Tesis presentada a la Universidad de Chile
para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de
especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y
Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal producidos por
microorganismos, principalmente del dominio bacteria. Las bacteriocinas producidas por
bacterias Gram positivo o Gram negativo, presentan una actividad tóxica sobre especies
bacterianas estrechamente relacionadas con la bacteria productora. Para ejercer su acción
antimicrobiana las bacteriocinas utilizan receptores específicos localizados
exclusivamente en la bacteria blanco, por lo tanto raramente se observa actividad
citotóxica sobre células eucariontes. No obstante, algunas bacteriocinas inhiben
específicamente el crecimiento de líneas celulares neoplásicas.
Debido a estas propiedades, las bacteriocinas tienen una potencial aplicación
biotecnológica por su posible uso como alternativa a los tratamientos con antibióticos
tradicionales, o como nuevos antibióticos contra patógenos multirresistentes, como
preservantes o desinfectantes en la industria alimenticia, y en el área biomédica como
antineoplásicos para combatir algunos tipos de cáncer.
En nuestro laboratorio encontramos un nuevo compuesto antimicrobiano del tipo
bacteriocina producido por la cepa de Pseudomonas aeruginosa O400, al que hemos
denominado gicina A. Este compuesto es capaz de inhibir, selectivamente, el
crecimiento de bacterias Gram positivo. Debido a que no existen informes en la
literatura de bacteriocinas producidas por bacterias Gram negativo que presenten
actividad antimicrobiana solamente sobre bacterias Gram positivo, el estudio del
mecanismo de acción y las propiedades bioquímicas de gicina A constituye un valioso
aporte en la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas.
El objetivo general de esta tesis fue “Purificar, caracterizar bioquímicamente, y
evaluar tanto el mecanismo de acción antibacteriano de gicina A, como su toxicidad in vitro sobre líneas celulares eucariontes”. Para lograr este objetivo se realizó la
purificación de gicina A mediante cromatografías en columnas hidrofóbicas y HPLC.
Mediante electroforesis de proteínas y espectrometría de masas se determinó que esta
proteína tiene una masa molecular de 7925 Da.
La evaluación de sus propiedades bioquímicas demostró que la actividad de gicina A
es estable a un amplio rango de temperaturas, conserva su actividad al ser solubilizada
en una amplia gama de solventes y presenta una mayor actividad al ser solubilizada a un
pH neutro. Por otra parte empleado gicina A purificada se confirmó que esta posee una
actividad antibacteriana selectiva por bacterias Gram positivo.
Estudios de alteración de la cinética de crecimiento de la bacteria blanco y ensayos de
microscopía de fluorescencia indicaron que gicina A posee un efecto bactericida sobre
bacterias Gram positivo y que este efecto es producido por una permeabilización en la
membrana celular.
La evaluación de la citotoxicidad in vitro de gicina A sobre células eucariontes
mostró que esta bacteriocina ejerce una leve toxicidad en las líneas de origen tumoral,
sin embargo no se observó efecto citotóxico sobre las líneas celulares no tumorales. / Bacteriocins are antimicrobial peptides ribosomally synthesized produced by
microorganisms, mainly from Bacteria domain. Bacteriocins produced by Gram positive
or Gram negative bacteria, present a toxic activity on bacterial species closely related to
the bacteriocin producing bacteria. To exert its antimicrobial action, bacteriocins use
specific receptors exclusively located in the target bacteria, therefore rarely cytotoxic
activity on eukaryotic cells can be observed. However, some bacteriocins specifically
inhibit growth of neoplastic cell lines.
Because of these properties, bacteriocins have a potential for biotechnological
application for its possible use as an alternative to the traditional antibiotic treatments, or
as new antibiotics against multi-resistant pathogens, also as preservatives or
disinfectants in food industry, and in biomedical field as antineoplastics. In our
laboratory we have found a new antibacterial compound with bacteriocin properties
produced by the Pseudomonas aeruginosa O400 strain, which we called gicin A. This
compound is able to selectively inhibit the growth of Gram positive bacteria.
Because there are no reports in the literature of bacteriocins produced by Gram negative
bacteria that have antimicrobial activity only on Gram-positive bacteria, the study of the
mechanism of action and biochemical properties of gicin A is a very valuable
contribution to the search of new antimicrobial substances.
The overall aim of this thesis was to “Purify, characterize biochemically, and assess
both the antibacterial action mechanism of gicin A, and its in vitro toxicity on eukaryotic
cell lines”. To achieve this objective the purification of gicin A was performed by a
hydrophobic column chromatography and HPLC. Protein electrophoresis and mass spectrometry determined that this protein has a
molecular mass of 7925 Da. The evaluation of its biochemical properties showed that
the activity of gicin A is stable at a wide temperature range, it retains its activity when is
solubilized in a wide range of solvents and has a higher activity when is solubilized at a
neutral pH. Moreover, employing purified gicin A was confirmed that it has a selective
antibacterial activity against Gram positive bacteria.
Alteration studies of the growth kinetics of the target bacteria and fluorescence
microscopy indicated that gicin A has a bactericidal effect on Gram positive bacteria and
that this effect is produced by cell membrane permeabilization.
The evaluation of cytotoxicity in vitro of gicin A on eukaryotic cells shows that this
bacteriocin has a mild toxicity on tumoral origin cell lines, however we noticed no
cytotoxic effect on non tumoral origin cell lines.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/112039 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Ferrer Silva, Alonso Andrés |
| Contributors | Corsini, Gino, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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