Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (doctoral)--Lund University, 1992. / Added t.p. with thesis statement inserted.

Thesis (Ph. D.)--University of Rhode Island, 2004. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 97-102).

Thesis (doctoral)--Lund University, 1992. / Added t.p. with thesis statement inserted.

Gliomas correspondem à grande maioria de tumores do sistema nervoso central (SNC), sendo que os glioblastomas multiformes são os mais comuns e mais malignos. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente, pois a sobrevida média de pacientes com glioblastomas é de um ano após o diagnóstico. A ressecção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia são o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel cada vez maior, devido ao desenvolvimento de quimioterápicos mais seletivos e com menores efeitos prejudiciais. Um peptídeo que vem sendo bastante estudado como fator de crescimento em vários tipos de câncer é o peptídeo liberador de gastrina (GRP), que atua no seu receptor (GRPR). O GRP pertence à família de peptídeos semelhantes à bombesina, e tem sido mostrado que o GRPR é super-expresso em muitos tipos tumorais. Os agonistas de GRPR, GRP e bombesina, estimulam o crescimento de diferentes tipos de células tumorais. Os objetivos para este estudo foram avaliar a expressão de GRPR em gliomas, avaliar a influência da ativação e inibição do GRPR sobre o crescimento de células de glioma e avaliar o envolvimento de efetores atuantes na sinalização celular desencadeada por GRPR, como fosfatidilinositol-3-hidroxicinase, PI3K. Foi encontrada a expressão de RNA mensageiro de GRPR, pela reação da transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction) e a expressão ao nível protéico, por imuno-histoquímica, em linhagens de gliomas de rato (C6) e de humanos (U-87 e U373). O efeito sobre a proliferação celular do RC-3095, um antagonista de GRPR, foi analisado nestas linhagens. RC-3095 inibiu a proliferação celular 48 horas após o tratamento, nas linhagens U-87 e C6, mas não na linhagem U-373. A inibição sobre a proliferação foi de 45% em C6, na dose 0,1 µM, e de 24% e 26% em U-87 nas doses de 0,1 µM e 1,0 µM, respectivamente. Células quiescentes tratadas com bombesina proliferaram 50% a mais em relação ao controle. Esta indução na proliferação celular foi prevenida pelo antagonista de GRPR. Quando as células quiescentes foram pré-tratadas com inibidor de PI3K, LY294002, a bombesina não foi capaz de induzir proliferação, sendo, portanto, esta indução na proliferação dependente de PI3K. Depois da análise nas linhagens, foi avaliada a expressão de GRPR em material derivado de biópsias de 34 pacientes. GRPR esteve amplamente expresso em 100% destes tumores. Não foi encontrada expressão de GRPR em células gliais em amostras de necrópsias de cérebro de pacientes sem neoplasia, enquanto que a expressão de GRPR em neurônios humanos foi observada. A forte expressão de GRPR nestes 34 tumores não teve relação significativa com o grau tumoral ou com a sobrevida do paciente. Considerando a hipótese de que gliomas, assim como outros tumores, podem se originar de uma pequena população de células-tronco (CT) dentro do tumor, avaliamos o efeito da bombesina sobre esta população de células que em tumores do SNC, formam neuro-esferas. Bombesina aumentou em 100% o numero de neuro-esferas após sete dias ao tratamento em cultura de glioma (U-87). Adicionalmente, foi observado que os tumores de pacientes que expressam GRPR também apresentam uma sub-população de células expressando o marcador de CT, CD-113. Esses achados sugerem que o GRPR tenha função no desenvolvimento e manutenção de gliomas induzindo proliferação de células tronco e diferenciadas. O bloqueio de GRPR, assim como a combinação dele com a inibição de outros agentes associados ao GRPR na cascata de sinalização celular, podem servir como estratégia potencial no tratamento destes tumores. / Gliomas represent the vast majority of tumors of the central nervous system (CNS), and the glioblastoma multiform constitutes the most common and most malign one among them. The treatment of these tumors is still inefficient, the median survival of patients of only one year after the diagnosis. Surgical resection, when possible, radiotherapy and chemotherapy are the standard treatment. The trend is that chemotherapy will assume a more important role, due to the development of targeted agents with less side effects. The gastrin releasing peptide (GRP) is a peptide implicated in cancer progression. Belonging to the family of bombesin-like peptides, GRP and its receptor, GRPR, have been shown to be over-expressed in many tumor types, and GRP and bombesin stimulate growth of different cell types. The aims of this study were to evaluate the expression of GRPR in gliomas, the effects of GRPR activation and inhibition on cell growth, and the involvement of active signaling effectors triggered by GRPR such as phosphatidylinositol-3-hydroxikinase (PI3K). GRPR expression was found in rat (C6) and human (U87, U373) glioma cell lines, both as mRNA examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) as well as protein examined by immunohistochemistry. The effect of RC-3095, a GRPR antagonist, on cell proliferation was analyzed in these cell lines. RC-3095 inhibited cell proliferation in U-87 and C6, but not U- 373 cells, 48 hours after treatment. Proliferation was inhibited by 45% in C6 cells , at 0.1µM of RC-3095 and 24% and 26% in U-87 at doses of 0.1 µM and 1.0 µM, respectively. Quiescent cells treated with bombesin proliferated 50% more than untreated cells. This induction in cell proliferation was reversed by the antagonist of GRPR. When these quiescent cells were pre-treated with the PI3K inhibitor, LY294002, bombesin was not able to induce proliferation, indicating that that this proliferation is PI3K-dependent. The expression of GRPR was also evaluated in biopsy-derived cells from 34 patients of the Hospital of Clinics of Porto Alegre. GRPR was widely expressed in 100% of these tumors. This high expression was not found in samples from autopsies of brains of patients without cancer. In these samples, GRPR was expressed only in neurons, but not in glial cells. The strong expression of GRPR in 34 tumors showed have neither relationship with the tumor grade nor with the patient survival. Considering the growing hypothesis that gliomas and other tumors can be originated from a small population of stem cells within the tumor, was important to assess the effect of bombesin on this population of cells that, in tumors of the CNS, are neurospheres. Bombesin increased 100% the number of neuros peers seven days after the treatment. Additionally, was observed that the same tumors of patients that express GRPR also have a subpopulation of cells expressing stem cell marker, CD-113. These findings suggest that GRPR has a function in development and maintaince of gliomas inducing proliferation of stem and differentiated cells. The blockade of GRPR, as well as its combination it with the inhibition of other agent associated to the GRPR in the waterfall of cellular pathway signaling can serve like potential strategy in the treatment of these tumors.

Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.

Gliomas correspondem à grande maioria de tumores do sistema nervoso central (SNC), sendo que os glioblastomas multiformes são os mais comuns e mais malignos. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente, pois a sobrevida média de pacientes com glioblastomas é de um ano após o diagnóstico. A ressecção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia são o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel cada vez maior, devido ao desenvolvimento de quimioterápicos mais seletivos e com menores efeitos prejudiciais. Um peptídeo que vem sendo bastante estudado como fator de crescimento em vários tipos de câncer é o peptídeo liberador de gastrina (GRP), que atua no seu receptor (GRPR). O GRP pertence à família de peptídeos semelhantes à bombesina, e tem sido mostrado que o GRPR é super-expresso em muitos tipos tumorais. Os agonistas de GRPR, GRP e bombesina, estimulam o crescimento de diferentes tipos de células tumorais. Os objetivos para este estudo foram avaliar a expressão de GRPR em gliomas, avaliar a influência da ativação e inibição do GRPR sobre o crescimento de células de glioma e avaliar o envolvimento de efetores atuantes na sinalização celular desencadeada por GRPR, como fosfatidilinositol-3-hidroxicinase, PI3K. Foi encontrada a expressão de RNA mensageiro de GRPR, pela reação da transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction) e a expressão ao nível protéico, por imuno-histoquímica, em linhagens de gliomas de rato (C6) e de humanos (U-87 e U373). O efeito sobre a proliferação celular do RC-3095, um antagonista de GRPR, foi analisado nestas linhagens. RC-3095 inibiu a proliferação celular 48 horas após o tratamento, nas linhagens U-87 e C6, mas não na linhagem U-373. A inibição sobre a proliferação foi de 45% em C6, na dose 0,1 µM, e de 24% e 26% em U-87 nas doses de 0,1 µM e 1,0 µM, respectivamente. Células quiescentes tratadas com bombesina proliferaram 50% a mais em relação ao controle. Esta indução na proliferação celular foi prevenida pelo antagonista de GRPR. Quando as células quiescentes foram pré-tratadas com inibidor de PI3K, LY294002, a bombesina não foi capaz de induzir proliferação, sendo, portanto, esta indução na proliferação dependente de PI3K. Depois da análise nas linhagens, foi avaliada a expressão de GRPR em material derivado de biópsias de 34 pacientes. GRPR esteve amplamente expresso em 100% destes tumores. Não foi encontrada expressão de GRPR em células gliais em amostras de necrópsias de cérebro de pacientes sem neoplasia, enquanto que a expressão de GRPR em neurônios humanos foi observada. A forte expressão de GRPR nestes 34 tumores não teve relação significativa com o grau tumoral ou com a sobrevida do paciente. Considerando a hipótese de que gliomas, assim como outros tumores, podem se originar de uma pequena população de células-tronco (CT) dentro do tumor, avaliamos o efeito da bombesina sobre esta população de células que em tumores do SNC, formam neuro-esferas. Bombesina aumentou em 100% o numero de neuro-esferas após sete dias ao tratamento em cultura de glioma (U-87). Adicionalmente, foi observado que os tumores de pacientes que expressam GRPR também apresentam uma sub-população de células expressando o marcador de CT, CD-113. Esses achados sugerem que o GRPR tenha função no desenvolvimento e manutenção de gliomas induzindo proliferação de células tronco e diferenciadas. O bloqueio de GRPR, assim como a combinação dele com a inibição de outros agentes associados ao GRPR na cascata de sinalização celular, podem servir como estratégia potencial no tratamento destes tumores. / Gliomas represent the vast majority of tumors of the central nervous system (CNS), and the glioblastoma multiform constitutes the most common and most malign one among them. The treatment of these tumors is still inefficient, the median survival of patients of only one year after the diagnosis. Surgical resection, when possible, radiotherapy and chemotherapy are the standard treatment. The trend is that chemotherapy will assume a more important role, due to the development of targeted agents with less side effects. The gastrin releasing peptide (GRP) is a peptide implicated in cancer progression. Belonging to the family of bombesin-like peptides, GRP and its receptor, GRPR, have been shown to be over-expressed in many tumor types, and GRP and bombesin stimulate growth of different cell types. The aims of this study were to evaluate the expression of GRPR in gliomas, the effects of GRPR activation and inhibition on cell growth, and the involvement of active signaling effectors triggered by GRPR such as phosphatidylinositol-3-hydroxikinase (PI3K). GRPR expression was found in rat (C6) and human (U87, U373) glioma cell lines, both as mRNA examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) as well as protein examined by immunohistochemistry. The effect of RC-3095, a GRPR antagonist, on cell proliferation was analyzed in these cell lines. RC-3095 inhibited cell proliferation in U-87 and C6, but not U- 373 cells, 48 hours after treatment. Proliferation was inhibited by 45% in C6 cells , at 0.1µM of RC-3095 and 24% and 26% in U-87 at doses of 0.1 µM and 1.0 µM, respectively. Quiescent cells treated with bombesin proliferated 50% more than untreated cells. This induction in cell proliferation was reversed by the antagonist of GRPR. When these quiescent cells were pre-treated with the PI3K inhibitor, LY294002, bombesin was not able to induce proliferation, indicating that that this proliferation is PI3K-dependent. The expression of GRPR was also evaluated in biopsy-derived cells from 34 patients of the Hospital of Clinics of Porto Alegre. GRPR was widely expressed in 100% of these tumors. This high expression was not found in samples from autopsies of brains of patients without cancer. In these samples, GRPR was expressed only in neurons, but not in glial cells. The strong expression of GRPR in 34 tumors showed have neither relationship with the tumor grade nor with the patient survival. Considering the growing hypothesis that gliomas and other tumors can be originated from a small population of stem cells within the tumor, was important to assess the effect of bombesin on this population of cells that, in tumors of the CNS, are neurospheres. Bombesin increased 100% the number of neuros peers seven days after the treatment. Additionally, was observed that the same tumors of patients that express GRPR also have a subpopulation of cells expressing stem cell marker, CD-113. These findings suggest that GRPR has a function in development and maintaince of gliomas inducing proliferation of stem and differentiated cells. The blockade of GRPR, as well as its combination it with the inhibition of other agent associated to the GRPR in the waterfall of cellular pathway signaling can serve like potential strategy in the treatment of these tumors.

Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs. / Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.

Gliomas correspondem à grande maioria de tumores do sistema nervoso central (SNC), sendo que os glioblastomas multiformes são os mais comuns e mais malignos. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente, pois a sobrevida média de pacientes com glioblastomas é de um ano após o diagnóstico. A ressecção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia são o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel cada vez maior, devido ao desenvolvimento de quimioterápicos mais seletivos e com menores efeitos prejudiciais. Um peptídeo que vem sendo bastante estudado como fator de crescimento em vários tipos de câncer é o peptídeo liberador de gastrina (GRP), que atua no seu receptor (GRPR). O GRP pertence à família de peptídeos semelhantes à bombesina, e tem sido mostrado que o GRPR é super-expresso em muitos tipos tumorais. Os agonistas de GRPR, GRP e bombesina, estimulam o crescimento de diferentes tipos de células tumorais. Os objetivos para este estudo foram avaliar a expressão de GRPR em gliomas, avaliar a influência da ativação e inibição do GRPR sobre o crescimento de células de glioma e avaliar o envolvimento de efetores atuantes na sinalização celular desencadeada por GRPR, como fosfatidilinositol-3-hidroxicinase, PI3K. Foi encontrada a expressão de RNA mensageiro de GRPR, pela reação da transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction) e a expressão ao nível protéico, por imuno-histoquímica, em linhagens de gliomas de rato (C6) e de humanos (U-87 e U373). O efeito sobre a proliferação celular do RC-3095, um antagonista de GRPR, foi analisado nestas linhagens. RC-3095 inibiu a proliferação celular 48 horas após o tratamento, nas linhagens U-87 e C6, mas não na linhagem U-373. A inibição sobre a proliferação foi de 45% em C6, na dose 0,1 µM, e de 24% e 26% em U-87 nas doses de 0,1 µM e 1,0 µM, respectivamente. Células quiescentes tratadas com bombesina proliferaram 50% a mais em relação ao controle. Esta indução na proliferação celular foi prevenida pelo antagonista de GRPR. Quando as células quiescentes foram pré-tratadas com inibidor de PI3K, LY294002, a bombesina não foi capaz de induzir proliferação, sendo, portanto, esta indução na proliferação dependente de PI3K. Depois da análise nas linhagens, foi avaliada a expressão de GRPR em material derivado de biópsias de 34 pacientes. GRPR esteve amplamente expresso em 100% destes tumores. Não foi encontrada expressão de GRPR em células gliais em amostras de necrópsias de cérebro de pacientes sem neoplasia, enquanto que a expressão de GRPR em neurônios humanos foi observada. A forte expressão de GRPR nestes 34 tumores não teve relação significativa com o grau tumoral ou com a sobrevida do paciente. Considerando a hipótese de que gliomas, assim como outros tumores, podem se originar de uma pequena população de células-tronco (CT) dentro do tumor, avaliamos o efeito da bombesina sobre esta população de células que em tumores do SNC, formam neuro-esferas. Bombesina aumentou em 100% o numero de neuro-esferas após sete dias ao tratamento em cultura de glioma (U-87). Adicionalmente, foi observado que os tumores de pacientes que expressam GRPR também apresentam uma sub-população de células expressando o marcador de CT, CD-113. Esses achados sugerem que o GRPR tenha função no desenvolvimento e manutenção de gliomas induzindo proliferação de células tronco e diferenciadas. O bloqueio de GRPR, assim como a combinação dele com a inibição de outros agentes associados ao GRPR na cascata de sinalização celular, podem servir como estratégia potencial no tratamento destes tumores. / Gliomas represent the vast majority of tumors of the central nervous system (CNS), and the glioblastoma multiform constitutes the most common and most malign one among them. The treatment of these tumors is still inefficient, the median survival of patients of only one year after the diagnosis. Surgical resection, when possible, radiotherapy and chemotherapy are the standard treatment. The trend is that chemotherapy will assume a more important role, due to the development of targeted agents with less side effects. The gastrin releasing peptide (GRP) is a peptide implicated in cancer progression. Belonging to the family of bombesin-like peptides, GRP and its receptor, GRPR, have been shown to be over-expressed in many tumor types, and GRP and bombesin stimulate growth of different cell types. The aims of this study were to evaluate the expression of GRPR in gliomas, the effects of GRPR activation and inhibition on cell growth, and the involvement of active signaling effectors triggered by GRPR such as phosphatidylinositol-3-hydroxikinase (PI3K). GRPR expression was found in rat (C6) and human (U87, U373) glioma cell lines, both as mRNA examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) as well as protein examined by immunohistochemistry. The effect of RC-3095, a GRPR antagonist, on cell proliferation was analyzed in these cell lines. RC-3095 inhibited cell proliferation in U-87 and C6, but not U- 373 cells, 48 hours after treatment. Proliferation was inhibited by 45% in C6 cells , at 0.1µM of RC-3095 and 24% and 26% in U-87 at doses of 0.1 µM and 1.0 µM, respectively. Quiescent cells treated with bombesin proliferated 50% more than untreated cells. This induction in cell proliferation was reversed by the antagonist of GRPR. When these quiescent cells were pre-treated with the PI3K inhibitor, LY294002, bombesin was not able to induce proliferation, indicating that that this proliferation is PI3K-dependent. The expression of GRPR was also evaluated in biopsy-derived cells from 34 patients of the Hospital of Clinics of Porto Alegre. GRPR was widely expressed in 100% of these tumors. This high expression was not found in samples from autopsies of brains of patients without cancer. In these samples, GRPR was expressed only in neurons, but not in glial cells. The strong expression of GRPR in 34 tumors showed have neither relationship with the tumor grade nor with the patient survival. Considering the growing hypothesis that gliomas and other tumors can be originated from a small population of stem cells within the tumor, was important to assess the effect of bombesin on this population of cells that, in tumors of the CNS, are neurospheres. Bombesin increased 100% the number of neuros peers seven days after the treatment. Additionally, was observed that the same tumors of patients that express GRPR also have a subpopulation of cells expressing stem cell marker, CD-113. These findings suggest that GRPR has a function in development and maintaince of gliomas inducing proliferation of stem and differentiated cells. The blockade of GRPR, as well as its combination it with the inhibition of other agent associated to the GRPR in the waterfall of cellular pathway signaling can serve like potential strategy in the treatment of these tumors.