Orientador: Marco Antonio Alves da Silva / Banca: Antonio Caliri / Banca: Alexandre Suman de Araújo / Banca: Sidney Jurado de Carvalho / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: Neste trabalho geramos configurações de proteínas desnaturadas utilizando o modelo de crescimento de cadeia nascente numa rede tetraédrica (ou de diamante) infinita e verificamos a influência das restrições estéricas (interação de esfera rígida) e das armadilhas topológicas no processo de crescimento e determinação estrutural ou conformacional das cadeias geradas. Os procedimentos, resultados, discussões e conclusões do atual estudo são expostos em três capítulos um tanto autosuficientes e descritos sucintamente abaixo. Uma análise comparativa entre SAWm1 e SAWm2 inicialmente pelas armadilhas topológicas através de três dentre quatro grandezas diferentes, mostram que SAWm1 é mais eficiente do que SAWm2, pois enquanto no primeiro a variação destas grandezas em função do número de resíduos tem ajustes logarítmicos, lineares e polinomiais quadráticos, no segundo são tipo log normal, polinomiais quadráticos e exponenciais, respectivamente. Por outro lado, quanto a compactação, não é possível identificar diferenças significativas nas conformações geradas pelos dois métodos. Pelo tempo de simulação, representado pelo tempo de CPU, em função do comprimento N das cadeias nascentes, novamente SAWm1 parece mais vantajoso sobre SAWm2, pois são ajustados por um polinômio de segunda ordem e crescimento exponencial, respectivamente. Portanto pelo menos para cadeias longas (N > 1000 resíduos) e pelas grandezas ~utilizadas, parece razoável propormos que o método de retificar armadilhas topológicas de SAWm1 possa substituir SAWm2, além disso agora conhecemos alguns comportamentos e limites dos dois métodos o que facilita implementações adicionais futuras em ambos. No primeiro capítulo estabelecemos as bases do atual trabalho, que é baseado em gerar conformações de proteínas desnaturadas por um algoritmo de crescimento de cadeia em rede... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work we generate configurations of denatured proteins using the growth model of nascent chain on the infinite tetrahedral (or diamond) lattice and ascertain the influence of the elf-sufficient and shortly described below. In the third chapter the full steric constrains (lr) are employed in association with two strategic approachs to analyze the implications of forbidden configurations, or topologic traps, in the chain compactness and simulation time. By , n the other hand SAWm2 method once encountered a topologic trap, in the residue n (with other four residues), a new chain is begun from the outset (of the forth residue). A comparative analysis between the SAWm2 initially by topologic traps through 3 out 4 different variables show that is more efficient than SAWm2, because while in the first the change of these variable on the chain length have logarithmic, linear and polynomial fit, in the second are log normal, polynomial and exponential ones, respectively. Though, as regards compactness is not possible to >~ steric constrains (hard-core interaction) and the topologic traps in the growth process and structural or conformational determination of the generated chains. The procedures, results, discussions and conclusions of the present study are displayed in three chapter rather s In the first chapter we establish the bases of the current work, that is focused on generate denatured proteins conformations by a diamond lattice chain growth algorithm with the residues linked by covalent bonds and interplaying only by steric constraints. For this aim we take up from global to specific features. To contextualize the chain growth model we begin from relation between DNA and RNA to the growth and protein synthesis; for diamond (or tetrahedral) lattice we start from crystalline structures and Bravais lattices to cubic ones; for the formation and interaction of the polymer... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréa Regina Baptista Rossit / Banca: Patrick Jack Spencer / Resumo: A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp's). A principal função das Hsp's é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Objetivos. Avaliar a formação óssea em defeitos ósseos criados em calvárias de coelhos, aplicando proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) carreadas pelo compósito carbonato de cálcio-colágeno. Analisar o percentual linear de contato osso- implante e o volume ósseo percentual no interio r das roscas de implantes de titânio, inseridos em alvéolos cirúrgicos, preparados em tíbias de coelho e preenchidos pelo compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado à BMPs. Material e métodos. Experimento I: Defeitos criados cirurgicamente em calvária de 45 coelhos (Oryctolagus cuniculus) brancos, raça Nova Zelândia, gênero masculino. Nos sítios teste, preencheu- se estes defeitos com rBMPs extraídas de ossos longos de renas (Rangifer tarandus) nadas ao compósito carbonato de cálcio-colágeno, tanto em forma granular quanto em forma de bloco. Nos sítios controle, preencheu-se os defeitos com osso autógeno (controle positivo), com as duas formas do compósito. O controle negativo não recebeu nenhum tipo de tratamento. Experimento II: Confeccionou-se alvéolos cirúrgicos nas tíbias de 30 coelhos. Previamente a inserção de implantes rosqueáveis de titânio, apresentando 3,75mm de diâmetro e 11,5mm de comprimento, preencheu-se os alvéolos dos sítios teste com compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado a rBMP. Preencheram-se os sítios controle com carbonato de cálcio-colágeno, colágeno e; no controle negativo nenhum tipo de material foi inserido. Resultados. Experimento I: Após os períodos de quatro, seis e dez semanas os animais foram submetidos à eutanásia. A BMP extraída de rena e combinada ao compósito carbonato de cálcio-colágeno promoveu osteogênese semelhante à obtida quando utilizado osso autógeno e superior aos controles de compósito e coágulo sangüíneo. A análise tomográfica apresentou um quadr o de resultados semelhantes aos obtidos com a histomorfometria, entretanto, superestimados para os períodos iniciais de observação, nos grupos que receberam enxerto do compósito. O compósito carbonato de cálciocolágeno isoladamente ou combinado a BMP não induziu reações inflamatórias desfavoráveis. Experimento II: A BMP extraída de rena e combinada ao compósito carbonato de cálcio-colágeno promoveu osteogênese superior aos controles do compósito, do colágeno e do coágulo sangüíneo, provendo à superfície do implante de titânio maior percentual de contato linear e maior volume percentual de osso no interior de suas roscas. Conclusões: O compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado a BMP extraída de rena possui capacidade osteogênica em sítios ortotópicos. A associação de materiais de enxerto contendo rBMPs a implantes de titânio aumenta a qualidade do contato osso-implante, permitindo possivelmente uma redução do tempo de espera entre a cirurgia de inserção de implantes e o tratamento reabilitador protético, nas situações de osso pouco denso e com espaços medulares amplos. / Objective. Study I:The aim of this study was to assess osteogenesis in cirurgically created skull defects in rabbits (Oryctolagus cuniculus) induced by bone morphogenetic proteins combined to the composite calcium carboante-collagen. Study II: Avaliate osteogenesis around titanium implants inserted in the rabbit tibia, induced by bone morphogenetic protein combined to the composite calcium carbonate-collagen. The parameters assessed were boneimplant interface and the bone volume between threads of titanium. Material and methods. Study I: Skull defects were cirurgically created in 45 New Zealand male white rabbits. Test sites were filled with 1,0mg of reindeer (Rangifer tarandus) rBMP combined to the composite calcium carbonate-collagen. Control sites received either autogenous bone (positive control), composite calcium carbonate-collagen or left untreated (negative control). Study II: Sixty titanium implants were inserted in the tíbia of 30 New Zealand male white rabbits. Previously to its insertion, teste sites were filled with 1,0mg of rBMP combined to the composite calcium carbonate-collagen. Control sites were filled either with composite calcium carbonatecollagen, collagen or left untreated. Results. Rabbits were submitted to euthanasia 4, 6 and 10 weeks after implantation. Study I: Histometric and tomographic analysis were perfomed. rBMP-calcium carbonate-collagen treated sites showed earlier and increased osteogenesis compared to control sites and similar results to autogenous bone. Tomographic scans showed similar pattern to histomorphometry, although overestimated for the composite groups at 4 and 6 weeks examination periods. Study II: Histometric analysis was performed. Test sites showed a percent linear bone-implant contact and percent bone volume at implant threads greater for all periods of examination than control sites. Conclusion: The results demonstrated that 1,0mg of rBMP combined to calcium carbonate-collagen composite were able enhance osteogenesis at orthotopic sites. Association of graft materials combined to rBMP increases quality at bone- implant interface Though the time between surgical implant placement and prosthetic rehabilitation at sites with large medular spaces and less cortical bone could be shortened.

Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-27Bitstream added on 2014-06-13T20:40:48Z : No. of bitstreams: 1 eller_l_dr_sjrp.pdf: 2336778 bytes, checksum: 3bd1f6ada9b4d5653ca2d251cd1ae685 (MD5) / Neste trabalho geramos configurações de proteínas desnaturadas utilizando o modelo de crescimento de cadeia nascente numa rede tetraédrica (ou de diamante) infinita e verificamos a influência das restrições estéricas (interação de esfera rígida) e das armadilhas topológicas no processo de crescimento e determinação estrutural ou conformacional das cadeias geradas. Os procedimentos, resultados, discussões e conclusões do atual estudo são expostos em três capítulos um tanto autosuficientes e descritos sucintamente abaixo. Uma análise comparativa entre SAWm1 e SAWm2 inicialmente pelas armadilhas topológicas através de três dentre quatro grandezas diferentes, mostram que SAWm1 é mais eficiente do que SAWm2, pois enquanto no primeiro a variação destas grandezas em função do número de resíduos tem ajustes logarítmicos, lineares e polinomiais quadráticos, no segundo são tipo log normal, polinomiais quadráticos e exponenciais, respectivamente. Por outro lado, quanto a compactação, não é possível identificar diferenças significativas nas conformações geradas pelos dois métodos. Pelo tempo de simulação, representado pelo tempo de CPU, em função do comprimento N das cadeias nascentes, novamente SAWm1 parece mais vantajoso sobre SAWm2, pois são ajustados por um polinômio de segunda ordem e crescimento exponencial, respectivamente. Portanto pelo menos para cadeias longas (N > 1000 resíduos) e pelas grandezas ~utilizadas, parece razoável propormos que o método de retificar armadilhas topológicas de SAWm1 possa substituir SAWm2, além disso agora conhecemos alguns comportamentos e limites dos dois métodos o que facilita implementações adicionais futuras em ambos. No primeiro capítulo estabelecemos as bases do atual trabalho, que é baseado em gerar conformações de proteínas desnaturadas por um algoritmo de crescimento de cadeia em rede... / In this work we generate configurations of denatured proteins using the growth model of nascent chain on the infinite tetrahedral (or diamond) lattice and ascertain the influence of the elf-sufficient and shortly described below. In the third chapter the full steric constrains (lr) are employed in association with two strategic approachs to analyze the implications of forbidden configurations, or topologic traps, in the chain compactness and simulation time. By , n the other hand SAWm2 method once encountered a topologic trap, in the residue n (with other four residues), a new chain is begun from the outset (of the forth residue). A comparative analysis between the SAWm2 initially by topologic traps through 3 out 4 different variables show that is more efficient than SAWm2, because while in the first the change of these variable on the chain length have logarithmic, linear and polynomial fit, in the second are log normal, polynomial and exponential ones, respectively. Though, as regards compactness is not possible to >~ steric constrains (hard-core interaction) and the topologic traps in the growth process and structural or conformational determination of the generated chains. The procedures, results, discussions and conclusions of the present study are displayed in three chapter rather s In the first chapter we establish the bases of the current work, that is focused on generate denatured proteins conformations by a diamond lattice chain growth algorithm with the residues linked by covalent bonds and interplaying only by steric constraints. For this aim we take up from global to specific features. To contextualize the chain growth model we begin from relation between DNA and RNA to the growth and protein synthesis; for diamond (or tetrahedral) lattice we start from crystalline structures and Bravais lattices to cubic ones; for the formation and interaction of the polymer... (Complete abstract click electronic access below)

Objetivos. Avaliar a formação óssea em defeitos ósseos criados em calvárias de coelhos, aplicando proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) carreadas pelo compósito carbonato de cálcio-colágeno. Analisar o percentual linear de contato osso- implante e o volume ósseo percentual no interio r das roscas de implantes de titânio, inseridos em alvéolos cirúrgicos, preparados em tíbias de coelho e preenchidos pelo compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado à BMPs. Material e métodos. Experimento I: Defeitos criados cirurgicamente em calvária de 45 coelhos (Oryctolagus cuniculus) brancos, raça Nova Zelândia, gênero masculino. Nos sítios teste, preencheu- se estes defeitos com rBMPs extraídas de ossos longos de renas (Rangifer tarandus) nadas ao compósito carbonato de cálcio-colágeno, tanto em forma granular quanto em forma de bloco. Nos sítios controle, preencheu-se os defeitos com osso autógeno (controle positivo), com as duas formas do compósito. O controle negativo não recebeu nenhum tipo de tratamento. Experimento II: Confeccionou-se alvéolos cirúrgicos nas tíbias de 30 coelhos. Previamente a inserção de implantes rosqueáveis de titânio, apresentando 3,75mm de diâmetro e 11,5mm de comprimento, preencheu-se os alvéolos dos sítios teste com compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado a rBMP. Preencheram-se os sítios controle com carbonato de cálcio-colágeno, colágeno e; no controle negativo nenhum tipo de material foi inserido. Resultados. Experimento I: Após os períodos de quatro, seis e dez semanas os animais foram submetidos à eutanásia. A BMP extraída de rena e combinada ao compósito carbonato de cálcio-colágeno promoveu osteogênese semelhante à obtida quando utilizado osso autógeno e superior aos controles de compósito e coágulo sangüíneo. A análise tomográfica apresentou um quadr o de resultados semelhantes aos obtidos com a histomorfometria, entretanto, superestimados para os períodos iniciais de observação, nos grupos que receberam enxerto do compósito. O compósito carbonato de cálciocolágeno isoladamente ou combinado a BMP não induziu reações inflamatórias desfavoráveis. Experimento II: A BMP extraída de rena e combinada ao compósito carbonato de cálcio-colágeno promoveu osteogênese superior aos controles do compósito, do colágeno e do coágulo sangüíneo, provendo à superfície do implante de titânio maior percentual de contato linear e maior volume percentual de osso no interior de suas roscas. Conclusões: O compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado a BMP extraída de rena possui capacidade osteogênica em sítios ortotópicos. A associação de materiais de enxerto contendo rBMPs a implantes de titânio aumenta a qualidade do contato osso-implante, permitindo possivelmente uma redução do tempo de espera entre a cirurgia de inserção de implantes e o tratamento reabilitador protético, nas situações de osso pouco denso e com espaços medulares amplos. / Objective. Study I:The aim of this study was to assess osteogenesis in cirurgically created skull defects in rabbits (Oryctolagus cuniculus) induced by bone morphogenetic proteins combined to the composite calcium carboante-collagen. Study II: Avaliate osteogenesis around titanium implants inserted in the rabbit tibia, induced by bone morphogenetic protein combined to the composite calcium carbonate-collagen. The parameters assessed were boneimplant interface and the bone volume between threads of titanium. Material and methods. Study I: Skull defects were cirurgically created in 45 New Zealand male white rabbits. Test sites were filled with 1,0mg of reindeer (Rangifer tarandus) rBMP combined to the composite calcium carbonate-collagen. Control sites received either autogenous bone (positive control), composite calcium carbonate-collagen or left untreated (negative control). Study II: Sixty titanium implants were inserted in the tíbia of 30 New Zealand male white rabbits. Previously to its insertion, teste sites were filled with 1,0mg of rBMP combined to the composite calcium carbonate-collagen. Control sites were filled either with composite calcium carbonatecollagen, collagen or left untreated. Results. Rabbits were submitted to euthanasia 4, 6 and 10 weeks after implantation. Study I: Histometric and tomographic analysis were perfomed. rBMP-calcium carbonate-collagen treated sites showed earlier and increased osteogenesis compared to control sites and similar results to autogenous bone. Tomographic scans showed similar pattern to histomorphometry, although overestimated for the composite groups at 4 and 6 weeks examination periods. Study II: Histometric analysis was performed. Test sites showed a percent linear bone-implant contact and percent bone volume at implant threads greater for all periods of examination than control sites. Conclusion: The results demonstrated that 1,0mg of rBMP combined to calcium carbonate-collagen composite were able enhance osteogenesis at orthotopic sites. Association of graft materials combined to rBMP increases quality at bone- implant interface Though the time between surgical implant placement and prosthetic rehabilitation at sites with large medular spaces and less cortical bone could be shortened.

Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.

Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.

Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.

Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.