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Simulação do enovelamento de proteínas desnaturadas utilizando o método de crescimento de cadeias em rede tetraédrica /

Eller, Lessandra. January 2010 (has links)
Orientador: Marco Antonio Alves da Silva / Banca: Antonio Caliri / Banca: Alexandre Suman de Araújo / Banca: Sidney Jurado de Carvalho / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: Neste trabalho geramos configurações de proteínas desnaturadas utilizando o modelo de crescimento de cadeia nascente numa rede tetraédrica (ou de diamante) infinita e verificamos a influência das restrições estéricas (interação de esfera rígida) e das armadilhas topológicas no processo de crescimento e determinação estrutural ou conformacional das cadeias geradas. Os procedimentos, resultados, discussões e conclusões do atual estudo são expostos em três capítulos um tanto autosuficientes e descritos sucintamente abaixo. Uma análise comparativa entre SAWm1 e SAWm2 inicialmente pelas armadilhas topológicas através de três dentre quatro grandezas diferentes, mostram que SAWm1 é mais eficiente do que SAWm2, pois enquanto no primeiro a variação destas grandezas em função do número de resíduos tem ajustes logarítmicos, lineares e polinomiais quadráticos, no segundo são tipo log normal, polinomiais quadráticos e exponenciais, respectivamente. Por outro lado, quanto a compactação, não é possível identificar diferenças significativas nas conformações geradas pelos dois métodos. Pelo tempo de simulação, representado pelo tempo de CPU, em função do comprimento N das cadeias nascentes, novamente SAWm1 parece mais vantajoso sobre SAWm2, pois são ajustados por um polinômio de segunda ordem e crescimento exponencial, respectivamente. Portanto pelo menos para cadeias longas (N > 1000 resíduos) e pelas grandezas ~utilizadas, parece razoável propormos que o método de retificar armadilhas topológicas de SAWm1 possa substituir SAWm2, além disso agora conhecemos alguns comportamentos e limites dos dois métodos o que facilita implementações adicionais futuras em ambos. No primeiro capítulo estabelecemos as bases do atual trabalho, que é baseado em gerar conformações de proteínas desnaturadas por um algoritmo de crescimento de cadeia em rede... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work we generate configurations of denatured proteins using the growth model of nascent chain on the infinite tetrahedral (or diamond) lattice and ascertain the influence of the elf-sufficient and shortly described below. In the third chapter the full steric constrains (lr) are employed in association with two strategic approachs to analyze the implications of forbidden configurations, or topologic traps, in the chain compactness and simulation time. By , n the other hand SAWm2 method once encountered a topologic trap, in the residue n (with other four residues), a new chain is begun from the outset (of the forth residue). A comparative analysis between the SAWm2 initially by topologic traps through 3 out 4 different variables show that is more efficient than SAWm2, because while in the first the change of these variable on the chain length have logarithmic, linear and polynomial fit, in the second are log normal, polynomial and exponential ones, respectively. Though, as regards compactness is not possible to >~ steric constrains (hard-core interaction) and the topologic traps in the growth process and structural or conformational determination of the generated chains. The procedures, results, discussions and conclusions of the present study are displayed in three chapter rather s In the first chapter we establish the bases of the current work, that is focused on generate denatured proteins conformations by a diamond lattice chain growth algorithm with the residues linked by covalent bonds and interplaying only by steric constraints. For this aim we take up from global to specific features. To contextualize the chain growth model we begin from relation between DNA and RNA to the growth and protein synthesis; for diamond (or tetrahedral) lattice we start from crystalline structures and Bravais lattices to cubic ones; for the formation and interaction of the polymer... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Expressão, purificação e estudos estruturais da chaperona molecular Hsp65 de Mycobacterium leprae & caracterização da proteína NUDEL - nuclear distribuition element-like /

Camargo, Flávia Barboza. January 2008 (has links)
Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréa Regina Baptista Rossit / Banca: Patrick Jack Spencer / Resumo: A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp's). A principal função das Hsp's é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Simulação do enovelamento de proteínas desnaturadas utilizando o método de crescimento de cadeias em rede tetraédrica

Eller, Lessandra [UNESP] 27 July 2010 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-27Bitstream added on 2014-06-13T20:40:48Z : No. of bitstreams: 1 eller_l_dr_sjrp.pdf: 2336778 bytes, checksum: 3bd1f6ada9b4d5653ca2d251cd1ae685 (MD5) / Neste trabalho geramos configurações de proteínas desnaturadas utilizando o modelo de crescimento de cadeia nascente numa rede tetraédrica (ou de diamante) infinita e verificamos a influência das restrições estéricas (interação de esfera rígida) e das armadilhas topológicas no processo de crescimento e determinação estrutural ou conformacional das cadeias geradas. Os procedimentos, resultados, discussões e conclusões do atual estudo são expostos em três capítulos um tanto autosuficientes e descritos sucintamente abaixo. Uma análise comparativa entre SAWm1 e SAWm2 inicialmente pelas armadilhas topológicas através de três dentre quatro grandezas diferentes, mostram que SAWm1 é mais eficiente do que SAWm2, pois enquanto no primeiro a variação destas grandezas em função do número de resíduos tem ajustes logarítmicos, lineares e polinomiais quadráticos, no segundo são tipo log normal, polinomiais quadráticos e exponenciais, respectivamente. Por outro lado, quanto a compactação, não é possível identificar diferenças significativas nas conformações geradas pelos dois métodos. Pelo tempo de simulação, representado pelo tempo de CPU, em função do comprimento N das cadeias nascentes, novamente SAWm1 parece mais vantajoso sobre SAWm2, pois são ajustados por um polinômio de segunda ordem e crescimento exponencial, respectivamente. Portanto pelo menos para cadeias longas (N > 1000 resíduos) e pelas grandezas ~utilizadas, parece razoável propormos que o método de retificar armadilhas topológicas de SAWm1 possa substituir SAWm2, além disso agora conhecemos alguns comportamentos e limites dos dois métodos o que facilita implementações adicionais futuras em ambos. No primeiro capítulo estabelecemos as bases do atual trabalho, que é baseado em gerar conformações de proteínas desnaturadas por um algoritmo de crescimento de cadeia em rede... / In this work we generate configurations of denatured proteins using the growth model of nascent chain on the infinite tetrahedral (or diamond) lattice and ascertain the influence of the elf-sufficient and shortly described below. In the third chapter the full steric constrains (lr) are employed in association with two strategic approachs to analyze the implications of forbidden configurations, or topologic traps, in the chain compactness and simulation time. By , n the other hand SAWm2 method once encountered a topologic trap, in the residue n (with other four residues), a new chain is begun from the outset (of the forth residue). A comparative analysis between the SAWm2 initially by topologic traps through 3 out 4 different variables show that is more efficient than SAWm2, because while in the first the change of these variable on the chain length have logarithmic, linear and polynomial fit, in the second are log normal, polynomial and exponential ones, respectively. Though, as regards compactness is not possible to >~ steric constrains (hard-core interaction) and the topologic traps in the growth process and structural or conformational determination of the generated chains. The procedures, results, discussions and conclusions of the present study are displayed in three chapter rather s In the first chapter we establish the bases of the current work, that is focused on generate denatured proteins conformations by a diamond lattice chain growth algorithm with the residues linked by covalent bonds and interplaying only by steric constraints. For this aim we take up from global to specific features. To contextualize the chain growth model we begin from relation between DNA and RNA to the growth and protein synthesis; for diamond (or tetrahedral) lattice we start from crystalline structures and Bravais lattices to cubic ones; for the formation and interaction of the polymer... (Complete abstract click electronic access below)
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Investigação de proteínas envolvidas na vulnerabilidade seletiva do hipocampo

Horn, Ana Paula January 2004 (has links)
Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.
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Influência das proteínas XIAP e Survivina na resistência de Gliomas

Lopez, Patrícia Luciana da Costa January 2012 (has links)
Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.
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Proteinograma do humor aquoso de cães (Canis familiares - Linnaeus, 1758) clinicamente saudáveis

Falcão, Mário Sérgio Almeida 05 December 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2010-06-14T19:52:21Z No. of bitstreams: 1 2008_MarioSergioAlmeidaFalcao.pdf: 864502 bytes, checksum: 3f289d82ea4925687527eef049a6d332 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-06-15T00:39:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MarioSergioAlmeidaFalcao.pdf: 864502 bytes, checksum: 3f289d82ea4925687527eef049a6d332 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-15T00:39:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MarioSergioAlmeidaFalcao.pdf: 864502 bytes, checksum: 3f289d82ea4925687527eef049a6d332 (MD5) Previous issue date: 2008-12-05 / Objetivou-se padronizar a técnica para detecção da concentração de proteína no humor aquoso pelos métodos de Bradford e Sensiprot®, estabelecer relação entre a concentração de proteínas plasmáticas e do humor aquoso, bem como determinar o proteinograma para este fluido em cães clinicamente saudáveis por meio de eletroforese unidimensional (SDS-PAGE) e coloração de nitrato de prata, mediante aprovação do Comitê de Ética da Universidade de Brasília (protocolo 66064/2007). Coletaram-se amostras do humor aquoso mediante paracentese da câmara anterior de ambos os olhos de 23 cães adultos, machos ou fêmeas, sem raça definida. A média da concentração protéica obtida pelo método de Bradford foi de 32,48 mg/dL (amplitude: 16,14 - 54,72) com erro padrão de ± 2,55 para o olho direito e 35,55 mg/dL (amplitude: 15,52 - 53,79) com erro padrão de ± 2,55 no olho esquerdo. O método do Sensiprot® apresentou valores de 9,04 mg/dL no olho direito (amplitude de 0,4 - 27,8) e 7,56mg/dL no olho esquerdo (1 - 18,9) e não se mostrou adequado para o objetivo proposto. Observou-se diferença estatística significativa (p<0,001) na comparação entre os testes. Resultados obtidos pelo método de Bradford representaram 0,5% do valor das proteínas plasmáticas, demonstrando linearidade dos dados. Através do marcador de massa molecular (190-15 Kda) utilizado para eletroforese unidimensional (SDS-PAGE), infere-se que as massas moleculares das proteínas presentes no humor aquoso de cães clinicamente saudáveis estão entre 120 e 25 Kda.
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Análise da expressão gênica da proteína homóloga à Scc1/Rad21 do complexo Coesina em Trypanosoma cruzi

Silva, Fabiana Brandão Alves 15 February 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-17T10:18:34Z No. of bitstreams: 1 2012_FabiansBrandaoAlvesSilva.pdf: 3339585 bytes, checksum: 3a2b291213f89307c5254e99ccac67ea (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-17T10:18:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_FabiansBrandaoAlvesSilva.pdf: 3339585 bytes, checksum: 3a2b291213f89307c5254e99ccac67ea (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-17T10:18:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_FabiansBrandaoAlvesSilva.pdf: 3339585 bytes, checksum: 3a2b291213f89307c5254e99ccac67ea (MD5) / O complexo Coesina tem a função essencial de assegurar a correta segregação das cromátides irmãs após replicação do DNA. A Coesina atua tanto na mitose como na meiose e é mais bem descrita em leveduras e mamíferos. O complexo se forma pela interação das subunidades proteicas conhecidas como SMC (proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos), SMC1 e SMC3, e duas proteínas SCC (proteínas de coesão das cromátides irmãs), a SCC1 (também conhecida como Mcd1 ou Rad21) e SCC3 (SA1 e SA2 em células de mamíferos). Existem poucos estudos sobre a Coesina e sua função em tripanossomatídeos, sendo que foi verificada a presença dos genes para todas as subunidades da Coesina em Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e a Leishmania major. Em trabalhos recentes do nosso grupo, foi observado que a subunidade SCC1 do complexo Coesina em T. cruzi está presente nas formas amastigotas com localização nuclear, em menor quantidade em epimastigotas distribuída por toda a célula e ausente em tripomastigotas. Desse modo, essa diferença da presença da proteína TcSCC1 nas diferentes formas do parasita nos levou a estudar nesse trabalho a expressão gênica dessa proteína de T. cruzi e sua regulação. Inicialmente, foi realizada uma quantificação relativa do mRNA da proteína SCC1 nas diferentes formas do T. cruzi por RT-PCR em tempo real. As formas amastigotas e tripomastigotas apresentaram uma quantidade relativa semelhante entre si e equivalente à metade da quantidade das formas epimastigotas, o que diverge do observado para a presença da proteína. Assim, é possível que haja um mecanismo regulatório provavelmente pós-transcricional, já que é descrito que esse tipo de regulação é peça chave na modulação da expressão gênica em T. cruzi. Nos experimentos onde foi inibido a transcrição e a transcrição juntamente com a tradução nas formas epimastigotas e amastigotas, observamos uma estabilidade do mRNA da TcSCC1 mais longa em amastigotas e pouco afetada com a inibição da tradução. Essa observação pode explicar a causa da maior abundância da proteína nas formas amastigotas. Embora em epimastigotas o mRNA também seja relativamente estável, a quantidade relativa decresce mais acentuadamente, sugerindo uma meia vida mais curta em epimastigotas. É provável que a regulação pós-transcricional desse mRNA possa estar modulando a expressão do gene TcSCC1 entre as formas do T. cruzi e essa não é dependente da tradução. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cohesin complex has the essential function of ensuring the correct segregation of sister chromatids after DNA replication. The cohesin acts both in mitosis as in meiosis and is best described in yeast and mammals. The complex is formed by the interaction of protein subunits known as SMC (structural maintenance of chromosomes), SMC1 and SMC3, and two proteins SCC (cohesion of sister chromatids), the SCC1 (also known as Mcd1 or Rad21) and SCC3 (SA1 and SA2 in mammalian cells). There are few studies of the cohesin and its function in trypanosomatids, and it was detected the presence of genes for all subunits of cohesin in Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major. In recent work from our group, we observed that the SCC1 subunit of cohesin complex in T. cruzi amastigotes is present with nuclear localization, in epimastigotes with a lesser amount distributed throughout the cell and absent in trypomastigotes. Thus, this difference of the presence of TcSCC1 protein in the different forms of the parasite led us to study in this work the gene expression of this T. cruzi protein and its regulation. Initially, we performed a relative quantification of TcSCC1 mRNA in the different forms of T. cruzi by real time RT-PCR. The amastigotes and trypomastigotes forms presented a relative similar amount among themselves and as equivalent to half the amount of the epimastigote forms, which differs of that observed for presence of the protein. Thus, there may be a possible post-transcriptional regulatory mechanism, since it is reported that this type of regulation is a key part in the modulation of T. cruzi gene expression. In experiments where transcription was inhibited and transcription along with translation in epimastigotes and amastigotes, we observed longer stability of TcSCC1 mRNA in amastigotes and is not affected by the inhibition of the translation. This observation may explain why the protein is more abundant in amastigotes. Although in epimastigotes the mRNA is also relatively stable, the relative amount decreases more markedly, suggesting shorter half life in epimastigotes. It is likely that post-transcriptional regulation of this mRNA may be modulating the TcSCC1gene expression between the forms of T. cruzi and that is not dependent on translation.
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Investigação de proteínas envolvidas na vulnerabilidade seletiva do hipocampo

Horn, Ana Paula January 2004 (has links)
Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.
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Influência das proteínas XIAP e Survivina na resistência de Gliomas

Lopez, Patrícia Luciana da Costa January 2012 (has links)
Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.
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Purificação e caracterização de preparações lectinicas da folha de Caesalpinia ferrea: avaliações biológicas

SILVA, Sandro do Nascimento 15 December 2009 (has links)
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Devido a essa característica principal elas Tem sido uma importante ferramenta da biotecnologia, sendo utilizada em diversos ramos da pesquisa. Lectinas da folha da Caesalpinia ferrea (CfeLL) foram purificadas e juntamente com seu extrato bruto (EB) foram caracterizados e avaliados quanto ao seu potencial analgésico, antiinflamatório e antitumoral utilizando camundongos fêmeas. A pesquisa partiu do interesse em explorar a C. ferrea, uma planta com muitas propriedades terapêuticas utilizada pela medicina popular. Inicialmente obteve-se o extrato bruto a 10% de solução em Tampão citrato fosfato 10mM pH 6,5. Com uma amostra do extrato foi feita cromatografia em coluna de quitina. CfeLL aglutinou eritrócitos de coelhos e de humanos e teve sua atividade inibida por glicoproteínas (fetuína e soro fetal bovino) e por carboidratos (N-acetil-Dglicosamina); manteve sua atividade hemaglutinante mesmo a 100º C; não apresentou variação de atividade em presença de íons (Ca²⁺ e Mg²⁺); nem em diferentes valores de pH (2,0 – 10,0). Os resultados in vivo revelaram que tanto o EB quanto CfeLL (50 mg/kg) reduziram em 43,45% e 41,12% o tamanho do tumor sólido sarcoma-180. As preparações também diminuíram em até 63% as contorções e estiramentos dos ratos tratados com EB (30mg/kg) e em até 53% dos ratos tratados com CfeLL (30 mg/kg). Na avaliação da atividade antiinflamatória apresenta inibição da inflamação em 48% dos animais quando tratados com EB (100mg/kg) e 46% quando tratados com CfeLL(100mg/kg). Os resultados portanto revelam que tanto o EB quanto a Lectina possuem afinidade por fetuina, soro fetal bovino e N-acetil-D-glicosamina. São termoestáveis e não se alteram em presença de íons e em diferentes valores de pH. Os testes com camundongos mostraram que EB e CfeLL possuem atividade antitumoral, analgésica e antiinflamatória, podendo ser comparados aos resultados de fármacos já utilizados. Dessa forma confirma-se a crença popular da utilização para tratamento de ulceras gástricas e como cicatrizante. / Lectins are proteins or glycoproteins that bind reversibly and specifically to carbohydrates. Because of this feature in the main they were an important tool have biotechnology and is used in various branches of research. Caesalpinia ferrea leaves lectins (CfeLL) were purified and with his crude extract (CE) were characterized and evaluated for their potential analgesic, anti-inflammatory and antitumor using female mice. The study started from the interest in exploring the C. ferrea, a plant with many therapeutic properties used by folk medicine. Initially it was obtained the crude extract to a 10% solution in 10 mM phosphate citrate buffer pH 6.5. With a sample of the extract was made column chromatography on chitin. CfeLL agglutinated erythrocytes of rabbits and humans and their activity was inhibited by glycoproteins (fetuin and fetal bovine serum) and carbohydrate (N-acetyl-D glucosamine); retained their hemagglutinating activity even at 100 º C; did not change activity in the presence of ions (Ca2 + and Mg2 +); or at different pH values (2.0 - 10.0). The results in vivo showed that both the EB and CfeLL (50 mg / kg) reduced by 43.45% and 41.12% the size of solid tumor sarcoma-180. The preparations also decreased by 63% in the twisting and stretching of rats treated with EB (30mg/kg) and up to 53% of mice treated with CfeLL (30 mg/kg). in evaluation of the anti-inflammatory activity showed inhibition of inflammation by 48% of the treated animals with EB (100mg/kg) and 46% when treated with CfeLL (100mg/kg). The results therefore show that both the EB and have a Lectin affinity for fetuin, fetal calf serum and N-acetyl-D-glucosamine. Are heat-stable and not change in the presence of ions and different pH values. Tests on mice showed that EB and CfeLL have antitumor activity, analgesic and anti-inflammatory, can be compared to the results of drugs already in use. Thus it is confirmed the popular belief of the use for treatment of gastric ulcers and as a healing.

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