Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Higa_TatianaTakahashi_D.pdf: 7037768 bytes, checksum: 33246873053ff36625590ad0122d9364 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: o termo Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (PHHF) é usado para descrever um grupo heterogêneo de doenças hereditárias, caracterizadas por níveis aumentados de HbF na vida adulta, sem outros distúrbios hematológicos significativos.Do ponto de vista das alterações moleculares podem ser caracterizadaspor deleções gênicas ou por mutações de ponto...Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: We report an in vitro expression study ofthe Ay-globin gene promoter containing the Ay-195 C-7G mutation that causes the Brazilian Type ofHereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH). To demonstrate that this mutation results in increased promoter strength, we evaluated the mutant promoter linked to the Hypersensitive Site-2 (HS2) ofthe Locus Control Region (LCR) with the luciferase reporter gene system and examined protein interactions by eletrophoretic mobility shift assay....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Clínica Médica

Orientador : Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T10:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_EdnaLobo_M.pdf: 8817376 bytes, checksum: b4419889c5d139f715652a53bb461fa3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador : Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_PericlesMendoncaDiasda_D.pdf: 28986078 bytes, checksum: 7671ac8cbb611b4ea7ab9230a9d96ae6 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A anemia falciforme é uma alteração genética das hemácias, caracterizada por hemólise crônica e episódios de crises de oclusão vascular. O defeito genético consiste em uma mutação na posição 6 da cadeia f3da hemoglobina, que confere às hemácias alterações na sua forma e estrutura, tornando-as mais rígidas, deformadas e distorcidas, com tendência para a formação de polúneros e conseqüente obstrução do fluxo sanguíneo. Um simples ponto de mutação transforma a anemia falciforme em uma entidade clínica heterogênea, sugerindo a idéia de que diferentes mecanismos possam estar envolvidos. O mecanismo exato, pelo qual o fluxo sanguíneo normal é interrompido pelas hemácias, ainda não é totalmente esclarecido. Numa doença como a anemia falciforme, na qual a velocidade da passagem das hemácias rígidas pelos vasos sanguíneos tem importância relevante, o tônus e a regulação vascular assumem papel primordial, sendo este controle mediado, em parte, pelo óxido nítrico, cuja ação é inibidapelo superóxido. Diversos estudos têm indicado o envolvimento da lesão endotelial e do processo inflamatório subclínico no desencadeamento e progressão dos processos da oclusão vascular. A participação dos leucócitos no dano aos tecidos dos pacientes com anemia falciforme é objeto de investigação, sendo a leucocitose um fator de mau prognóstico na doença. Investigou-se inicialmente a liberação do óxido nítrico pelos leucócitos, analisando sua capacidade de inibir a agregação de plaquetas lavadas induzida pela trombina. Os resultados mostram que os granulócitos de pacientes com anemia falciforme (n=9) liberam óxido nítrico de maneira similar aos granulócitos de controles sadios (n=9), pois foi necessário um número semelhante de células para inibir a agregação plaquetária (mediana de 4,4 x 106e 4,3 x 106,respectivamente). Na ausência de SOD, não foi detectada liberação de óxido nítrico pelos leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme (n=9), pois eles não afetaram a agregação de plaquetas nesta situação. Na presença de SOD, não houve diferença na liberação do óxido nítrico entre leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme e controles, pois o número de leucócitos mononucleares necessário para inibir a agregação de plaquetas foi semelhante entre os pacientes (mediana de 3,4 x lO6ml, n=9) e os controles sadios (mediana de 3,3 x lO6ml,n=9). Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina inuc1eotídeofosfato (NADPH) oxidase (forma reduzida) associada à sua membrana citoplasmática, que gera superóxido e outros reativos intermediários tóxicos do oxigênio, os quais apresentam potencial de injúria aos tecidos. O sistema NADPH-oxidase é composto por cinco subunidades: p40-pho / Abstract: Sickle cell anemia is a genetic disorder of red blood cells characterized by chronic hemolysis and episodic vaso-oclusive crisis. The molecular defect is caused by a point mutation at the 6thposition ofthe f3chain ofhemoblobin, which leads erythrocytes to abnormal sickle shape, rigidity, deformability and distortion with consequent blood flow obstruction. A single point mutation leads sickle cell disease to a clínical heterogenous disorder, supporting the idea that a different set of mechanisms might be involved in this disease. It is still not completely understood how sickle erythrocytes interrupt blood flow. Current evidence indicate that endothelium damage, and a subclínical inflammatoryprocess take place in the initiation and progression of vascular occlusion. The role of leukocytes in the tissue injury of sickle cell anemia patients is a current subject of investigation. The NADPH-oxidase system of professional phagocytes catalyzes the production of superoxide by the one-eletron reduction of oxigen (respiratory burst). This is the starting point for the production of reactive oxidants species, which are potential tissueinjury mediators. The NADPH-oxidase system is composed by tive components: p40-Phox p4TPh°x,p6Tphoxexist in the cytosol as a complexoThe other two components gp91-phoxandp22-PhOX form the cytocrome b558in the cell membrane and function as the terminal electron carrier ofthe oxidase. Afier activation, the cytosolic complex migrate to membrane binding to citocrome b558and assemblythe active oxidase. The involvement of the leukocyte NADPH-oxidase system has not been investigated before in sickle cell anemia. The experimental approach was focused on: a) the release of nitric oxide by neutrophils and mononuclear leukocytes ITom sickle cell anemia patients. It was assayed by the ability of leukocytes to inhibit thrombin-induced washed platelet aggregation. Neutrophils ITom sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those ITomhealthy controls. The inhibition of platelet aggregation by neutrophils ftom sickle cell anemia or ftom hea1thycontrols was blocked by L-NAME (300JlM), but not by D-NAME (300JlM), and was reversed by L-arginine (lmM). Additionaly, a similar number of neutrophils ftom sickle cell anemia patients and írom healthy controIs was required to inhibit platelet aggregation. Mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients inhibited platelet aggregation only in the presence of superoxide dismutase (60 U rnl-I) b) the release of superoxide by neutrophils and mononuc1earsickle cell anemia leukocytes. lt was assassed by the SOD specific inhibition of cytochrome c reduction assay. PMA (30nM) or ZYM (100 partic1es/cell)-induced release of superoxide by mononuc1ear leukocytes :lTomsickle cell anemia patients was significant1yhigher than that observed in mononuc1ear leukocytes írom healthy controIs (p<0,001 e p<O,Ol, respectively, Mann-Whitney test). The levels of superoxide released by neutrophils írom sickle cell anemia patients was similar to those írom healthy controIs. c) the activity of SOD or cellular glutathione peroxidase in neutrophils and mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients was assayed by the xantine-oxidase induced cytochrome c reduction and the cellular glutathione peroxidase activity was asseyed by the NADPH oxidation induces by tbuthyl hydroperoxide. The activites of SOD and GHS-Px in neutrophils and mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes were similar to those ITom healthy controIs d) the gene expression of gp91-phox, p22-phoxand p6Tphoxin mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes. Monocytes' RNA :lTom steady state sickle cell disease patients and healthy control subjects were used in a quantitativerelative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The results revealed that gp91-phoxrelative gene expression in mononucIear leukocytes írom sickle cell anemia patients (n=21) was significant1yhigher compared to healthy controIs (n=23, p=0,03, Mann-Whitney test) and that p2Tphox(n=24 patients, 24 controls) and p6Tphox(n=22 patients, 22 controls) relative gene expression in mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes was similar to healthy controIs.e) the phosphorylation of a group of 47kDa cell proteins. It was assayed by the incorporation of 32P-Labeledby sickle cell (n=4, 4 x1O7cells/rnl) or healthy controls (n=6, 4 xl07 cells/rnl) mononuclear leukocytes, in basal state or after stimulation with PMA (30nM). We found a higher phosphorylation in 47kDa protein sickle cell mononuclear leukocytes than in healthy controls. Conclusions The results have shown that leukocytes :&om sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those :&omhealthy controls; sickle cell anemia mononuclear leukocytes release more superoxide, when stimulated with PMA or ZYM, than mononuclear leukocytes ITom healthy controls; gp91-PhoXgene expression is upregulated in monocytes :&omsickle cell patients compared to healthy controls, and the phosphorylation of 47kDa proteins in sickle cell anemia mononuclear leukocytes is more intense than healthy controls. The NADPH-system is activated in sickle cell anemia mononuclear leukocytes and may be responsible, at least in part, for the inactivation of nitric oxide. This may contribute to inflammationand vascular dysregulation in sickle cell disease / Doutorado / Pediatria / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador : Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:25:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_FabioTebaldiSilveira_D.pdf: 10338280 bytes, checksum: 37792b86af8630dc08c3fdb7b9c7918d (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Estresses ambientais representam um dos principais fatores limitantes para a produtividade agrícola. Sendo assim, fazem-se importantes estudos que têm por objetivo analisar ao nível molecular os efeitos causados por esses estresses. Neste trabalho, analisamos o perfil de expressão gênica em plântulas de cana-de-açúcar submetidas a baixas temperaturas. Inicialmente, membranas de alta densidade (DNA macroarrays) contendo 1536 ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do projeto SUCEST (Sugarcane EST Project) foram hibridadas com sondas de cDNAs obtidas a partir de RNA total de tecido foliar de plântulas de cana-de-açúcar crescidas in vitro e submetidas a 4 oC por 3, 6, 12, 24 e 48 h. Como controle, foram utilizadas plântulas in vitro crescidas a 26 oC. O experimento foi repetido duas vezes, utilizando-se RNA total de novas plântulas tratadas e controle. Somente ESTs que apresentaram padrão de indução ou repressão semelhantes nos dois experimentos foram considerados para posterior análise. Desta forma, os resultados permitiram a identificação de 59 ESTs que foram induzidos ou reprimidos pelo estresse abiótico, dentre os quais alguns ESTs sem homólogos no GenBank. Alguns genes selecionados tiveram seu perfil de expressão confirmado por RNA-blot. Utilizando o banco de dados do SUCEST e seqüências de proteínas oriundas do NCBI, foi gerado um banco de dados contendo 33 proteínas de cana-de-açúcar relacionadas ao frio. Dentre essas proteínas foi identificada proteína similar a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein), a qual está envolvida em mecanismos de redução da produção de espécies reativas de oxigênio durante estresses abióticos. Posteriormente, quatro outras proteínas pertencentes à família PUMP foram identificadas no banco de dados do SUCEST, além de quatro proteínas pertencentes à família AOx (alternative oxidase). Análises filogenéticas corroboraram a hipótese da existência de novos membros de ambas as famílias de proteínas em cana-de-açúcar (Saccharum sp. PUMPs e AOxs, ou seja, SsPUMPs e SsAOxs, respectivamente) e em Arabidopsis (AtPUMPs e AtAOxs). Análise do perfil de expressão desses genes sugere que PUMPs e AOxs são expressos em órgãos diferentes em cana-de-açúcar e em Arabidopsis. Adicionalmente, resultados de RNA-blot sugeriram que dois membros da família de PUMPs (SsPUMP4 e SsPUMP5) e um membro da família AOx (SsAOx1c) foram induzidos por baixa temperatura (4 oC), enquanto que, em Arabidopsis, dois membros da família PUMP (AtPUMP4 e AtPUMP5) e um membro da família AOx (AtAOx1a) foram também induzidos pelo estresse abiótico, entretanto, com perfis diferentes. Interessantemente, o gene AtAOx1d foi reprimido após exposição das plantas a baixas temperaturas. Análises in silico demonstraram a existência de 26 membros da superfamília de proteínas NAC em cana-de-açúcar, incluindo um gene identificado em estudos de expressão gênica, denominado SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). Este gene foi completamente seqüenciado e posteriormente analisado. Resultados de RNA-blot sugerem que o gene SsNAC23 é regulado por baixa temperatura (4 oC), mas não por 12 °C, além de herbivoria (Diatraea saccharalis) e estresse hídrico (Polietilenoglicol, PEG 6000, 20%). Ensaios de localização subcelular demonstraram que a proteína SsNAC23 localizou-se preferencialmente no núcleo de células epidérmicas de cebola (Allium cepa). A construção de um modelo molecular do domínio NAC da proteína SsNAC23 permitiu a análise de determinantes estruturais possivelmente envolvidos em ligação a DNA, sugerindo seu papel como fator de transcrição. Alinhamento desses determinantes de outras proteínas contendo domínio NAC revelou alta conservação de importantes aminoácidos envolvidos no contato entre proteína e molécula de DNA. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a proteína SsNAC23 é um fator de transcrição envolvido em mecanismos de resposta a estresses bióticos e abióticos / Abstract: Environmental stresses represent one of the main factors limiting crop productivity, being very important studies that aim to analyze, at a molecular level, the effects caused by these stresses. In the present project, we analyzed the sugarcane gene expression profiles in response to low temperature. Initially, high-density filter arrays containing 1536 ESTs (Expressed Sequence Tags) from SUCEST (Sugarcane EST Project) were hybridized with P33-labeled cDNA probes obtained from total RNA of sugarcane plantlets growing at 4 oC during 3, 6, 12, 24, and 48 h. As a control, plantlets growing at 26 oC were utilized. The experiment was repeated twice, being total RNA extracted from novel cold-treated and untreated plantlet sets. Only those ESTs, which presented similar expression profiles in both experiments, were taken into consideration for a further analysis. The results allowed identifying 59 ESTs that were induced or repressed by chilling stress. Selected genes had their expression profiles confirmed by RNA-blot analysis. Using SUCEST database and protein sequences from NCBI, a database containing 33 sugarcane proteins related to cold temperatures was generated. Among those proteins, we identified a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein) gene family member. This protein was reported to be involved in oxidative stress responses. Further, in SUCEST database, four additional proteins belonging to PUMP and four proteins belonging to AOx family (alternative oxidase) were identified. Phylogenetic analyses confirmed the existence of novel members of both protein families in sugarcane (Saccharum sp. PUMPs and AOxs: SsPUMPs and SsAOxs) and Arabidopsis (AtPUMPs and AtAOxs). Gene expression profile analyses suggested that PUMPs and AOxs are expressed in different plant organs. RNAblot results suggested that two members of sugarcane PUMP gene family (SsPUMP4 and SsPUMP5) and one member of AOx family (SsAOx1c) were induced by low temperature (4 oC). Arabidopsis PUMP4 and PUMP5 orthologs and one member of AOx family (AtAOx1a) were also induced by cold stress. Interestingly, AtAOx1d was down-regulated after plantlets were exposed In silico analyses demonstrated the existence of 26 members of sugarcane NAC domain protein family, including the cold-inducible SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). This gene was completely sequenced and analyzed. RNA-blot results suggested that SsNAC23 is modulated by extreme low temperatures (4 oC), but not at moderate ones (12 oC). SsNAC23 transcripts also accumulated in response to herbivory (Diatraea saccharalis) and PEG-induced water stress. Nuclear localization essays demonstrated that SsNAC23 was targeted to nucleus of onion cells (Allium cepa). A molecular model of the NAC domain of SsNAC23 allowed analyzing the structural determinants putatively involved in DNA-binding, evidencing the SsNAC23 transcriptional activator nature. Alignment of other NAC domain proteins revealed high structural determinants conservation in different plant species. In summary, our results indicated that the SsNAC23 is a transcription factor involved in biotic and abiotic stress response / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores : Luiz Carlos Zeferino, Maria Salete Costa Gurgel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-11-09T15:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Menezes_MarcusViniciusMartinsde_M.pdf: 4462397 bytes, checksum: 19e649c8f79ccdfab39e8019f7d69049 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Este estudo teve como objetivo avaliar a associação entre a expressão das proteínas bcl-2, c-erbB-2 e p53 com o tecido mamário não-neoplásico, o carcinoma ductal in situ e o carcinoma invasivo da mesma mama, através da imuno-histoquímica, e verificar se há um padrão de variação identificável da expressão destas proteínas com a gravidade das lesões. Foram incluídas 56 mulheres que apresentaram na mesma mama carcinoma invasivo associado com carcinoma in situ. Foram utilizados anticorpos monoclocais específicos para bcl-2 (MxH, clone 124, DAKO, código M0887-1, diluição 1:40), c-erbB-2 (RxH, DAKO, código A0485-1, diluição 1 :300) e p53 (MxH, D0-7, DAKO, código M7001-1, diluição 1:100). Foi considerado como expressão positiva quando pelo menos 1% das células corou. A prevalência da expressão da proteína bcl-2 foi de 98%, 75% e 64%, respectivamente, no tecido não-neoplásico, carcinoma in situ e carcinoma invasivo e estas diferenças foram estatisticamente significantes. O odds ratio mostrou que a magnitude destas diferenças foi maior entre o tecido não-neoplásico e o carcinoma in situ. Não houve expressão da proteína c-erbB-2 no tecido não-neoplásico e a prevalência da expressão foi de 68% e 61%, respectivamente, para o carcinoma in situ e carcinoma invasivo. A diferença observada entre o tecido não-neoplásico e carcinoma in situ foi estatisticamente significante. A prevalência da expressão da proteína p53 foi de 2%, 18% e 16%, respectivamente, no tecido não-neoplásico, carcinoma in situ carcinoma invasivo e estas diferenças foram estatisticamente significantes entre os dois primeiros componentes. A expressão da proteína bcl-2 foi mais freqüente no carcinoma in situ do subtipo não-comedo e grau nuclear 1 ou 2 e no carcinoma invasivo grau nuclear 1 ou 2. A expressão da proteína c-erbB-2 foi mais freqüente no carcinoma in situ grau nuclear 3 e a expressão da proteína p53 foi mais freqüente no carcinoma invasivo grau nuclear 3. Sessenta e quatro porcento das mulheres apresentaram expressão da proteína bcl-2 nos três componentes e 23% apresentaram apenas no componente não-neoplásico. Sessenta e um porcento das mulheres apresentaram expressão da proteína cerbB- 2 apenas nos componentes carcinoma in situ e carcinoma invasivo e 32% não apresentaram expressão em nenhum dos componentes. Setenta e oito porcento das mulheres não apresentaram expressão da proteína p53 em nenhum dos componentes e 14% apresentaram apenas nos componentes in situe invasivo. Os resultados deste estudo permitem inferir que os genes Bcl-2, C-erbB-2 e P53 estão envolvidos nas fases mais iniciais da carcinogênese mamária, ou seja, na transformação do dueto não-neoplásico em carcinoma in situ. Uma vez instalada a lesão intra-epitelial, a progressão para a forma invasiva dependeria de outros genes / Abstract: The present study aims to evaluate the association among the expression of the proteins bcl2, c-erbB-2 and p53 and the non-neoplasic mammary tissue, the ductal carcinoma in situ and the invasive carcinoma of the same breast using the immunohistochemical technique. Through this evaluation it aims to find out if there is an identifiable pattern of variation of the expression of these proteins with the gravity of the lesions. Fifty six women were included in this study and ali of them had, in the same breast, the association between invasive carcinoma and carcinoma in situ. lt has been used specific monoclonal antibodies for bcl-2 (MxH, clone 124, DAKO, code M0887-1, dilution 1:40), cerbB- 2 (RxH, DAKO, code A0485-1, dilution 1:300) and p53 (MxH, D0-7, DAKO, code M7001-1, dilution 1:100). Positive expression has been considered when, at least 1% of the cells dyed. The prevalence of the expression of the protein bcl-2 was 98%, 75% and 64%, respectively in the non-neoplasic tissue, carcinoma in situ and invasive carcinoma and these differences were statistically significant. The odds ratio confirmed that the magnitude of these differences was higher between the non-neoplasic tissue and the carcinoma in situ. There was no expression of the protein c-erbB-2 in the non-neoplasic tissue and the prevalence of expression of this protein was 68% and 61%, respectively in carcinoma in situ and invasive carcinoma. The difference found between the non-neoplasic tissue and the carcinoma in situ was statistically significant. The prevalence of expression of protein p-53 was 2%, 18% and 16%, respectively in the non-neoplasic tissue, carcinoma in situ and invasive carcinoma and these differences were statistically significant between the two formers only. The expression of the protein bcl-2 was more frequent in carcinoma in situ noncomedo type, nuclear degrees 1 or 2 and in invasive carcinoma nuclear degrees 1 or 2. The expression of protein c-erbB-2 was more frequent in carcinoma in situ nuclear degree 3 and the expression of protein p53 was more frequent in invasive carcinoma nuclear degree 3. Sixty four per cent of women studied showed expression of protein bcl-2 in ali three components and 23% of women showed it only in the non-neoplasic component. Sixty one per cent of women showed expression of protein c-erbB-2 only in carcinoma in situ and invasive carcinoma and 32% did not show expression at ali. Sixty eight per cent of women did not show expression of protein p53 in none of the components and 14% showed it only in the components 'in situ' and 'invasive'. The results of the present study allow us to conclude that the genes Bcl-2, C-erbB-2 and P53 are linked to the initial stages of mammary carcinogenesis, in other words, they are linked to the transformation of the non-neoplasic duct in carcinoma in situ. Once the intra-epithelial lesion has started, the progression to invasive form would depend on other genes / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Orientador: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-11T04:25:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Destro_MariaFernandadeSousaSetubal_M.pdf: 4049997 bytes, checksum: c65b11d1e2e17169065f897077fbfb75 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Genes homeobox transcrevem fatores de transcrição com participação importante na organogênese através do controle da proliferação e diferenciação celular. Dentre estes genes destacam-se os membros da família HOX de genes homeobox, os quais estão envolvidos em processos celulares cruciais como controle do ciclo celular, diferenciação e apoptose. Os genes HOX estão relacionados com o surgimento de diferentes tipos de neoplasias, incluindo cânceres de mama, ovário, próstata, rins, pulmão, pele e leucemias. Na cavidade oral a participação destes genes é desconhecida. O objetivo deste estudo foi comparar os níveis de expressão dos membros da família HOX de genes homeobox dos loci B e C entre amostras orais de mucosa normal e carcinoma espinocelular (CEC). Para a realização deste trabalho, amostras de mucosa oral normal de pacientes não expostos aos principais fatores de risco para o câncer oral (hábito de fumar e consumir bebidas alcoólicas) e amostras orais de mucosa normal e CEC provenientes do mesmo paciente foram submetidos a ensaios semi-quantitativos de transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) ¿duplex¿, utilizando-se primers para o gene controle GAPDH e primers específicos para cada um dos membros dos loci B e C. Em adição, os níveis de expressão destes genes foram analisados em uma linhagem de queratinócito normal (HaCAT) e em 4 linhagens celulares derivadas de CEC oral. As linhagens celulares de CEC oral expressaram todos os membros do loci C, sendo que os genes HOXC4, HOXC5 e HOXC6 apresentaram maiores níveis de expressão quando comparado com a linhagem HaCAT. HOXB13 foi expresso por todas as linhagens celulares de CEC oral. Os genes HOXB1, HOXB3, HOXB5, HOXB8 e HOXC12 não foram expressos por nenhuma das amostras de mucosa oral normal, independente da origem, e de CEC oral. O padrão de expressão dos genes HOX foi muito similar entre os dois grupos de mucosa oral normal. As expressões dos membros HOXB7, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXC10 e HOXC11 foram significantemente maiores nas amostras de CEC oral comparado com amostras de mucosa oral normal. Os níveis de expressão dos membros HOXB2 e HOXC13 foram significantemente maiores nas amostras de CEC oral quando comparado com os níveis de expressão encontrados nas amostras de mucosa normal de pacientes livres de fatores de risco. Estes resultados sugerem que a expressão alterada de alguns membros da família HOX de genes homeobox pode estar associada com o desenvolvimento e/ou progressão do CEC oral / Abstract: Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Among those genes, the HOX family is involved in crucial biological processes such as the control of the cell cycle, differentiation and apoptosis. HOX genes are related to many cancers, including those of the breast, ovary, prostate, kidney, lung, skin and leukemias. In the oral cavity, the role of those genes is unclear. The aim of this study was to compare the expression levels of HOX genes from loci B and C between normal oral mucosa and oral squamous cell carcinoma (SCC). Samples of normal oral mucosa and oral SCC obtained from the same patient, and samples of normal oral mucosa from patients without history of exposition to risk factors related to oral SCC (smoking habit and alcohol consumption) were analyzed by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) duplex method with specific primers for the control gene GAPDH and for each of the HOXB and HOXC members. Additionally, we analyzed the expression profile of those genes in a normal keratinocyte cell line (HaCAT) and 4 oral SCC cell lines. Oral SCC cell lines expressed all members of the locus C, and the expression of HOXC4, HOXC5 and HOXC6 was higher in those cell lines compared with HaCAT. Only HOXB13 was expressed for all oral SCC cell lines. None of the normal oral mucosa and oral SCC samples expressed HOXB1, HOXB3, HOXB5, HOXB8 and HOXC12. The HOX expression profile of the 2 groups of normal oral mucosa was quite similar. Regardless of the oral normal mucosa source, the expression of HOXB7, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXC10 and HOXC11 was statistically higher in oral SCC samples. HOXB2 and HOXC13 were significantly overexpressed in oral SCC when compared with normal oral mucosa from patients without risk factors related to oral SCC. These results suggest that a dysregulated expression of HOX genes from clusters B and C may be related to the tumorigenesis and/or tumor progression of oral SCCs / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia

Orientador: Antonio Condino Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:35:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_AnaCarolinade_M.pdf: 3393669 bytes, checksum: bc888c2b3e7a9f30a4d5b3c3677ca407 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os fagócitos, dentre eles, macrófagos, granulócitos e eosinófilos contêm uma NADPH oxidase associada à membrana, a qual produz superóxido e outros intermediários do oxigênio, os quais têm importante papel na defesa contra infecções. O colostro humano, além de suas propriedades nutricionais, é considerado uma importante fonte de fatores imunoprotetores para os neonatos. Os macrófagos do colostro constituem parte destes fatores imunoprotetores. O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão do gene CYBB, que codifica a glicoproteína gp91-phox, em macrófagos do colostro humano, e compará-Ias às de monócitos do sangue periférico e células mielomonocíticas humanas THP-l. Tais células foram cultivadas com IFN-y e TNF-a durante 48 horas. A seguir, a liberação de superóxido foi determinada espectrofotometricamente por meio da redução do cito cromo c especificamente inibida pela superóxido dismutase. A expressão do gene CYBB, que codifica o componente gp91-phox, foi determinada por meio de RT -PCR quantitativo-relativo. Nossos resultados mostram que a liberação espontânea de superóxido por macrófagos do colostro foi superior à de monócitos do sangue periférico. Contudo, ao serem estimulados com PMA e as citocinas IFN-y e TNF-a, macrófagos de colostro e monócitos do sangue periférico apresentam atividade NADPH oxidase equivalente. A liberação de superóxido por macrófagos do colostro e monócitos do sangue periférico foi sempre superior à de células THP-l, mesmo sendo estas, estimuladas com PMA e as citocinas IFN-y e TNF-a. Tais citocinas aumentaram a expressão relativa do gene gp91-phox em células THP-l, mas não em monócitos de sangue periférico e em macrófagos do colostro. Desta forma, após a cultura com as citocinas, as células THP-l passaram a apresentar expressão relativa do gene gp91- phox semelhante às outras duas populações, sem contudo, apresentar atividade NADPH oxidase equivalente, demonstrando que a atividade NADPH oxidase final na linhagem mielomonocítica humana é regulada em parte pela expressão do gene CYBB, é o produto de diferentes eventos do metabolismo celular e está relacionada ao estado de diferenciação celular / Abstract: Phagocytes like macrophages, granulocytes and eosinophils have a membrane-associated NADPH oxidase system, responsible for the production of superoxide and other oxygen reactive intermediates, considered critical factors for the defense against infections. The human colostrum is an important source of human macrophages. The aim of this work was to compare the NADPH oxidase activity and gp91-phox expression in 3 human myelomonocytic cell Unes: colostrum macrophages, the same mother' s blood monocytes, and THP-I cells. Specifically these cells were cultured with and without IFN-y and TNF-a during 48 hours. The assays included the spontaneous and PMA (30 nM)-induced superoxide release and the relative expression ofgp91-phox by RT-PCR. The principal results were: 1) Spontaneous superoxide release: Colostrum macrophages cultured in basal conditions release more superoxide than blood monocytes. IFN-y and TNF-a caused a significant increase in the superoxide release of blood monocytes. Colostrum macrophages were also stimulated by IFN-y and TNF-a but did not reach statistical significance. 2) PMA (30 nM)-induced superoxide release: IFN-y and TNF-a caused a significant increase in the superoxide release by blood monocytes, colostrum macrophages and THP-I cells. Colostrum macrophages and blood monocytes released much more superoxide than THP-I cells in all conditions. 3) Gp91-phox expression by relative RT-PCR analysis IFN-y and TNF-a did not interfere in gp91-phox relative expression of colostrum macrophages. IFN-y and TNF-a caused a discrete increase in gp91-phox expression of blood monocytes. IFN-yand TNF-a caused a dramatic increase in gp91-phox expression of THP-I cells. Overall, afier IFN + TNF incubation, THP-I cells, colostrum macrophages and blood monocytes presented the same relative leveI of gp91-phox expression. Our conclusions were: The basal NADPH oxidase activity is higher in colostrum macrophages compared to blood monocytes. IFN-y and TNF-a drive blood monocytes to behave like colostrum macrophages. The NADPH oxidase activity of colostrum macrophages does not respond to IFN-yand TNF-a. Although IFN-y and TNF-a drive THP-I cells, colostrum macrophages and blood monocytes to present the same relative leveI of gp91-phox expression, the 81 NADPH oxidase activity in macrophages and monocytes is much higher than in THP-I cells. Other factors in these more mature cells up-regulate the NADPH oxidase activity, providing strong and contrasting evidence that the NADPH oxidase activity in the human myelomonocytic lineage is regulated only in part by gp91-phox gene expression / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Fernando Lopes Alberto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T09:04:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peres_TarcisiodeSouza_M.pdf: 2330056 bytes, checksum: 66c1d9241ad60e2d973cfb7361a5eb7c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante todo o século XX, a pesquisa do câncer se desenvolveu de maneira sistemática, porém os últimos 25 anos foram notadamente caracterizados por rápidos avanços que geraram uma rica e complexa base de conhecimentos, evidenciando a doença dentro de um conjunto dinâmico de alterações no genoma. Desta forma, o entendimento completo dos fenômenos moleculares envolvidos na fisiopatologia das neoplasias depende do conhecimento dos diversos processos celulares e bioquímicos característicos da célula tumoral e que, porventura, a diferenciem da célula normal (GOLUB e SLONIM, 1999). Nesse trabalho buscamos o melhor entendimento das vias moleculares no processo neoplásico por meio da análise dos dados do Projeto Genoma Humano do Câncer (CAMARGO, 2001) com vistas à identificação de genes diferencialmente expressos nas neoplasias dos seguintes tecidos: mama, cólon, cabeça e pescoço, pulmão, sistema nervoso central, próstata, estômago, testículo e útero. A metodologia de geração dos transcritos utilizada pelo Projeto Genoma Humano do Câncer é conhecida como ORESTES (DIAS et al, 2000). Inicialmente, os dados de seqüenciamento (fragmentos ORESTES) foram agrupados por meio de uma técnica conhecida em Bioinformática como ¿montagem¿, utilizando o pacote de programas de computador PHRED/PHRAP (EWING e GREEN P., 1998). A comparação de cada agrupamento com seqüências conhecidas (depositadas em bases públicas) foi realizada por meio do algoritmo BLAST (ALTSCHUL et al, 1990). Um subconjunto de genes foi selecionado com base em critérios específicos e submetido à avaliação de seus níveis de expressão em diferentes tecidos com base em abordagem de inferência Bayesiana (CHEN et al, 1998), em contraposição às abordagens mais clássicas, como testes de hipótese nula (AUDIC e CLAVERIE, 1997). A inferência Bayesiana foi viabilizada pelo desenvolvimento de uma ferramenta computacional escrita em linguagem PERL (PERES et al, 2005). Com o apoio da literatura, foi criada uma lista de genes relacionados ao fenômeno neoplásico. Esta lista foi confrontada com as informações de expressão gênica, constituindo-se em um dos parâmetros de um sistema de classificação (definido para a seleção dos genes de interesse). Desta forma, parte da base de conhecimento sobre câncer foi utilizada em conjunto com os dados de expressão gênica inferidos a partir dos fragmentos ORESTES. Para contextualização biológica da informação gerada, os genes foram classificados segundo nomenclatura GO (ASHBURNER et al, 2000) e KEGG (OGATA et al, 1999). Parte dos genes apontados como diferencialmente expressos em pelo menos um tecido tumoral, em relação ao seu equivalente normal, integram vias relacionadas ao fenômeno neoplásico (HAHN e WEINBERG, 2002). Dos genes associados a estas vias, 52% deles possuíam fator de expressão diferencial (em módulo) superior a cinco. Finalmente, dez entre os genes classificados foram escolhidos para confirmação experimental dos achados. Os resultados de qPCR em amostras de tecido gástrico normal e neoplásico foram compatíveis com com os dados de expressão gênica inferidos a partir dos fragmentos ORESTES / Abstract: The XXth century showed the development in cancer research in a systematic way, most notably in the last 25 years that were characterized by rapid advances that generated a rich and complex body of knowledge, highlighting the disease within a dynamic group of changes in the genome. The complete understanding of the molecular phenomena involved in the physiopathology of neoplasia is based upon the knowledge of the varied cellular and biochemical processes which are characteristic of the tumor and which make it different from the normal cell (GOLUB e SLONIM, 1999) In this work, we investigated the molecular pathways in the neoplasic process through data analyses of the cDNA sequences generated on the Human Cancer Genome Project (CAMARGO, 2001). The following neoplasias were included: breast, colon, head and neck, lungs, central nervous system, prostate gland, stomach, testicle and womb. The methodology of generation of transcripts used by the Genome Project of Human Cancer is known as ORESTES (DIAS et al, 2000). Initially, the sequence of data (ORESTES fragments) were grouped and assembled according to similarity scores. For this purpose, we used the package of computer programs PHRED/PHRAP (EWING e GREEN P., 1998). The resulting consensus sequences, each representing a cluster, were compared to known sequences (deposited in public databanks) through the BLAST algorithm (ALTSCHUL et al, 1990). A subgroup of genes was selected based on specific criteria and their levels of expression in different tissues were evaluated by a bayesian inference approach (CHEN et al, 1998), as compared to more classical approaches such as null hypothesis tests (AUDIC e CLAVERIE, 1997). The Bayesian inference tool was represented as a PERL script developed for this work. A list of genes, putatively related to the neoplasic phenotype, was created with the support of the literature. This list was compared to the gene expression information, becoming one of the parameters of a ranking system (defined for the selection of genes of interest). Therefore, part of the knowledge related to cancer was used together with the data of gene expression inferred from ORESTES fragments. For a more accurate understanding of the molecular pathways involved in the generated information, the genes were classified according to the Gene Ontology (ASHBURNER et al, 2000) and KEGG (OGATA et al, 1999) nomenclatures. Additional global analyses by pathways related to the neoplasic phenomenon (HAHN e WEINBERG, 2002) demonstrated differential expression of the selected genes. About 52% of the genes in this pathways were differentially expressed in tumor tissue with at least a 5-fold. Finally, ten genes were selected for experimental validation (in vitro) of the findings with real-time quantitative PCR, confirming in silico results / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T17:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_CamilaOrescodos_D.pdf: 28263366 bytes, checksum: 0bb038ac0bb395e9aed9a7089336b2d0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: AHSP é uma proteína eritróide específica que apresenta afinidade de ligação com a-globinas, estabilizando essas moléculas e dessa forma, evitando a precipitação nos precursores eritróides e bloqueando danos celulares causados pela oxidação de cadeias globínicas. Camundongos portadores de P-talassemia com deleção do gene AHSP apresentaram maior precipitação de cadeias a-globinas nas hemácias e níveis acentuados de anemia. Estudos in vitro utilizando proteína recombinante demonstraram menor geração de espécies reativas de oxigênio quando a-globinas encontram-se estabilizadas pela AHSP. Com o objetivo de analisar a importância da proteína AHSP como modulador de gravidade clínica nas síndromes P-talassêmicas o gene AHSP foi analisado em amostras de DNA de pacientes com P-talassemia, atendidos pelo Hemocentro da Unicamp, e em amostras controles durante minha tese de mestrado. Durante estes estudos, três características do gene AHSP foram detectadas. Estas características do gene AHSP foram investigadas durante o desenvolvimento deste presente trabalho. Primeiro, um polimorfismo localizado no posição 12888 no gene AHSP, que leva a substituição de uma Asparagina na posição 75 por uma Isoleucina (N75I), foi identificado em uma paciente heterozigota para P-talassemia (Pj9/pA) com anemia grave e em processos transfusionais freqüentes. Outras duas famílias apresentaram o polimorfismo N75I. Entretanto, nestes casos a presença do polimorfismo no gene AHSP não se correlaciona claramente com a gravidade clínica. O sequênciamento de amostras de indivíduos controles de várias partes do mundo sugerirão uma baixa freqüência deste polimorfismo na população analisada. Estudos de indivíduos saudáveis positivos para o polimorfismo N75I demonstraram precipitação e oxidação de cadeias globínicas nas hemácias. Análises funcionais com proteína recombinante sugerem que a proteína AHSP N75I apresenta características de ligação com a-globínas normais, mas é menos eficiente em evitar geração de espécies reativas de oxigênio por estas cadeias globínicas. Estes efeitos, quando em conjunto com ?-talassemia poderiam resultar em anemia mais grave, demonstrando a proteína AHSP N75I como um modificador genético nas síndromes talassêmicas. Segundo, através de análises computacionais, nós identificamos uma estrutura secundária na região 3'-UTR do RNA mensageiro do gene AHSP. semelhante a um elemento responsivo a ferro (IRE), presente em todas as espécies que apresentam o gene AHSP. Várias evidências demonstraram que, mesmo não apresentando as características principais para a caracterização de um IRE, esta estrutura secundária do gene AHSP é reconhecido pelas proteínas reconhecedoras de IREs (IRPs) regulando a estabilidade da molécula de RNA mensageiro em resposta aos níveis de ferro: 1) Recuperação do RNA mensageiro do gene AHSP através da imunoprecipitacão das proteínas IRP1 e IRP2: 2) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP: mutações neste IRE levam à desestabilização constitutiva do RNA mensageiro; 3) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP em camundongos que apresentam excesso de ferro. Estes dados contribuem para o melhor entendimento de como IRE atípicos podem ainda ser funcionais e sugerem um mecanismo que poderia regular a estabilidade de cadeias globínicas de acordo com os níveis de ferro. Além disso, sugerem que o excesso de ferro, que ocorre em pacientes com (3-talassemia. podem ser determinante na gravidade da doença por, provavelmente, aumentar os níveis de a-globinas livres e precipitando nos precursores eritróides. E, em terceiro, através de busca de sítios de ligação de fatores de transcrição no gene AHSP, nós encontramos um elemento MARE localizado no final do segundo éxon. Estudos de imunoprecipitaçâo de cromatina demonstraram ligação dos fatores de transcrição Nrf2, Bachl e Maf ao elemento MARE do gene AHSP e regiões controle. Concluindo, estes resultados demonstraram pela primeira vez um polimorfismo no gene AHSP que produz uma proteína não completamente funcional que pode estar relacionada com gravidade à p-talassemia e, além disso, descrevem dois mecanismos inéditos da regulação da expressão do gene AHSP que podem ser importantes na regulação deste gene em outras doenças hematológicas e durante a eritropoiese / Abstract: Alpha-hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is an erythroid-specific molecular chaperone that binds the cx-chains of hemoglobin, preventing their precipitation and deleterious effects. Loss of AHSP exacerbates a-globin precipitation and anemia in a murine model for p-thalassemia. In vitro, recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species (ROS) by a-globin. To further define the role of AHSP as a modifier of P- thalassemia, we analyzed AHSP sequence for mutations in a large population of (3- thalassemic and control subjects. From this genomic screening three interesting features of the AHSP gene were found. First, a single nucleotide change that converts asparagine 75 to leucine (N75I) was identified in a patient who was heterozygous for P-thalassemia (p39/(3A). She presented with an unusually severe anemia that required regular blood transfusion. Another two families were positive detected for the SNP N75I. but the presence of other known genetic modifiers for thalassemia in these families made hard to correlate clinical severity with AHSP. Of the unrelated control subjects tested just one (0.35%) contained the SNP N75I. Analysis of red blood cells from this subject revealed normal hemoglobin indices but a small number of Heinz bodies, suggesting a non-fully functional AHSP. Analysis of the biochemical properties of the recombinant mutant protein showed that the binding affinity of AHSP N75I for a- hemoglobin is normal. Importantly, compared to wild type AHSP, the N75I mutant protein exhibited significantly reduced capacity to inhibit ROS production by a-hemoglobin. Hence, AHSP N75I may be less effective at conferring protection from oxidative-mediated damage by free a-hemoglobin in erythrocytes. These effects, when coupled with P-thalassemia, could result in more severe anemia, implicating AHSP N75I as a potential genetic modifier. Second, by computational algorithms, we identified IRE-like stem-loop structures in AHSP mRNA of multiple species, yet the primary sequences deviate significantly from canonical IRE consensus sequences determined by studies of classical IREs, such as Transferring receptor and Ferritin. Several lines of evidence now show that the AHSP IRE binds IRPs to regulate mRNA stability in an iron-dependent fashion: 1) AHSP mRNA co-immunoprecipitates with IRPs. 2) AHSP mRNA is destabilized by iron in both erythroid and heterologous cells; disruption of the IRE renders the mRNA constitutively unstable. To study how iron regulates AHSP expression in vivo, we treated mice with iron dextran for 10 days and then examined AHSP mRNA in Terll9+ erythroid progenitors by RT-PCR. We found that short-term iron overload reduced AHSP mRNA levels. Our findings indicate that AHSP mRNA stability is regulated by iron via an atypical 3'-UTR IRE. These findings extend the potential repertoire for functional IREs that do not conform as the previously defined canonical consensus sequences. In addition, they provide a potential mechanism by which erythroid cells can regulate globin stability according to iron status. As such, iron overload, which occurs in patients with p thalassemia, might aggravate the disease by further elevating the levels of toxic free a globin. And third, by computation analysis of transcriptional sites, we found a potential MARE element located at the end of the second exon. Experiments of chromatin imunoprecipitation assay determined the binding of the transcript factor Nrf2, Bachl and Maf to the MARE element of AHSP gene, as well to the positive controls. Overall, these results demonstrated for the first time a polymorphism on AHSP gene that produce a non fully functional protein that might be correlated with severity in p-thalassemia and two new mechanisms that control the AHSP gene expression with potential implications in another hematological diseases besides thalassemias and closely connecting AHSP with erythropoiesis / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Anete Pereira de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:23:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_JoseSergiodeMacedo_M.pdf: 3092877 bytes, checksum: 85276ce21b221869d2fb74dc6cef8444 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O fitopatogeno Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema que causa uma variedade de doenças economicamente importantes em plantas, incluindo uma doença chamada Clorose Variegada de Citrus (CVC). Recentemente, os dados de sequenciamento do DNA fornecidos pelo projeto genoma da Xylella fastidiosa permitiram uma aproximação da área genoma funcional para investigar a função de diversas proteínas baseadas na informação sobre suas estruturas. Avanços recentes na área genoma estrutural não somente nos ajudou a compreender funções da proteína, mas também causou um grande impacto na indústria farmacêutica. Nos últimos anos, o uso da informação estrutural de proteínas na pesquisa de descoberta de novas drogas tem amadurecido, e é usado agora em todos os níveis, variando da identificação e da seleção de alvos do genoma a candidatos apropriados. Esta emergente área é poderoso meio para compreender mais profundamente os mecanismos a patogenicidade da bactéria. Este trabalho visa adicionar novas informações sobre proteínas que podem ser relacionadas a patogenicidade de Xylella fastidiosa, necessárias para o desenvolvimento de novos métodos de combate à CVC. A fim de recolher informações sobre as proteínas envolvidas nos mecanismos do patogenicidade da bactéria, nós escolhemos as orf xf2148 e orf xf1524 de Xylella fastidiosa para estudos de caracterização. A orf xf2148, apresenta 47% de similaridade com o gene ksgA de Escherichia coli. O gene ksgA codifica uma Dimetiladenosina transferase da classe de proteínas metiltransferases. Já a orf xf1524, apresenta 55% de similaridade com o gene xpsL de Xanthomonas campestris, que codifica uma proteína transmembrana da via de secreção do tipo II. Ambas as proteínas foram clonadas no vetor pET32Xa/LIC e expressas na bactéria Escherichia coli linhagem BL21(DE3). A proteína XPSL foi purificada através de uma cromatografia de afinidade (IMAC) e teve sua identidade determinada por SDS-PAGE e Espectrometria de Massas (MALDITOF). Para investigar a integridade estrutural da proteína XPSL purificada, a técnica espectroscópica de Dicroísmo Circular (CD) foi realizada. O espectro de CD da proteína XPSL mostrou sinais predominantemente de 'alfa'hélices indicando um perfil de estrutura secundária devidamente enovelada viável para estudos estruturais e funcionais. A proteína XF2148, expressa em sua forma insolúvel, foi resolubilizada usando 8M de uréia como agente desnaturante. A proteína foi purificada através de uma cromatografia de troca iônica e sua pureza e identidade verificadas por SDS-PAGE e Espectrometria de Massas (MALDI-TOF). Seu correto enovelamento por espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) indicou uma composição predominantemente de 'alfa'hélices. O alinhamento da seqüência primária e modelagem por homologia da proteína XF2148 com uma proteína de estrutura tridimensional resolvida, KsgA de E. coli, revelaram um local da molécula que envolve resíduos altamente conservados no domínio C-terminal e cinco dos oito motivos estruturais encontrados geralmente em Metiltransferases / Abstract: The phytopathogen Xylella fastidiosa is a xylem-limited bacterium that causes a range of economically important plant diseases, including a serious disease of orange trees called citrus variegated chlorosis (CVC). Recently, DNA sequence data provided by the Xylella fastidiosa Brazilian genome project have allowed a functional genomic approach to investigate the function of several proteins based on the information about their structures. Recent advances in structural genomics not only help us to understand protein functions but also have a big impact on the pharmaceutical industry. In the last few years, the use of protein structural information in drug discovery research has matured, and it is now used at all levels, ranging from genomics target identification and selection to the final design of suitable drug candidates. This emergent area is a powerful means to more deeply understand the mechanisms of the bacterium pathogenicity. This work aims at adding new information on proteins that may be related to the X. fastidiosa pathogenesis, necessary for new approaches towards the combat of CVC. In order to gather information about the proteins involved in the mechanisms of the bacterium pathogenicity, we chose orf xf2148 and orf xf1524 from Xylella fastidiosa for characterization studies. Orf xf2148, presents 47% of similarity with the gene ksgA of Escherichia coli. The ksgA gene encodes a dimethyladenosine transferase from the methyl transferase proteins class. On the other hand orf xf1524, presents 55% of similarity with the xpsL gene of Xanthomonas campestris, which encodes a transmembrane protein of the type II secretion machinary. Both proteins were cloned into the pET32Xa/LIC vector to overexpress the protein in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed XpsL protein was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and had its identity determined by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MALDI-TOF). To investigate the structural integrity of the purified XPSL, the protein was analyzed by Circular Dichroism (CD) spectroscopy. The XpsL CD spectrum showed that it contains predominantly signal of 'alfa'helices suggesting that the XpsL recombinant protein maintains secondary structures, is viable to functional and structural studies and remained folded. The XF2148 protein was expressed in the insoluble form and refolded using 8M Urea as denaturating agent. The protein was purified in one step by cation-exchange chromatography and its purity and identity were verified by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MALDI-TOF). Its correct folding was verified by Circular Dichroism Spectroscopy analysis that indicated a secondary structure composed mainly of 'alfa'helices. The alignment of the XF2148 primary sequence and homology modeling with one ksgA structure solved protein from E. coli, revealed a site involving highly conserved residues in the C-terminal domain and five of the eight structural motifs usually found in AdoMetdependent methyltransferases / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular