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Los gliomas anaplásicos (grado III de la OMS) son gliomas infiltrativos y malignos que afectan fundamentalmente a pacientes adultos, y cuyo comportamiento y evolución clínica son especialmente heterogéneos. El avance en el conocimiento de la biología molecular acontecido en los últimos años, ha permitido demostrar que muchas de las variables clínicas, radiológicas o histológicas clásicas pierden su valor pronóstico si se analizan conjuntamente con los nuevos factores moleculares. En la primera parte de la presente tesis se analizó el valor pronóstico de la expresión inmunohistoquímica de la proteína O6-Metilguanina ADN-metiltransferasa (MGMT) y de la metilación del promotor del gen (MGMT) en una serie homogénea de pacientes con diagnóstico de glioma anaplásico, tratados de acuerdo a un protocolo preestablecido común. La ausencia de inmunoexpresión de MGMT resultó factor pronóstico independiente de supervivencia global en aquellos pacientes que recibieron tratamiento quimioterápico. Sin embargo, el estado de metilación del promotor determinado mediante PCR específica de metilación (MSP) no demostró influencia pronóstica. Contrariamente a lo esperado, los resultados de la serie estudiada no corroboraron la existencia de una buena correlación entre los datos de la inmunohistoquímica y los de la MSP, es decir, no se halló una asociación firme entre la presencia de metilación del promotor del gen y la ausencia de expresión de la proteína. Por ello, en la segunda parte de la tesis se realizó una Revisión Sistemática y un Meta-análisis sobre la precisión diagnóstica de la inmunohistoquímica como técnica de estudio y valoración de MGMT. Los resultados del mismo parecen confirmar la hipótesis de que el grado de expresión de MGMT no siempre refleja el estado de metilación del promotor y a la inversa. Por ello ambos métodos diagnósticos no deben considerarse como intercambiables, ni emplearse indistintamente en la práctica clínica diaria ya que no seleccionan el mismo subgrupo de pacientes. La tercera parte de la tesis se centró en el subgrupo de gliomas anaplásicos con componente oligodendroglial (oligodendrogliomas anaplásicos y oligoastrocitomas anaplásicos). En ella se analizó la heterogeneidad regional de los parámetros moleculares valorando la asociación entre el perfil genético de los tumores y determinadas características radiológicas. La pérdida de heterocigosidad de 1p, 19q y 1p19q se hallaron fuertemente asociadas a la localización frontal de los tumores. Aunque las pruebas de neuroimagen nunca reemplazarán al análisis histológico, la identificación de aspectos clínicos o características radiológicas que se asocien a determinados aspectos moleculares puede resultar de enorme utilidad en la práctica clínica diaria. El objetivo fundamental de clasificar los gliomas es definir subgrupos de pacientes con un pronóstico similar. Para alcanzar este objetivo además del análisis histológico e inmunohistoquímico convencionales, el estudio genético-molecular proporciona información muy valiosa. Los esfuerzos deben por tanto dirigirse hacia la utilización combinada de todos los recursos disponibles en nuestro entorno. / Anaplastic gliomas (WHO grade III) constitute a heterogeneous group of tumors with different therapeutic responses to alkylating agents. O6-Methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) is one of the implicated factors in glioma chemoresistance. The prognostic value of MGMT remains controversial due to the fact that previous published studies included heterogeneous groups of patients. The aim of the first part of our study was to evaluate the prognostic significance of MGMT in patients with anaplastic glioma. Patients were analyzed for MGMT protein expression by immunohistochemistry (IHC) and MGMT promoter methylation profile by Methylation-specific polymerase chain reaction (MSP). MGMT prognostic significance was evaluated together with other well-known prognostic factors. The absence of MGMT expression was independently associated with better survival in those patients who received chemotherapy, suggesting that the absence of MGMT expression is a positive predictive marker in these patients. Agreement on the best and most reliable technique for evaluating MGMT status remains unsettled. MSP is the most commonly used method for promoter methylation study, while IHC has become the most frequently used for the detection of MGMT protein expression. The aim of the second part of our study was to perform a systematic review and meta-analysis of the correlation between IHC and MSP. A computer-aided search was performed for relevant publications. Methodological quality was assessed by the QUADAS and STARD instruments, and previously published guidelines were followed. Our results showed that protein expression assessed by IHC alone fails to reflect promoter methylation status. Type of tumour (primary brain tumour vs others) was an independent covariate of accuracy estimates in the meta-regression analysis beyond the cut-off value. In attempts at clinical diagnosis the two methods seem to select different groups of patients and should not be used interchangeably. In the third part of our study 1p19q loss of heterozygosity in oligodendroglial tumors was studied. The aim was to confirm the existence of molecular heterogeneity in relation to their anatomic distribution, to evaluate the correlation between the molecular profile and other radiological or clinical characteristics and their prognostic impact. Preoperative magnetic resonance images were reviewed by two independent neuroradiologists, blinded to clinical and molecular information. LOH analysis was assessed from paired tumor-blood DNA samples. Our results showed that LOH1p, LOH19q and LOH1p19q were more frequent in tumors located in the frontal lobe. Frontal location, ring enhancement and extent of resection resulted independent prognostic factors for overall survival in the multivariate analysis. The evaluation of some MR features may be useful. Efforts must be directed toward the use of every available resource at each institution.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2005. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Division of Experimental Medicine. Title from title page of PDF (viewed 2008/01/11). Includes bibliographical references.

Inaugural dissertation.--K. bayer. Julius-Maximilians-Universität Würzburg.

Inaugural dissertation.--Universität Greifswald, 1900.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Alterações no sistema purinérgico podem estar envolvidas na progressão dos gliomas. O ATP induz a proliferação celular dos gliomas e, ao contrário dos astrócitos, gliomas apresentam baixa expressão das E-NTPDases, particularmente da NTPDase2. Assim, a restauração da atividade ATPásica nesses tumores poderia ser uma estratégia para prevenir as ações mediadas pelo ATP. De acordo com essa idéia, a coinjeção de apirase/NTPDase1, uma enzima depletora de ATP, e gliomas diminuiu a progressão tumoral in vivo. O objetivo desse estudo foi aprofundar a participação dos receptores purinérgicos e das E-NTPDases na progressão dos gliomas. A análise das culturas de linhagem de glioma C6 e de C6 ex vivo revelou similaridade na expressão de receptores purinérgicos e das E-NTPDases, sugerindo que alterações nessa via estariam presentes em culturas primárias de gliomas. Ao contrário do esperado, o restabelecimento da expressão da NTPDase2 nos gliomas resultou em aumento da malignidade tumoral. A superexpressão da NTPDase2 aumentou a adesão das células C6 em cultura e em experimentos in vivo promoveu dramático aumento do crescimento tumoral e presença de alterações histológicas nos pulmões sugestivas de metástase. Esses eventos foram relacionados ao acúmulo de ADP extracelular, recrutamento de plaquetas para a área tumoral e pulmonar, aumento de angiogênese e da resposta inflamatória, denotado pela presença de infiltrado leucocitário nos gliomas e aumento sérico das citocinas IL-1 , TNF-a e IL-6. Além disso, os receptores purinérgicos modularam a secreção espontânea e estimulada por TLR de IL-8 e MCP-1, bem como a proliferação celular induzida por LPS em linhagem de glioma humano. Finalmente, a análise da expressão das ectonucleotidases em gliomas de ratos e de humanos revelou ausência das NTPDase1 e 2, baixa expressão da NTPDase3 e expressão elevada da ecto-5´-NT/CD73, indicando que a alteração no padrão de expressão das ectonucleotidases também é uma característica de tumores humanos. Os resultados dessa tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico na progressão dos gliomas e sugerem esse sistema como um alvo interessante no combate dos tumores cerebrais. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´-NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. Disruption on purinergic signaling has been involved in glioma progression. ATP induces glioma cell proliferation and, in opposite to astrocytes, gliomas have low expression of all NTPDases, particularly NTPDase2. Therefore, the restoration of the ATPase activity to gliomas could be a strategy to overcome the ATP mediated effects. Accordingly, the co-injection of apyrase/NTPDase1, an ATP scavenger, with gliomas decreases the glioma progression in vivo. The objective of this study was to better evaluate the purinergic receptor and E-NTPDase participation on glioma progression. The analysis of C6 cell line and C6 ex vivo cultures revealed similarity in the purinergic receptor and E-NTPDase expression, suggesting that disruption in the purinergic pathway is a characteristic exhibited by primary glioma cell cultures. Surprisingly, the NTPDase2 restoration to C6 gliomas resulted in increased tumor malignity. The NTPDase2 overexpression increased the C6 cell adhesion in culture and in in vivo experiments it promoted dramatic glioma growth and induced histological alterations in lung tissue suggestive of metastasis. These events were related to extracellular ADP accumulation, platelets recruitment to glioma and lung tissues, increase of angiogenesis and inflammation. Additionally, it was observed an increase of leukocyte infiltration in the implanted tumors and in IL-1 , TNF-a e IL-6 serum levels. Moreover, the purinergic receptors modulated the basal and TLR stimulated IL-8 and MCP-1 release and the LPS induced cell proliferation in a human glioma cell line. Finally, the analysis of ectonucleotidases expression in rat and human gliomas showed the absence of NTPDase1 and 2, low expression of NTPDase3 and high expression of ecto-5´-NT/CD73, indicating that alterations in the ectonucleotidase expression pattern is a characteristic also exhibited by human tumors. In conclusion, these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to this pathway as an interesting target for glioma treatment.

O nucleotídeo de purina ATP, no meio extracelular, participa de diversos processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação/constrição, proliferação, diferenciação, modulação sináptica, dor, inflamação e morte celular. Entre os receptores purinérgicos, o subtipo P2X7 é bem descrito como mediador de processos inflamatórios pela liberação de IL-1β e de morte celular com ativação de caspases. Evidências na literatura apontam para o envolvimento do sistema purinérgico no crescimento e na progressão de glioblastomas. Esses tumores são os mais comuns do SNC e seu alto grau de malignidade deve-se à capacidade de rápida proliferação e invasão no tecido sadio. Considerando a resistência que os glioblastomas apresentam à morte celular induzida por ATP, o objetivo desse trabalho foi investigar a expressão e funcionalidade do receptor citotóxico P2X7 em linhagens de gliomas e suas implicações na biologia tumoral. Entre as linhagens de glioblastomas estudadas, a linhagem de camundongo GL261 apresentou sensibilidade à morte induzida por ATP pela liberação de LDH, incorporação de iodeto de propídio e diminuição da viabilidade mitocondrial. O ATP foi tóxico em concentrações acima de 2 mM, o BzATP foi mais potente que o ATP e o antagonista oATP bloqueou completamente a morte celular. O silenciamento do receptor P2X7, na GL261, por RNA de interferência, também aboliu a morte celular induzida por ATP confirmando o envolvimento desse receptor, embora a formação de poro ainda tenha sido visível nestas células, ainda que diminuída. A morte celular apresentou características necróticas como a ruptura de membrana, a falta de ativação de caspases e a falta de externalização de fosfatidilserina, mas ao mesmo tempo houve encolhimento celular. Além dos efeitos mediados pela sua ativação, o silenciamento do receptor P2X7 na linhagem GL261 diminuiu a adesão e promoveu a migração celular, características de tumores mais invasivos. Em amostras de pacientes com gliomas, foi possível observar que a expressão de P2X7 correlaciona diretamente com a sobrevida dos pacientes. Juntamente com os dados da linhagem silenciada para o P2X7, é possível apontar o receptor P2X7 como uma possível molécula anti-tumoral, cuja redução na expressão diminui a adesão, aumenta a migração, torna a célula resistente à morte induzida por ATP, possivelmente diminuindo, desta forma, a sobrevida de pacientes acometidos por esta doença. / Purines nucleotides, particularly extracellular ATP, participate in diverse physiological and pathological processes such as vasodilatation/constriction, cell proliferation, differentiation, synaptic modulation, inflammation, pain sensation and cell death. Among purinergic receptors, the P2X7 subtype is well described as a mediator of inflammatory processes via IL-1β release and cellular death induced by caspases activation. Evidences in the literature point to the purinergic system involvement in growth and glioblastoma progression. These tumors are the most common in the central nervous system (CNS) and their high grade of malignance is the result of rapid proliferation and invasion abilities. Considering the resistance that glioblastomas show to ATP-induced cell death, the objective of this work was to investigate the expression and function of cytotoxic P2X7 receptor in glioma cell lines and their implications in tumor biology. Among the glioma cell lines, the mouse GL261 was sensitive to ATP-induced cell death with LDH release, iodide incorporation and a decrease in mitochondrial viability. ATP was toxic in concentrations above 2 mM, BzATP was more potent than ATP and the antagonist oATP blocked completely the cell death induced by ATP. P2X7 receptor silencing in GL261 by RNA interference, also abolished ATP-induced cell death, confirming this receptor involvement, although a diminished pore induction was observed. Cellular death had necrotic features like membrane rupture, lack of caspase activation and lack of phosphatidylserine exposure, but at the same time shrinking also occurs. Beyond its activation effects, P2X7 knockdown in GL261 decreased cell adhesion and promoted migration, features common to more invasive tumors. In human glioma samples, P2X7 receptor expression correlated directly with patients‟ survival. Together with data from P2X7-knocked down cell line, it is possible to suggest the P2X7 receptor as an anti-tumoral molecule, whose expression reduction leads to decreased adhesion, increased cell mobility, resistance to ATP-induced cell death, and therefore, decreased patients survival.