Doctor en Ciencias con mención en Microbiología / La microcina E492, una bacteriocina formadora de poros, es producida y secretada por Klebsiella pneumoniae RYC492. El sistema genético de la microcina se clonó en Escherichia coli obteniéndose una microcina recombinante con las mismas propiedades que la producida por K. pneumoniae. Este antibiótico es sintetizado como un precursor, con un péptido líder (PL) N-terminal que es procesado concomitantemente con la exportación hacia el medio extracelular. El PL de la microcina E492 es del tipo doble glicina, lo que indica que la microcina E492 sería exportada a través de un aparato transportador ABC dado que comúnmente este sistema transportador es el encargado de exportar proteínas con esta clase de PL. El objetivo de este trabajo fue estudiar el procesamiento y exportación de la microcina E492. Mediante la caracterización de mutantes por transposición en el sistema genético de la microcina se estableció que participan tres genes en la exportación de la microcina: mceG, que codifica para el transportador ABC, mceH, para la proteína accesoria y mceF, para un factor adicional nunca antes descrito, por tanto, de función desconocida. Los aparatos transportadores ABC además están normalmente constituidos por una proteína localizada en la membrana externa. Para determinar cual es la proteína de membrana externa que forma parte el aparato transportador ABC de la microcina se utilizó una mutante en el gen tolC. La mutante tolC¯ no es capaz de exportar microcina, función que recupera al ser transformada con un plásmido que lleva el gen tolC. Así, TolC es la proteína de membrana externa que forma parte del aparato transportador ABC de la microcina en E. coli. Las proteínas candidatas de procesar el PL de la microcina son MceG y MceF. Proteínas homólogas a MceG poseen un dominio N-terminal encargado de procesar el PL. Por otro lado, la secuencia de MceF sugiere que sería una proteasa de membrana interna y una mutante carente de MceF produce una proteína de un tamaño superior que correspondería a la microcina no procesada. Los estudios de western blot de medios sobrenadantes y de fracciones totales y subcelulares obtenidos de las mutantes mceG¯ y mceF¯ indican que MceG procesa el PL de la microcina conjuntamente con MceF. Aparentemente MceF interviene en el reconocimiento junto con MceG de la microcina precursora y facilitaría que el dominio de líder-peptidasa de MceG encuentre a la microcina precursora para procesarla. MceG y MceH presentan una identidad cercana al 90% con el transportador ABC de la colicina V (CvaB) y su proteína accesoria (CvaA). En este trabajo se estudió la relación funcional que existe entre el sistema transportador de la microcina E492 y de la colicina V y sus respectivos péptidos líder tratando de establecer el papel que juega MceF en este proceso. Se realizó un análisis funcional combinando los componentes del sistema exportador de la microcina y de la colicina V, cuyo resultado indica que la colicina V puede emplear el transportador ABC y la proteína accesoria de la microcina E492 para su secreción únicamente cuando está presente la proteína MceF. Por el contrario, la microcina E492 no puede usar el transportador de la colicina V para alcanzarel medio extracelular, y la proteína accesoria CvaA complementa parcialmente la falta de su homólogo MceH en la exportación de la microcina E492. Así, la complementación funcional no es recíproca aún cuando la similitud entre ambos sistemas es muy alta y la exportación vía MceGH de ambas bacteriocinas requiere de MceF. La secuencia del PL de la microcina presenta en común cinco de los nueveaminoácidos conservados en la secuencia consenso de esta clase de péptidos líder. Los aminoácidos que difieren pueden ser importantes para el procesamiento, como la glicina en la posición –1, ya que los residuos más importantes del PL del tipo doble glicina son las dos glicinas ubicadas en las posiciones -1 y –2. La microcina presenta una alanina en la posición –1, en cambio la colicina V posee la mayoría de los aminoácidos de consenso incluyendo las dos glicinas mencionadas. Se construyeron proteínas quimeras fusionando el PL de la colicina V a la microcina madura y viceversa con el fin de determinar la importancia de los aminoácidos no conservados en el PL de la microcina y la relación que puede haber con MceF. La microcina quimera fue exportada por ambos sistemas exportadores en conjunto, en cambio, la colicina V quimera, a través de su propio aparato transportador. Comúnmente las señales de exportación que dirigen el tránsito hacia el medio extracelular de las proteínas exportadas por sistemas transportadores ABC están ubicadas en el extremo C-terminal. Sin embargo el PL podría también dirigir la exportación de estas proteínas. Se estudió el rol que tiene el PL en la exportación de la microcina clonando el gen de la microcina sin PL en un vector que permite modular la expresión del gen. Al expresar el gen, no se detectó microcina extracelular, además las células crecieron deficientemente, sobreviviendo solo las que lograron rearreglar su DNA, excluyendo el fragmento perjudicial. En el experimento control con PL, la microcina pudo ser exportada y las células crecieron saludables. Esto indica que el PL dirige la exportación de la microcina y evita el efecto deletéreo de ella sobre la célula. / Microcin E492, a channel-forming bacteriocin, is produced and secreted by Klebsiella pneumoniae RYC492. This antibiotic is synthesized as a precursormolecule, with an N-terminal leader peptide that is processed concomitant with the export to the extracellular space. The microcin leader peptide belongs to double-glycine-type leader peptides that are common in colicin V and bacteriocins produced by gram-positive bacteria. This property suggests that microcin E492 would use an ABC-transporter apparatus (Type I secretion) for its secretion. The aim of this work was to study the general features of the microcin E492 export and processing. Studying a set of mutants obtained through transposition, we found that three genes participate in the microcin export: mceG, that encodes for an ABCtransporter, mceH, for the accessory protein (also called MFP) and mceF for an additional factor not described in the literature, with an unknown function. In addition, the microcin E492 ABC-transporter apparatus is also formed by TolC, a protein localized in the outer membrane. The cleavage of microcin leader peptide could be achieved by either MceG or MceF. MceG protein homologues have an N-terminal domain that frequently cleaves the leader peptide of its cognate bacteriocin. On the other hand, the sequence analysis of MceF indicates that this protein could be a leader peptidase localized inside the inner membrane. Microcin prepared from a mutant in mceF gene showed a higher molecular weight that of microcin. Since this protein is recognized by an antibody against microcin most likely corresponds tothe microcin precursor. Western blot experiments of supernatants and whole-cell fractions as well as subcellular fractions obtained from mutants in mceG and mceF genes suggest that the ABC transporter processes the leader peptide of microcin with the assistance of MceF. A possible role of MceF could be the recognition of microcin in order to present it to MceG for processing. Transporter proteins of microcin (MceG and MceH) have an identity near to 90% with the ABC transporter of colicin V (CvaB) and its accessory protein (CvaA), respectively. In this work we studied the functional relationship that existsbetween the transporter apparatus of microcin and colicin V. The functional analysis was done through complementation between the transporter genes of microcin and colicin V. The results indicate that colicin V can use the ABC transporter and accessory protein of microcin (MceG and MceH) to be exported only when mceF gene is present in the genetic system. On the other hand, microcin cannot use the CvaB transporter, and for microcin secretion CvaA can complement only partially the lack of its homologous MceH. These studies indicate that the functional complementation is not reciprocal, and the exportation of microcin and colicin V via MceGH requires the additional factor MceF. The leader peptide sequence of microcin shares five amino acids of the nine residues found in consensus sequence of double-glycine leader peptides. The residues that are different could be important for cleavage, as it occurs with the glycine in position –1, since the most important residues of this kind of leader peptides are the two glycines situated in –1 and –2 positions. The microcin leader peptide contains an alanine in position –1 instead of the glycine of consensus. On the other hand, the colicin V leader peptide has almost all residues of the consensus sequence along with the glycines in –1 and –2 positions. To determine the importance of these amino acids of microcin in the leader peptide, we constructed chimeric bacteriocins composed by colicin V leader peptide fused to the mature form of microcin and vice versa. The chimeric microcin was exported by the combination of both colicin V and microcin transporter apparatuses, in contrast with the chimeric colicin V protein, that was exported by its own complex. Usually the exportation signals that allow proteins that are exported by ABC transporter systems are localized in their C-terminal region of the exported protein. However, in the case of small proteins such as bacteriocins, the leader peptide could also conduct their exportation. In order to study the role of the leader peptide, we cloned the microcin gene without the sequence encoding the leader peptide in a vector that allows a strict control of gene expression. When we expressed the leaderless microcin gene, no microcin was detected in theextracellular space. Cells grew poorly, surviving only the cells that were able to make a DNA re-arrangement to displace the harmful fragment, while, in the control experiment, cells carrying microcin that contained the leader peptide, grew healthy and exported microcin. This result suggests that the leader peptide is not only necessary for microcin exportation but avoids toxic effect of intracellular microcin.

Memoria para optar el título de Bioquímico / Las microcinas son un grupo de bacteriocinas de bajo peso molecular (inferior a 10 kDa), producidas principalmente por miembros de la familia Enterobacteriaceae, que inhiben el crecimiento de otras bacterias estrechamente relacionadas con la cepa productora. Estas proteínas son resistentes a condiciones adversas como temperatura y pH extremos, resisten incluso a ciertas proteasas, son solubles en metanol y no son inducibles por el sistema SOS. De todas las microcinas conocidas, la microcina 24 es una de las menos estudiadas. Según la secuencia publicada en GenBank, la microcina 24 se sintetiza como una pre-proteína de 90 aminoácidos que contiene en su extremo amino terminal una señal de exportación, que es cortado en un motivo de doble glicina al ser exportada. La proteína madura (exportada) contiene 74 residuos y posee una masa teórica de 7527 Da. El mecanismo de acción de la microcina 24 no se conoce bien. Carlson y cols. en 2001 publicaron que posiblemente el blanco de acción de esta bacteriocina se encuentra en el citoplasma, sin embargo estudios preliminares de nuestro grupo revelan que el blanco de acción de la microcina 24 es la membrana citoplasmática. En este trabajo se planteó como objetivo caracterizar la expresión de la microcina 24 e identificar el mecanismo de acción por el cual genera la muerte bacteriana. Para caracterizar la expresión de la microcina 24 se analizó el sobrenadante de un cultivo de E. coli MC1061pGOB18, en diferentes etapas de crecimiento, en búsqueda de actividad antimicrobiana. Se determinó que la microcina 24 comienza a producirse en fase exponencial de crecimiento. Un análisis transcripcional mediante RT-PCR permitió observar que la microcina 24 se transcribe junto con su inmunidad en una sola unidad bicistrónica, lo que le permite a la cepa productora regular la expresión de la microcina 24, de manera tal que no resulte tóxica para sí misma. La purificación de esta microcina se realizó a partir del sobrenadante de un cultivo productor de microcina 24, en un sistema de cromatografía hidrofóbica en fase inversa utilizando como matriz sólida una columna de Sed-Pack C18 y diferentes concentraciones de metanol como eluyente. Las diferentes fracciones obtenidas fueron evaluadas en búsqueda de actividad antimicrobiana mediante ensayos de actividad en placa. La microcina presente en las fracciones que exhibieron actividad fueron re-purificadas mediante HPLC con columna Sed-Pack C8 como matriz sólida y acetonitrilo 40% como eluyente. Esta microcina purificada se sometió a un análisis mediante espectrometría de masa, encontrándose que la microcina 24 posee una masa experimental de 7274 Da, presentando una diferencia de 253 Da menos que la masa teórica deducida. Esta diferencia se debe a un error en la secuencia publicada en Genbank, la que fue detectada al secuenciar el sistema productor completo. La corrección de la secuencia permite deducir una masa teórica de 7293 Da, que se asemeja más al valor experimental. No sólo en la secuencia de la microcina se descubrió errores, también se observó una discrepancia en el gen mdbA que originalmente contenía un dominio incompleto de unión a DNA, pero luego de la corrección se observó que la proteína codificada contiene el dominio completo. Este dominio es común en proteínas de la familia H-NS que se unen a secuencias ricas en timinas y adeninas silenciando genes. En función a estas diferencias, los genes del sistema fueron renombrados como sigue: mcnR (antiguamente llamado mdbA), mcnI (mtfI), mcnN (mtfS), mcnA (mtfA) y mcnB (mtfB). Para determinar el mecanismo de acción de la microcina 24 se propuso como hipótesis que esta microcina genera poros en la membrana (en función a la alta identidad con la microcina E492, una microcina formadora de poros), ergo, siendo su mecanismo bactericida. Para demostrar esto se realizaron ensayos de actividad β galactosidasa en E. coli DH5a y E. coli HB101, recuento de células viables y microscopía de fluorescencia. En todos estos experimentos se concluyó que la microcina 24 permeabiliza la membrana interna de las bacterias sensibles. Considerando que todas las microcinas conocidas utilizan el sistema de transporte de hierro para ingresar a la bacteria, y que las mutantes carentes de los receptores Fep, Fiu y Cir siguen siendo sensibles a la microcina 24, se propuso que el receptor de la microcina 24 es FhuA. Analizando la sensibilidad de las cepas de E. coli C600, JM110 y P8, se demostró experimentalmente que el receptor para esta microcina es efectivamente la proteína FhuA (receptor del ferricromo hidroxamato). FhuA pertenece a un sistema de 4 miembros (FhuA, FhuC, FhuD, FhuB) encargados de la internalización del hierro, por medio del sideróforo ferricromo hidroxamato. Generando una mutante en los genes fhuCDB por el método de Wanner, se determinó que estos elementos participan en el mecanismo de acción y empleando mutantes individuales para fhuCDB se determinó que la microcina 24, al ingresar al periplasma por medio de FhuA, emplea las proteínas FhuD y FhuB para permeabilizar la membrana interna

Evalúa el efecto de los fructooligosacáridos (FOS) extraídos de Cynara scolymus “alcachofa” sobre la población de Lactobacillus plantarum y el efecto sobre la producción de bacteriocinas. La extracción de FOS de Cynara scolymus es mayor a 80 °C durante 60 minutos. Se observa que al 2 % el fructooligosacáridos (FOS) de Cynara scolymus “alcachofa” tiene un efecto positivo sobre el crecimiento de la población de Lactobacillus plantarum, y la producción de bacteriocinas. Las bacteriocinas de Lactobacillus plantarum presentan actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, asimismo presentan estabilidad frente a la temperatura de 60°C, 80°C y 90°C y frente a la prueba de catalasa.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:48:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4384_1.pdf: 698040 bytes, checksum: a2b800bfa7c3059293b11eb6eda9e1fa (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / O fermentado de Zymomonas mobilis tem apresentado diversas aplicações terapêuticas contra várias infecções bacterianas. Diante desse fato, o presente trabalho teve como objetivo relacionar a ação terapêutica de Z. mobilis com a produção de bacteriocina além de caracterizar as linhagens através de SDS-PAGE, RAPD e rep-PCR. Para verificar a ocorrência de bacteriocina, foram testadas 6 linhagens de Zymomonas mobilis (CP4, Z1-86A, Z1-86B, Z1-87, Z1-88 e Z2-88) contra as linhagens Escherichia coli K12, E. coli BH57, E. coli ATCC 9637, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus e Streptococcus faecalis. Os resultados obtidos mostram que todas as linhagens de Zymomonas produzem bacteriocina, exibindo um amplo espectro de ação. Os perfis de atividade antimicrobiana mostraram diferenças significativas em relação ao heteroantagonismo. Foi avaliada também a influência do meio de cultura (SSDL e Schreder) e temperatura (30ºC e 37ºC) na expressão da atividade antagonista produzida pela Z. mobilis. Os dois meios foram eficientes para produção de bacteriocina, porém foi observada melhor atividade bacteriocinogênica para a linhagem Z1-87 no meio Schreder a 37ºC. As bacteriocinas permaneceram estáveis até 80ºC por 15 minutos e foram inativadas pela proteinase K. Não foram observados bacteriófagos e ácidos atuando como prováveis inibidores de crescimento. A cinética da produção de bacteriocina da linhagem Z1-87 no meio Schreder revelou que a produção iniciou na fase logarítmica e se estabilizou na fase estacionária. A análise eletroforética de proteínas totais não foi eficaz para a caracterização genética das linhagens de Z. mobilis. Com a técnica de RAPD foram selecionados sete primers os quais originaram 47 bandas, sendo possível evidenciar o polimorfismo entre as linhagens. O rep-PCR foi bastante sensível para detectar diferenças genéticas entre as linhagens, utilizando os primers ERIC e REP. As linhagens apresentaram um nível de similaridade em torno de 62%

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal producidos por microorganismos, principalmente del dominio bacteria. Las bacteriocinas producidas por bacterias Gram positivo o Gram negativo, presentan una actividad tóxica sobre especies bacterianas estrechamente relacionadas con la bacteria productora. Para ejercer su acción antimicrobiana las bacteriocinas utilizan receptores específicos localizados exclusivamente en la bacteria blanco, por lo tanto raramente se observa actividad citotóxica sobre células eucariontes. No obstante, algunas bacteriocinas inhiben específicamente el crecimiento de líneas celulares neoplásicas. Debido a estas propiedades, las bacteriocinas tienen una potencial aplicación biotecnológica por su posible uso como alternativa a los tratamientos con antibióticos tradicionales, o como nuevos antibióticos contra patógenos multirresistentes, como preservantes o desinfectantes en la industria alimenticia, y en el área biomédica como antineoplásicos para combatir algunos tipos de cáncer. En nuestro laboratorio encontramos un nuevo compuesto antimicrobiano del tipo bacteriocina producido por la cepa de Pseudomonas aeruginosa O400, al que hemos denominado gicina A. Este compuesto es capaz de inhibir, selectivamente, el crecimiento de bacterias Gram positivo. Debido a que no existen informes en la literatura de bacteriocinas producidas por bacterias Gram negativo que presenten actividad antimicrobiana solamente sobre bacterias Gram positivo, el estudio del mecanismo de acción y las propiedades bioquímicas de gicina A constituye un valioso aporte en la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas. El objetivo general de esta tesis fue “Purificar, caracterizar bioquímicamente, y evaluar tanto el mecanismo de acción antibacteriano de gicina A, como su toxicidad in vitro sobre líneas celulares eucariontes”. Para lograr este objetivo se realizó la purificación de gicina A mediante cromatografías en columnas hidrofóbicas y HPLC. Mediante electroforesis de proteínas y espectrometría de masas se determinó que esta proteína tiene una masa molecular de 7925 Da. La evaluación de sus propiedades bioquímicas demostró que la actividad de gicina A es estable a un amplio rango de temperaturas, conserva su actividad al ser solubilizada en una amplia gama de solventes y presenta una mayor actividad al ser solubilizada a un pH neutro. Por otra parte empleado gicina A purificada se confirmó que esta posee una actividad antibacteriana selectiva por bacterias Gram positivo. Estudios de alteración de la cinética de crecimiento de la bacteria blanco y ensayos de microscopía de fluorescencia indicaron que gicina A posee un efecto bactericida sobre bacterias Gram positivo y que este efecto es producido por una permeabilización en la membrana celular. La evaluación de la citotoxicidad in vitro de gicina A sobre células eucariontes mostró que esta bacteriocina ejerce una leve toxicidad en las líneas de origen tumoral, sin embargo no se observó efecto citotóxico sobre las líneas celulares no tumorales. / Bacteriocins are antimicrobial peptides ribosomally synthesized produced by microorganisms, mainly from Bacteria domain. Bacteriocins produced by Gram positive or Gram negative bacteria, present a toxic activity on bacterial species closely related to the bacteriocin producing bacteria. To exert its antimicrobial action, bacteriocins use specific receptors exclusively located in the target bacteria, therefore rarely cytotoxic activity on eukaryotic cells can be observed. However, some bacteriocins specifically inhibit growth of neoplastic cell lines. Because of these properties, bacteriocins have a potential for biotechnological application for its possible use as an alternative to the traditional antibiotic treatments, or as new antibiotics against multi-resistant pathogens, also as preservatives or disinfectants in food industry, and in biomedical field as antineoplastics. In our laboratory we have found a new antibacterial compound with bacteriocin properties produced by the Pseudomonas aeruginosa O400 strain, which we called gicin A. This compound is able to selectively inhibit the growth of Gram positive bacteria. Because there are no reports in the literature of bacteriocins produced by Gram negative bacteria that have antimicrobial activity only on Gram-positive bacteria, the study of the mechanism of action and biochemical properties of gicin A is a very valuable contribution to the search of new antimicrobial substances. The overall aim of this thesis was to “Purify, characterize biochemically, and assess both the antibacterial action mechanism of gicin A, and its in vitro toxicity on eukaryotic cell lines”. To achieve this objective the purification of gicin A was performed by a hydrophobic column chromatography and HPLC. Protein electrophoresis and mass spectrometry determined that this protein has a molecular mass of 7925 Da. The evaluation of its biochemical properties showed that the activity of gicin A is stable at a wide temperature range, it retains its activity when is solubilized in a wide range of solvents and has a higher activity when is solubilized at a neutral pH. Moreover, employing purified gicin A was confirmed that it has a selective antibacterial activity against Gram positive bacteria. Alteration studies of the growth kinetics of the target bacteria and fluorescence microscopy indicated that gicin A has a bactericidal effect on Gram positive bacteria and that this effect is produced by cell membrane permeabilization. The evaluation of cytotoxicity in vitro of gicin A on eukaryotic cells shows that this bacteriocin has a mild toxicity on tumoral origin cell lines, however we noticed no cytotoxic effect on non tumoral origin cell lines.

Orientador: Ana Lúcia Barretto Penna / Coorientador: Sabrina Neves Casarotti / Banca: Neuza Jorge / Banca: Aline Teodoro de Paula / Resumo: As bactérias acidoláticas (BAL) são bastante utilizadas em processos fermentativos na indústria de laticínios, porém algumas delas agem não somente como fermentadoras, com a produção de ácidos orgânicos a partir dos carboidratos presentes, mas também podem produzir substâncias que colaboram para a segurança microbiológica do produto fermentado ou compostos benéficos à saude. Em estudos in vitro anteriores, foi constatado que Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 apresenta potencial probiótico e ação bacteriostática sobre bactérias patogênicas, como Listeria monocytogenes e Escherichia coli. Neste trabalho foi avaliado o efeito de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 em creme fermentado, em co-cultura com outras BAL, e estudar as características físico-químicas e microbiológicas do creme, além de avaliar a capacidade de bioconservação pela produção de bacteriocinas, ácidos orgânicos e propriedade funcional pela produção de ácido linoleico conjugado (CLA) e pela atividade antioxidante por inibição de radicais livres. Foi utilizado creme de leite UHT homogeneizado padronizado em 20% de gordura e fermentado conforme quatro tratamentos: T1 - cultura mista de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris; T2 - cultura mista de Lc. lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris + Listeria monocytogenes ATCC 15313; T3 - Cultura mista de Lc. lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris + Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides... / Abstract: Lactic acid bacteria (LAB) are widely used in fermentation processes in the dairy industry, however some of them act not only as starters, with the production of organic acids from the carbohydrates, but they can also produce substances that contribute to the microbiological safety of the fermented product or produce health benefic compounds. In previous in vitro studies, it was found that Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 presents probiotic potential and bacteriostatic action on pathogenic bacteria, such as Listeria monocytogenes and Escherichia coli. In this study it was evaluated the effect of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 in fermented cream, in co-cultivation with other BAL, and to study the physicochemical and microbiological characteristics of the cream, besides evaluating the capacity of bioconservation by the production of bacteriocins, organic acids and functional property by the production of conjugated linoleic acid (CLA) and antioxidant activity through the inhibition of free radicals. UHT milk cream standardized at 20% fat was fermented according to four treatments: T1 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris, T2 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris + Listeria monocytogenes ATCC 15313, T3 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris + Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55, and T4 - Mixed ... / Mestre

Uma substância antimicrobiana produzida por Pseudomonas aeruginosa foi caracterizada. O microrganismo produtor foi isolado de um lago de tratamento de efluentes em um frigorífico localizado na região do vale do Rio Pardo, no Rio Grande do Sul. O isolado foi caracterizado por análise bioquímica e seqüenciamento do 16S rDNA. As condições de maior produção ocorreram a 30°C, sob agitação contínua, com o maior pico de produção a partir de 108 horas. A substância antimicrobiana foi parcialmente purificada através de precipitação com sulfato de amônio 70%, cromatografia de gel filtração (Sephadex G-100) e de troca iônica (DEAE Sepharose). A substância antimicrobiana foi caracterizada com as duas alíquotas coletadas a partir do eluato da coluna de gel filtração. Os dados da caracterização indicam que ambas as alíquotas são a mesma substância. A atividade antimicrobiana foi analisada sobre o gel de poliacrilamida. Uma banda majoritária no gel de poliacrilamida sugere que o peptídeo apresente uma massa molecular de aproximadamente 30 kDa. A substância apresentou uma ampla atividade antimicrobiana sobre cepas indicadoras, tais como S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus e importantes bactérias patogênicas e deteriorantes. A atividade antimicrobiana foi constante na faixa de 10 a 100°C, por até 60 minutos, iniciando um declínio a 120°C. O peptídeo antimicrobiano resistiu a todas as proteases testadas e teve sua atividade diminuída com DMSO, Tween 20 e 80, TCA e uréia. A substância parcialmente purificada foi utilizada no combate de S. aureus artificialmente inoculados em hambúrgueres crus de carne bovina e não inibiu seu crescimento nas condições do experimento. / An antimicrobial substance produced by Pseudomonas aeruginosa was characterized. The producer microorganism was isolated from an effluents treatment lake from an abattoir localized in Rio Pardo valley area, Rio Grande do Sul, Brazil. The strain was characterized by chemical profiling and 16S sequencing. It has reached its maximum of production under the following conditions: 86ºF, continuous agitation and aeration, 108 h. The antimicrobial substance was partially purified by ammonium sulfate precipitation 70%, gel filtration (Sephadex G-100) and ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). The antimicrobial substance was characterized into two fractions collected from gel filtration’s eluate. The characterization data indicates that both fractions are the same substance. Direct activity on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was observed. A major band on SDS-PAGE suggested that the peptide had a molecular mass of about 30 kDa. The substance was inhibitory to a broad range of indicator strains such as S. aureus, L. monocytogenes B. cereus, and important pathogenic and spoilage bacterias. The activity was constant from 50 to 212ºF, for 60 minutes, beginning to decline at 248ºF. The antimicrobial peptide resisted to all proteolitic enzymes tested and only reduced its activity with dimethyl sulfoxide, polysorbate 20, polysorbate 80, trichloroacetic acid and urea. The partially purified substance was used to combat S. aureus in meat hamburgers and didn’t inhibit its growth at the experiment conditions.

Uma substância antimicrobiana produzida por Pseudomonas aeruginosa foi caracterizada. O microrganismo produtor foi isolado de um lago de tratamento de efluentes em um frigorífico localizado na região do vale do Rio Pardo, no Rio Grande do Sul. O isolado foi caracterizado por análise bioquímica e seqüenciamento do 16S rDNA. As condições de maior produção ocorreram a 30°C, sob agitação contínua, com o maior pico de produção a partir de 108 horas. A substância antimicrobiana foi parcialmente purificada através de precipitação com sulfato de amônio 70%, cromatografia de gel filtração (Sephadex G-100) e de troca iônica (DEAE Sepharose). A substância antimicrobiana foi caracterizada com as duas alíquotas coletadas a partir do eluato da coluna de gel filtração. Os dados da caracterização indicam que ambas as alíquotas são a mesma substância. A atividade antimicrobiana foi analisada sobre o gel de poliacrilamida. Uma banda majoritária no gel de poliacrilamida sugere que o peptídeo apresente uma massa molecular de aproximadamente 30 kDa. A substância apresentou uma ampla atividade antimicrobiana sobre cepas indicadoras, tais como S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus e importantes bactérias patogênicas e deteriorantes. A atividade antimicrobiana foi constante na faixa de 10 a 100°C, por até 60 minutos, iniciando um declínio a 120°C. O peptídeo antimicrobiano resistiu a todas as proteases testadas e teve sua atividade diminuída com DMSO, Tween 20 e 80, TCA e uréia. A substância parcialmente purificada foi utilizada no combate de S. aureus artificialmente inoculados em hambúrgueres crus de carne bovina e não inibiu seu crescimento nas condições do experimento. / An antimicrobial substance produced by Pseudomonas aeruginosa was characterized. The producer microorganism was isolated from an effluents treatment lake from an abattoir localized in Rio Pardo valley area, Rio Grande do Sul, Brazil. The strain was characterized by chemical profiling and 16S sequencing. It has reached its maximum of production under the following conditions: 86ºF, continuous agitation and aeration, 108 h. The antimicrobial substance was partially purified by ammonium sulfate precipitation 70%, gel filtration (Sephadex G-100) and ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). The antimicrobial substance was characterized into two fractions collected from gel filtration’s eluate. The characterization data indicates that both fractions are the same substance. Direct activity on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was observed. A major band on SDS-PAGE suggested that the peptide had a molecular mass of about 30 kDa. The substance was inhibitory to a broad range of indicator strains such as S. aureus, L. monocytogenes B. cereus, and important pathogenic and spoilage bacterias. The activity was constant from 50 to 212ºF, for 60 minutes, beginning to decline at 248ºF. The antimicrobial peptide resisted to all proteolitic enzymes tested and only reduced its activity with dimethyl sulfoxide, polysorbate 20, polysorbate 80, trichloroacetic acid and urea. The partially purified substance was used to combat S. aureus in meat hamburgers and didn’t inhibit its growth at the experiment conditions.

Uma substância antimicrobiana produzida por Pseudomonas aeruginosa foi caracterizada. O microrganismo produtor foi isolado de um lago de tratamento de efluentes em um frigorífico localizado na região do vale do Rio Pardo, no Rio Grande do Sul. O isolado foi caracterizado por análise bioquímica e seqüenciamento do 16S rDNA. As condições de maior produção ocorreram a 30°C, sob agitação contínua, com o maior pico de produção a partir de 108 horas. A substância antimicrobiana foi parcialmente purificada através de precipitação com sulfato de amônio 70%, cromatografia de gel filtração (Sephadex G-100) e de troca iônica (DEAE Sepharose). A substância antimicrobiana foi caracterizada com as duas alíquotas coletadas a partir do eluato da coluna de gel filtração. Os dados da caracterização indicam que ambas as alíquotas são a mesma substância. A atividade antimicrobiana foi analisada sobre o gel de poliacrilamida. Uma banda majoritária no gel de poliacrilamida sugere que o peptídeo apresente uma massa molecular de aproximadamente 30 kDa. A substância apresentou uma ampla atividade antimicrobiana sobre cepas indicadoras, tais como S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus e importantes bactérias patogênicas e deteriorantes. A atividade antimicrobiana foi constante na faixa de 10 a 100°C, por até 60 minutos, iniciando um declínio a 120°C. O peptídeo antimicrobiano resistiu a todas as proteases testadas e teve sua atividade diminuída com DMSO, Tween 20 e 80, TCA e uréia. A substância parcialmente purificada foi utilizada no combate de S. aureus artificialmente inoculados em hambúrgueres crus de carne bovina e não inibiu seu crescimento nas condições do experimento. / An antimicrobial substance produced by Pseudomonas aeruginosa was characterized. The producer microorganism was isolated from an effluents treatment lake from an abattoir localized in Rio Pardo valley area, Rio Grande do Sul, Brazil. The strain was characterized by chemical profiling and 16S sequencing. It has reached its maximum of production under the following conditions: 86ºF, continuous agitation and aeration, 108 h. The antimicrobial substance was partially purified by ammonium sulfate precipitation 70%, gel filtration (Sephadex G-100) and ion exchange chromatography (DEAE Sepharose). The antimicrobial substance was characterized into two fractions collected from gel filtration’s eluate. The characterization data indicates that both fractions are the same substance. Direct activity on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was observed. A major band on SDS-PAGE suggested that the peptide had a molecular mass of about 30 kDa. The substance was inhibitory to a broad range of indicator strains such as S. aureus, L. monocytogenes B. cereus, and important pathogenic and spoilage bacterias. The activity was constant from 50 to 212ºF, for 60 minutes, beginning to decline at 248ºF. The antimicrobial peptide resisted to all proteolitic enzymes tested and only reduced its activity with dimethyl sulfoxide, polysorbate 20, polysorbate 80, trichloroacetic acid and urea. The partially purified substance was used to combat S. aureus in meat hamburgers and didn’t inhibit its growth at the experiment conditions.

Orientador: Daniela Cardoso Umbelino Cavallini / Banca: Carmen Silvia Fávaro Trindade / Banca: Elizeu Antonio Rossi / Banca: Juliana Neves Rodrigues Ract / Banca: Renata Tieko Nassu / Resumo: Embutidos fermentados, processados e consumidos sem aquecimento, são os produtos cárneos mais promissores para a veiculação de probióticos, entretanto, apresentam como desvantagens o alto teor de gordura, presença de nitrito e nitrato residual e de compostos potencialmente tóxicos, como as aminas bioativas. O presente trabalho estudou o efeito da utilização de bactérias láticas com propriedade hipolipemiante nas características tecnológicas, sensoriais e de segurança de um embutido cárneo fermentado, similar ao salame, com teores de gordura, nitrito e nitrato reduzidos. Os potenciais efeitos benéficos do produto foram investigados em um estudo in vitro. Duas cepas probióticas (Enterococcus faecium CRL183 e Lactobacillus acidophilus CRL1014) foram testadas, separadamente, como culturas iniciadoras. Os embutidos com baixo teor de gordura (redução de 60%) foram processados em seis formulações: 2 - culturas tradicionais sem redução de sais de cura (nitrito 0,015% e nitrato 0,005%); 3 - culturas tradicionais e teor reduzido de sais de cura (nitrito 0,007% e nitrato 0,003%); 4, 5, 6, 7 - culturas probióticas (E. faecium CRL183 e L. acidophilus CRL1014) com teores normais e reduzidos de sais de cura, respectivamente. Para efeito de comparação, um produto controle (1 - culturas tradicionais, sem redução de gordura e de sais de cura) também foi produzido. As culturas probióticas (Enterococcus faecium CRL 183 e Lactobacillus acidophilus CRL 1014) foram submetidas a testes preliminares para determinação da resistência às concentrações de sais de cura usualmente empregadas em produtos cárneos fermentados e avaliação da capacidade de produção de substâncias antimicrobianas pela técnica spot-on-lawn. A qualidade dos embutidos foi avaliada através de análises físico-químicas e microbiológicas, no início... / Abstract: Fermented sausages, processed and consumed without heating, are the most promising meat products for the placement of probiotics, however, have as disadvantages the high fat content and the presence of residual nitrite and nitrate and potentially toxic compounds, such as bioactive amines. This work studied the effect of using lactic acid bacteria with lipid lowering property in technological, sensory and safety characteristics of a fermented susage, similar to salami with fat, nitrite and nitrate reduced. The potential beneficial effects of the product were investigated in an in vitro study. Two probiotic strains (Enterococcus faecium CRL 183 and Lactobacillus acidophilus CRL 1014) were tested separately as starter cultures. The sausages with a low fat content (60% reduction) were processed in six treatments: 2 - traditional cultures with fat reduction and without curing salts reduction (nitrite and nitrate 0.015% 0.005%); 3 - traditional cultures with fat and curing salt reduction (nitrite and nitrate 0.007% 0.003%); 4, 5, 6, 7 - probiotic cultures (E. faecium CRL183 and L. acidophilus CRL1014) with fat reduction, without and with curing salt reduction, respectively. For comparison, a control product (1 - traditional cultures without fat and curing salts reduction) was also produced. Probiotic cultures (E. faecium CRL 183 and L. acidophilus CRL 1014) were submitted to preliminary tests to determine resistance to curing salt concentrations usually employed in fermented meat products and evaluation of antimicrobial substances production capacity by the spot-on-lawn technique. The quality of the sausages was evaluated by physical, chemical and microbiological analyzes at the beginning of processing and during periods of maturation and storage. Acceptance tests were performed every 30 days of storage, and a quantitative ... / Doutor