Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rincones_Johana_D.pdf: 3507237 bytes, checksum: b5905da7ffa8ea3a869dd3090e9a1d1f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Vassoura-de-Bruxa do cacaueiro constitui um patosistema complexo e até o momento não foi estabelecido um plano de controle efetivo na região produtora da Bahia. O objetivo principal deste trabalho foi aprimorar os conhecimentos sobre a interação C. perniciosa-Cacaueiro com informações referentes à: 1) tamanho e organização do genoma através da obtenção do cariótipo molecular do fungo; 2) variabilidade genética deste fitopatógeno a nível cromossômico na região produtora da Bahia; e 3) expressão gênica do fungo em presença de extratos do hospedeiro. O cariótipo molecular foi estabelecido por eletroforese em gel de campo pulsado. Esta mesma metodologia foi utilizada em combinação com análise tipo microsatélites para um estudo de variabilidade a nível cromossômico de 38 isolados provenientes de três biótipos e diferentes regiões geográficas. Para análise da expressão gênica foram seqüenciadas quatro bibliotecas de cDNA do fungo sob diferentes condições de cultivo e em diferentes estágios do desenvolvimento, incluindo uma biblioteca subtrativa obtida por SSH. Como resultados, apresentamos o cariótipo molecular de C. perniciosa e a existência de polimorfismos cromossômicos. A análise dos 38 isolados permitiu observar que o cariótipo do biótipo-C é estável ao longo do tempo e sua variabilidade na região da Bahia é baixa, mostrando assim a fragilidade do programa de melhoramento genético do cacaueiro na Bahia, onde os clones resistentes selecionados no campo foram desafiados contra apenas dois genótipos do patógeno. Com relação à análise da expressão do fungo, obtivemos 1427 unigenes e sua análise por similaridade com as bases de dados permitiu a identificação de diversos mecanismos pelos quais o fungo poderia estar manipulando o metabolismo da planta para seu benefício e em detrimento da produção de cacau. Assim, consideramos que a partir deste trabalho foi possível obter uma maior compreensão dos mecanismos utilizados por C. perniciosa no desenvolvimento da Vassoura-de-Bruxa em cacaueiro e estudos mais aprofundados, baseados nos resultados aqui obtidos, deverão auxiliar no desenvolvimento de estratégias de controle para esta importante doença / Abstract: Witches' broom disease of cocoa is a complex pathosystem that has evaded an efficient control program in the cacao-producing region of Bahia, Brazil. The main goal of this work was to acquire a better understanding of the C. perniciosa-Cacao interaction by providing new data regarding: 1) the size and organization of the fungal genome through molecular karyotyping; 2) the genetic variability of this phytopathogen at the chromosomal level in the cacao-producing region of Bahia; and 3) the gene expression of the fungus in the presence of host extracts. The molecular karyotype was obtained through pulsed-field gel electrophoresis. This same technique was applied in combination with microsatellite PCR analysis of 38 isolates from different biotypes and geographic regions in order to study the chromosomal-level genetic variability of this pathogen. For the gene expression analysis, four cDNA libraries of the fungus grown under different culture conditions and developmental stages, including a subtractive library using SSH, were sequenced and searched for similarities in the public databases. As results, we present the molecular karyotype of C. perniciosa and the existence of chromosome-length polymorphism. The analysis of the 38 isolates showed that the karyotype of the C-biotype is very stable in time and that the variability of the pathogen in Bahia is very low, thus indicating the fragility of the current cacao-breeding program in Bahia, where the resistant cacao clones selected in the field were challenged against only two different genotypes of the pathogen. With regards to the gene expression analysis, we obtained 1427 unigenes and the similarity searches allowed the identification of various mechanisms through which the fungus might be manipulating the metabolism of the plant for its own benefit and in detriment of cocoa production. Therefore, we consider that this work allowed us to acquire a better understanding of the molecular mechanisms used by C. perniciosa during witches' broom development in cacao and more detailed studies, based on the results presented here, might aid in the development of novel control strategies for this important disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kamiya_RegianneUmeko_D.pdf: 1901318 bytes, checksum: 6b54c1e6cbe9e4b6b6fb94ea27db2ec2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Esta tese, apresentada na forma de 3 artigos, teve por objetivos: (1) analisar a freqüência dos genes de produção de mutacinas I, II, III e IV, em genótipos de S. mutans isolados de indivíduos cárie-ativos e livres de cárie, (2) analisar a freqüência dos genes de produção das mutacinas I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 e genes homólogos às bacteriocinas, identificadas em outras espécies bacterianas, em cepas de S. mutans isolados de crianças, bem como detectar a expressão diferencial dos genes identificados, em células de S. mutans crescidas na condição planctônica e séssil, (3) analisar a expressão dos genes de produção das mutacinas I, II e proteínas kinases CiaH, Dgk e ComD, em diferentes fases do crescimento planctônico e séssil. O rastreamento e a freqüência dos genes estruturais de diferentes mutacinas em isolados de S. mutans, foram realizados pela técnica de PCR e a análise da expressão gênica, pela técnica de RT-PCR semi-quantitativa. Os estudos, apresentados nesta tese, demonstraram o papel das mutacinas como um fator de virulência, altamente diversificado entre a espécie S. mutans, e relacionado com o risco de cárie. Este fator de virulência, pode ser regulado por mecanismos quorum-sensing, sendo assim, dependente da condição de crescimento planctônica ou séssil. A regulação da produção de mutacinas, por mecanismos quorum-sensing, pode representar uma vantagem seletiva à espécie produtora, principalmente em ambiente complexo, como o biofilme dental e lesões de cárie. Futuramente, mais estudos serão necessários para identificar novos determinantes genéticos, necessários para a síntese de substâncias semelhantes às mutacinas, bem como, identificar os mecanismos e componentes, que modulam a expressão deste importante fatorde virulência em S. mutans / Abstract: This thesis, comprised of 3 manuscripts was designed (1) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III and IV, in S. mutans isolated from caries-affected and caries-free individuals, (2) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 and genes homologues to bacteriocins identified in other bacterial species, in S. mutans isolated from children, in addition, to detect the differential expression of these genes, in S. mutans cells grown in planktonic and sessil conditions, (3) and to analyse the expression of the mutacins I and II production genes and kinase proteins genes (ciaH, dgk e comD), in different phases of the planktonic and sessile growth. The screening and frequency of the mutacins structural genes in S. mutans isolates were realized by PCR technique and the analysis of genetic expression, by RT-PCR semiquantitative method. The studies, presented in this thesis, demonstrate the role of mutacins as a virulence factor, highly diverse among S. mutans, and related to risk of dental caries. The mutacins production may be regulated by quorum-sensing mechanisms and is dependent on planktonic and sessile conditions. The modulation by quorum-sensing mechanisms may represent a selective advantage for producer S. mutans strain, mainly in complex environments as the dental biofilm and caries. Hereafter, more studies will be necessary to identify new genetic determinants for synthesis of mutacin-like substances and elucidate the mechanisms and components that modulate the genetic expression of this important virulence factor in S. mutans / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Medici_MarceladosAnjos_M.pdf: 9527499 bytes, checksum: 3e5801335af84a91e3a95359e36cb43b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A neuromielite ótica (NMO) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central. Por muito tempo, a NMO foi considerada uma variante da Esclerose Múltipla (EM). Atualmente, as duas doenças são distinguidas por meio de exames da neuroimagem e achados laboratoriais. Em 2004, mostrou-se a presença de um anticorpo, inicialmente nomeado de anti-NMO, em 85% dos pacientes portadores de NMO. Pacientes com EM clássica não apresentam esse anticorpo em seu soro. Através de técnicas de imunofluorescência indireta, em que o soro do paciente entra em contato com tecido de SNC de camundongos ou de macacos, mostrou-se que o alvo desse anticorpo era a aquaporina-4 (AQP4). Alguns pacientes podem apresentar também autoanticorpos que reconhecem a mielina de oligodendrócito (MOG). A obtenção da AQP4 recombinante seria de grande importância para aplicação em imunodiagnóstico e pesquisa científica. Como a AQP4 é uma proteína transmembrânica, visamos nesse trabalho melhorar o rendimento e a solubilização da proteína recombinante. Buscando maximizar o processo de expressão da AQP4 em E. coli, foram escolhidos vetores de expressão e linhagens apropriadas para expressão de proteínas heterólogas recombinantes. Ainda, foram utilizados alguns artifícios moleculares, como a utilização de proteínas e tags de fusão e o aprimoramento do processo de extração protéica. Desta forma, neste estudo descrevemos a clonagem e expressão da AQP4 humana e a detecção de anticorpos anti-MOG no soro de pacientes com diagnóstico de NMO / Abstract: Neuromyelitis optica (NMO) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS). For a long time, NMO was considered a Multiple Sclerosis (MS) variant. Nowadays, the two diseases are differentiated by neuroimaging exams and laboratorial findings. In 2004 was shown the presence of an antibody, initially named anti-NMO, in 85% of NMO patients. Classic MS patients were tested seronegative for this antibody. Through indirect immunofluorescence techniques, in which patient's serum and CNS tissue from mice and monkeys are in contact with each other, was shown that the antibody's target was aquaporin-4 (AQP4). Some patients can also present autoantibodies against myelin oligodendrocyte protein (MOG). The attainment of recombinant AQP4 would be of great importance for immunodiagnosis and scientific research applications. As the AQP4 is a transmembranic protein, the improvement of the recombinant protein yields and its solubility were envisioned for this study. Seeking to maximize the AQP4 expression process in E. coli, we chose expression vectors and specific safe lineages for heterologous recombinant protein expression. Moreover, molecular artifice was utilized, as fusion proteins and tags and the enhancement of protein extraction process. Therefore, the purpose of this study was to clone and express human AQP4 and the detection of anti-MOG antibodies in NMO patients' serum / Mestrado / Imunologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular