O2 orthologous were only described in monocots. Phylogenetic analysis of a possible complete and nonredundant collection of angiosperm bZIP factors, including the four genes of A. thaliana, Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 and Bzo2h4, resulted in the identification of 20 angiosperm O2 homologues that define the O2 gene family. Bzo2h2 is a unique gene which represents an ancestral function. Construction containing the cDNA in sense orientation under the control of a strong promoter was obtained for overexpressing Bzo2h2. Quimeric gene aimed at inducing gene silencing through RNA interference mechanism was also constructed. In addition, a construction with the promoter sequence of this gene fused to the reporter gene (gusA) was made, in order to define the expression pattern of Bzo2h2. Knockout mutant of Bzo2h2 was obtained. GUS activity analysis revealed that Bzo2h2 is expressed in vascular tissues of cotyledons, leaves, hypocotyl, primary and lateral roots, flowers and siliques. Cross sections of roots and leaves revealed that its expression is specific of the phloem. In situ hybridization analysis confirmed the previous results. GUS activity also revealed that Bzo2h2 expression is present in the procambial cells during the embryo maturation stage. In this stage the xylem and phloem are not differentiated yet. This suggests that the Bzo2h2 gene may be involved in the differentiation of this tissue. Cross sections of roots and leaves of overexpressing Bzo2h2 and Knockout Bzo2h2 mutant plants revealed that vascular tissue organization and structure was not altered when compared to the wild type plants. The lack of visible phenotypes in knockout mutant and overexpression plants could be attributed to functional redundancy or inability to detect weak phenotipic changes. We have identified a gene that express through the whole life cycle of plant, except in the early embryogenesis, in all organs and doesn¿t respond to the growth regulators such as phytohormones, sucrose and abiotic stress (osmotic stress), darkness and low temperature / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Herculano Penna Medina Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:01:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orsi_CintiaHotta_M.pdf: 7025269 bytes, checksum: a62f1a619d719384ad24501990040cdd (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador : Luis Eduardo Soares Netto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T21:34:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Demasi_AnaPaulaDias_D.pdf: 6119509 bytes, checksum: c2567938716903e44d3454768d871456 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Tiorredoxina peroxidase citoplasmática I (cTPxI) é uma enzima antioxidante de Saccharomyces cerevisiae pertencente à família das peroxirredoxinas, conservada desde bactérias até humanos, capaz de reduzir hidroperóxidos às custas de um substrato contendo tio!. Nossos estudos a respeito de sua função em leveduras demonstraram que CTPX1 é altamente expresso em células expostas a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio. Resultados posteriores revelaram que cTPxI é essencial para a defesa antioxidante de células com deficiências respiratórias, demonstrado pela elevada sensibilidade ao H2O2 de células mutantes em CTPX1 (l1ctpxI) com disfunções mitocondriais. Além disso, mostramos que a remoção de DNA mitocondrial ou a deleção do gene COXI0, necessário para a montagem de cito cromo c oxidase, induzem a formação de HzOz. Independentemente de como e onde a função mitocondrial é perturbada, a produção endógena de EROs parece ser necessária para o aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo de células Dctpxl Este fenômeno foi demonstrado por testes de viabilidade e por determinações dos níveis de grupos sulfidrila protéica e não protéica. Em acordo, a expressão de CTPX1 é bastante elevada nas condições em que a proteína correspondente é essencial para a defesa antioxidante. Finalmente, obtivemos evidências de que cTPxI especificamente protege células com deficiência respiratória contra EROs, uma vez que deleções de genes que codificam outras peroxidases não promoveram alterações de sensibilidade de células com mitocôndrias funcionalmente defeituosas ao H2O2. Portanto, cTPxI parece ser especialmente importante na proteção de células expostas simultaneamente a fontes de EROs endógenas e exógenas. Deficiências respiratórias são freqüentemente associadas ao processo de envelhecimento, doenças neurodegenerativas e câncer em células humanas. De acordo com nossos resultados, peroxirredoxinas, especialmente aquelas que apresentam elevada similaridade a cTPxI de levedura, poderiam exercer papel decisivo no destino, sobrevivência ou morte, de células afetadas por estas desordens / Abstract: Cytosolic thioredoxin peroxidase I (cTPxI) is a Saccharomyces cerevisiae antioxidant enzyme that belongs to peroxiredoxins family, conserved from bacteria to humans, able to reduce hydroperoxides in the presence of a thiol substrate. Our study concerning its role in yeast cells demonstrated that CTPXI is highly expressed in cells exposed to different H2O2 concentrations. Further results revealed that cTPx I is essential for the antioxidant defense of respiratory deficient cells, demonstrated by high sensitivity to H2O2 of ctpxI mutant cells with dysfunctional mitochondria. In addition, we have shown that lack of mitochondrial DNA or COX10 deletion, gene required for cytochrome c oxidase assembly, lead to H2O2 increased generation. Regardless where or how mitochondrial function is perturbed, endogenous ROS production seems to be necessary to increase sensitivity of ctpxI cells to oxidative stress. This phenomenon was demonstrated by viability tests and by sulfhydryl content determinations. Accordingly, C1PX1 expression was high in conditions where the corresponding protein was essential to antioxidant defense. Finally, we have obtained evidences suggesting that cTPxI specifically protects respiratory deficient cells against ROS, since deletion of genes encoding other peroxidases did not alter the sensitivity of cells with mitochondrial dysfunction to HzOz. Therefore, cTPxI seems to be remarkably important in the protection of cells exposed simultaneously to ROS generated by endogenous and exogenous sources. Respiratory deficiencies are frequently associated with cancer, neurodegenerative diseases and aging in human cells. Our results suggest that peroxiredoxins, specially those with high similarity to yeast cTPxI, could exert decisive role in the destiny, survival or death, of cells affected by these disorders / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Jose Andres Yunes, Marcelo Menossi Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:16:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_PatriciaCristina_M.pdf: 495249 bytes, checksum: 3807489e52f878aa95cbb67fa6677a53 (MD5) Previous issue date: 2004 / Mestrado