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Efecto de la carencia de polifosfatos inorgánicos en la expresión global de proteínas y en los determinantes de resistencia a cobre en el arqueón sulfolobus solfataricus

Soto Vergara, Daniela Fernanda January 2012 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / Mientras los mecanismos de resistencia al cobre han sido ampliamente estudiados en bacterias, se tiene escasa información sobre los mecanismos de resistencia al cobre en arqueas. Recientemente se ha identificado un grupo de genes (cop) de resistencia al cobre, altamente conservado en las arqueas del orden Sulfolobales. Este grupo de genes incluye un regulador transcripcional específico de arqueas (copR), una metalochaperona de cobre (copT) y un transportador de cationes ATPasa tipo P (copA). Otro posible mecanismo de resistencia al cobre en Sulfolobales comprendería a los polifosfatos (poliP). Los poliP son moléculas lineales presentes en todos los seres vivos y que cumplen diversas funciones celulares. El modelo que vincula los poliP con la resistencia a cobre propone una disminución de poliP mediada por la exopolifosfatasa (PPX), enzima que degradaría el gran polímero hasta fosfato inorgánico (Pi), el cual podría unirse a cobre para ser finalmente expulsado hacia el periplasma o al medio extracelular por transportadores específicos. Recientemente nuestro laboratorio ha logrado generar una cepa de Sulfolobus solfataricus recombinante con niveles deficientes de poliP, con el fin de evaluar el efecto de su carencia en distintos fenómenos, entre ellos la resistencia a cobre. Basados en estudios transcripcionales realizados mediante la técnica PCR en tiempo real, determinamos que la inducción de la expresión de copA en respuesta a cobre ocurre más tempranamente en células carentes de poliP, comparadas con células que poseen este polímero. Una explicación a este fenómeno sería que en ausencia de poliP, el modelo que vincula los poliP con el eflujo de cobre no sería operativo. En consecuencia, el sistema cop debería ser activado más tempranamente para compensar la carencia de poliP. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento que se tiene sobre los poliP y su relación con la resistencia a cobre en S. solfataricus, analizamos la expresión diferencial de proteínas en células carentes de poliP y en células expuestas a cobre. De esta forma, mediante la técnica de proteómica cuantitativa ICPL determinamos que en carencia de poliP las células de S. solfataricus sobreexpresaron proteínas involucradas en la degradación de glucógeno y ácidos grasos, junto a aquellas que remueven especies reactivas del oxígeno (ROS). Por otro lado, algunas de las proteínas que disminuyeron sus niveles en carencia de poliP están involucradas en la gluconeogénesis y el ciclo del glioxilato. Estos resultados en conjunto, sugieren que los poliP podrían desempeñar un papel energético en S. solfataricus, ya que al parecer, en su ausencia se favorecen las vías catabólicas. La sobreexpresión de proteínas que remueven ROS sugiere un mayor estado de estrés oxidativo en las células S. solfataricus poliP-. Adicionalmente, los experimentos de proteómica cuantitativa nos permitieron determinar que en presencia de cobre, las células de S. solfataricus poliP+ sobreexpresan proteínas involucradas en el ciclo del TCA, en la degradación y plegamiento de proteínas, la reparación del ADN y en la degradación del ARN. Estos resultados sugieren que la presencia de cobre podría provocar daño a tanto a nivel de proteínas, como de ácidos nucleicos en las células de S. solfataricus. El aumento en los niveles de algunas proteínas involucradas en el ciclo del TCA puede relacionarse con el ATP y el poder reductor que las células necesitan para enfrentar una situación de estrés (ej: proteólisis, plegamiento de proteínas). Finalmente, las células carentes de poliP y expuestas a cobre aumentaron los niveles de algunas proteasas, de proteínas que forman parte de la cadena transportadora de electrones y de proteínas que participan en la remoción de ROS, como la peroxiredoxina y la superóxido dismutasa (SOD). Si bien la peroxiredoxina se aumentó sus niveles en todas las condiciones de estudio, la SOD sólo lo hizo cuando las células de S. solfataricus carentes de poliP, fueron expuestas a cobre. En conjunto estos resultados sugieren un mayor nivel de estrés oxidativo en las células S. solfataricus poliP- expuestas a cobre y un papel energético de los poliP. Dentro de las proteínas que disminuyeron sus niveles, encontramos proteínas ribosomales. Esto podría incidir directamente en la síntesis proteica, disminuyendo la capacidad de las células de S. solfataricus poliP- de hacer frente a una situación de estrés / While copper resistance mechanisms have been widely studied in bacteria, there is little information about copper resistance mechanisms of Archaea. Recently, a highly conserved group of genes (cop) related to the resistance to copper was identified in some species of Sulfolobales. This group of genes consists of an archaeal-specific transcriptional regulator (copR), a putative metallochaperone (copT) and a P-type cation-transporting ATPase (copA). Another potential mechanism involved in copper resistance of Sulfolobales would involve inorganic polyphosphates (polyP). PolyP is a linear polymer present in all organisms and performs a wide variety of functions. The model that links polyP with resistance to copper suggests that the exopolyphosphatase (PPX) mediates the degradation of polyP to inorganic phosphate (Pi) which could eventually join copper and be finally ejected to the periplasm or to the extracellular medium by specific transporters. Recently, our laboratory has generated a recombinant Sulfolobus solfataricus strain deficient in polyP levels, in order to evaluate the role of its deficiency in various phenomena, including copper resistance. Based on transcriptional studies carried out through real-time PCR, we determined that the induction of the expression of copA in response to copper occurs earlier in cells lacking polyP, than those possessing the polymer. One explanation for this phenomenon could be that, in the absence of polyP, the model linking polyP to copper efflux would not be operational. As a consequence, the cop system should be activated earlier to compensate for the lack of polyP. To gain insight into polyP and its relationship to copper resistance in S. solfataricus, we studied the differential expression of proteins in cells lacking polyP and in cells exposed to copper. Thus, quantitative proteomics studies (ICPL) showed that in the absence of polyP S. solfataricus cells overexpresses proteins involved in: the degradation of glycogen and fatty acids, and in the removal of reactive oxygen species (ROS). On the other hand, some of the proteins that decreased their levels are involved in gluconeogenesis and the glyoxylate cycle. These results suggest that polyP could play an energetic role in the cell considering that the lack of this polymer, upregulated proteins involved in catabolic pathaways. The upregulation of proteins involved in removal of ROS suggests the presence of a higher level of oxidative stress in S.solfataricus poliP- cells. Further, ICPL experimentas allowed us to determine that in the presence of copper, S. solfataricus polyP+ cells overexpress proteins involved in: the TCA cycle, the degradation and folding of proteins, DNA repairing, and in RNA degradation. These results suggest that the presence of copper could cause damage to both proteins and nucleic acids from S. solfataricus cells. The up-regulation of some TCA proteins could be related with the ATP levels and reducing power that cells need to face a stress situation (e.g. proteolysis, folding of proteins). Finally, when cells lacking polyP were exposed to copper, there was an overexpression of proteases, electron transport chain proteins, and proteins involved in ROS removal (peroxiredoxin and SOD). Although peroxiredoxin was overexpress in all our study conditions, SOD was only up-regulated when S. solfataricus polyP- cells were exposing to copper. These findings may reflect a higher oxidative stress in cells lacking polyP and also suggest an energetic role of polyP. Some of the proteins that decreased their levels were ribosomal proteins. This could directly affect protein synthesis and therefor the ability of S. solfataricus polyP- cells to respond to a stressing situation
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Purificación de L-Ficolina del sistema del complemento humano

Vallejos Silva, Gerardo Raúl January 2016 (has links)
Memoria para la obtención de Título de Bioquímico / En esta Memoria de Título se purificó L-Ficolina humana. A nivel nacional, no hay esfuerzos reportados en este sentido. Esta purificación se realiza en el contexto de los intereses de una de las líneas centrales de investigación del Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile), relacionada con el rol del Sistema del Complemento humano en la infectividad de Trypanosoma cruzi, agente protozoario de la enfermedad de Chagas. Aunque con un rendimiento moderado, se logró la purificación de L-Ficolina recombinante, a través de cromatografía. Se sienta así la estandarización del protocolo en las condiciones locales, el que deberá ser escalado para cubrir las necesidades de futuros experimentos de infectividad parasitaria, a realizarse ya fuera del contexto de esta Memoria / In this dissertation, we describe the purification of human Complement L-Ficolin. At the national level, there are no reported efforts in this regard. This purification was performed within the context of the interests of one of the central lines of research in our laboratory, related to the role of the Complement System in Trypanosome cruzi (the agent of Chagas disease) infectivity. Although with a modest yield, chromatographic purification of L-Ficolin was achieved. Thus, we established the experimental basic conditions for the purification of this rather elusive molecule. Outside the context of this dissertation, this procedure, adequately scaled, may meet the needs of future experiments on parasite infectivity, mediated by this molecule / Conicyt; Fondecyt
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Implicancias farmacéuticas de la conjugación de péptidos a nanopartículas de oro : efectos sobre la interacción con proteínas plasmáticas, la estabilidad, la toxicidad y la biodistribución

Guerrero Rivera, Simón Juan January 2013 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Ciencias Farmacéuticas / Al exponer diferentes Nanomateriales (NM) al plasma sanguíneo estos son reconocidos por biomoléculas, formándose una nano-bio interface denominada corona de proteínas (CP), en la que se observan interacciones dinámicas debido a que los ambientes biológicos son transitorios y no homogéneos. Dichas interacciones pueden ser claves en la modulación de la biodistribución, eliminación, de las respuestas inmunes y de la metabolización de los NM. En este contexto se propone que la naturaleza de los NM influirán sobre las interacciones inespecíficas con los componentes biológicos, esperándose a futuro poder regular dichas interacciones según los intereses farmacéuticos. En este proyecto de tesis se han obtenido conjugados de nanopartículas metálicas de oro (NpO) con péptidos como CLPFFD formando el conjugado NpO-CLPFFD, utilizados para destruir agregados proteicos amiloides (Aβ) involucrados en la Enfermedad de Alzheimer (EA) mediante la aplicación de radiación electromagnética. Dado que in vivo el conjugado NpO-CLPFFD llega en una muy baja proporción al cerebro respecto de la dosis inyectada (DI) se incorporó la secuencia peptídica THRPPMWSPVWP (THR), reconocida por el receptor de transferrina presente en la Barrera Hematoencefálica (BHE) con el fin de favorecer la transcitosis y el ingreso al sistema nervioso central. Es importante mencionar que una característica común de los conjugados es su gran acumulación en hígado y bazo, afectando así la llegada al cerebro. Esta elevada acumulación así como la penetración a través de la BHE esta relacionada con la formación de la CP que se forma al ponerse en contacto las nanopartículas con el plasma. Por lo cual, en este trabajo se realizó una caracterización de la CP con el fin de comprender su posible influencia sobre el comportamiento farmacocinético de las NpO. Es así que se evaluó como la CP formada sobre los conjugados NpO péptidos puede modificarse tras incorporar secuencias peptídicas como THRPPMWSPVWP, CALNN o Cpeg a CLPFFD En el desarrollo de esta tesis nanoesferas de oro (NE) se conjugaron con los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD, CALNN, C-PEG y THRPPMWSPVWPCLPFF (THRCLPFFD) y Nanovarillas de oro (NV) se conjugaron con CLPFFD. Los conjugados se caracterizaron por Espectroscopia UV-Vis, TEM, DLS, XPS y AAA y luego se emplearon para realizar estudios in vitro e in vivo. Posteriormente, los conjugados fueron incubados in vitro con plasma humano, evaluándose la estabilidad de los coloides por UV-Vis y el crecimiento del tamaño de las NpO por DLS debido a la presencia de la CP. Las proteínas de la CP fueron separadas e identificadas por geles SDS-Page, geles bidimensionales y por LC/MS/MS encontrando parámetros de comparación entre los conjugados. Las NpO conjugadas con los péptidos estudiados son especies coloidales estables en el tiempo y la presencia de la CP produce un aumento del diámetro hidrodinámico que conlleva a estabilización estérica. Las proteínas que conforman la CP tienen relación directa con el destino de las mismas en el organismo. Así proteínas detectadas estarían asociadas al reconocimiento por el sistema fagocitico mononuclear (SFM), la acumulación en hígado y bazo, como son las proteínas Ig, CO3, CO4, entre otras. Otras proteínas como la ApoE y la albúmina actuarían favoreciendo el pasaje a través de la BHE tal como sucede con NE-THRCLPFFD y en menor proporción con NE-CLPFFD. En base a lo encontrado se recubrieron NE-CLPFFD y NE-THRCLPFFD con ApoE, para luego realizar estudios in vivo, observándose que existe un aumento en la llegada al cerebro. Esto indica la importancia de la naturaleza de las proteínas de la CP sobre la distribución de las NpO así como también la posibilidad de poder modular la misma para un eventual tratamiento basado en NpO / By exposing different Nanomaterials (NM) with plasma, they are recognized by biomolecules conforming a nano-bio-interface called protein corona (CP), showing dynamics interactions because the biological environment is transient and not homogenous. These interactions could be the key in the modulation of the biodistribution, elimination, immune response and metabolization of NM. Suggesting that the features of NM has influence on non-specific interactions with biological components, It is expected in the future that they can such interactions be regulated according the pharmaceutical approach. In this thesis were obtained conjugates of gold nanoparticles (NpO) with peptides as CLPFFD (NpO-CLPFFD). This last sequence can recognize protein aggregates of β- amyloid involved in Alzheimer’s disease. Since in vivo the conjugates reach the brain in very low proportion, it was proposed to incorporate the peptide sequence THRPPMWSPVWP (THR), a sequence recognized by the transferrin receptors in endothelial cells of the blood brain barrier (BHE) promoting transcytosis of nanoparticles. However, we observed that all conjugates were accumulated in liver and spleen, interfering with arriving to brain. Therefore, the study for the interactions of NpO with the proteins conforming the CP helps us to understand and explain the pharmacokinetic behavior all them. In this work nanospheres (NE) were conjugated with the peptides CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD, CALNN, Cpeg and THRPPMWSPVWPCLPFFD (THRCLPFFD) and NpO as nanorods (NV) were conjugated with CLPFFD. Each conjugate obtained was characterized by UV-Vis spectroscopy, TEM, DLS, XPS and AAA. Then the conjugates were used to studies in vitro e in vivo. Next these conjugates were incubated in vitro with human plasma, to evaluate the stability by UV-Vis, the size effect by DLS and by TEM. Finally, the proteins of the CP were separated and identified by electrophoresis SDS-PAGE and 2D, and by LC-MS/MS to find comparative parameters between conjugates. The results obtained show that these conjugates are stable colloidal species in the time and the CP affects the diameter of the nanoparticles. A set of proteins found in the CP could determine the destiny of this NpO to will take in the organism. Thus proteins detected (as are the proteins Ig, CO3, CO4 and other) are associated with the recognition by the mononuclear phagocytic system (SFM) and their accumulation in liver and spleen. On the other proteins as ApoE or albumin that were detected in the CP of NE-THRCLPFFD and NE-CLPFFD favor the passage through the blood brain barrier. Finally, due to these results, to corroborate the approach from the ability to modify the CP, we incubated NE-CLPFFD and NE-THRCLPFFD with ApoE, then these conjugates were used in vivo, observing an enhancement in the penetration into the brain. This indicates the importance of CP on distribution of NpO as well as the possibility of modulating it to a possible drug treatment based on NpO addressed to the central nervous system / FONDECYT CONICYT
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Importancia de la actividad microbiológica en la predicción del drenaje ácido de minas

Bahamóndez Honores, Carolina Isabel 08 1900 (has links)
Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / En el presente trabajo se analizaron seis muestras de residuos mineros provenientes de tranques de relave de la minera Los Pelambres, con el objeto de estudiar el efecto de los microorganismos en los test de predicción de drenaje ácido de minas. El drenaje ácido que afecta una proporción importante de residuos mineros es uno de los principales problemas ambientales que debe enfrentar la actividad minera. Las bacterias ferro y thiooxidantes juegan un rol importante en la generación del drenaje ácido, por su efecto catalítico en la oxidación de los sulfuros. Este efecto es ampliamente reconocido en una etapa avanzada del proceso, a pH ácido, pero no existe consenso sobre su importancia en la etapa inicial cuando el pH todavía se mantiene por sobre 4,0. Los programas de predicción de drenaje ácido involucran generalmente pruebas estáticas y pruebas cinéticas que buscan simular las condiciones de meteorización de los materiales, pero que generalmente se realizan sin la participación efectiva de los microorganismos. El test confirmativo, con inoculación de microorganismos, busca determinar su efecto en la generación de drenaje ácido; sin embargo, esta prueba confirmativa considera un pH muy ácido (pH 2,8), que se aleja de las condiciones de una etapa de transición entre la oxidación química y biológica de los sulfuros. En el presente estudio se estudió el efecto de la inoculación de un cultivo de microorganismos a pH superior a 4,0. Los tests estáticos realizados permitieron una primera clasificación de las muestras de acuerdo a su potencial de generar ácido. Distintas clasificaciones fueron obtenidas a partir de los resultados de cada test, resultando en la clasificación dispar de las muestras. En cuanto al test confirmativo, de tres muestras descritas como potencialmente generadoras de drenaje ácido por el test realizado a pH 2,8, se llegó a sólo una muestra con este potencial al utilizar un pH inicial 4,5. Con el objeto de estimar las especies microbianas que se encontraban presentes en una muestra de relave (M2), se realizó un análisis mediante CARD-FISH a una mezcla de las soluciones provenientes del test confirmativo 3. Los resultados indicaron la presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans en alta proporción, seguida de las otras especies; Leptospirillum y Sulfobacillus, lo que está de acuerdo con la literatura.Las diferencias entre las clasificaciones obtenidas a través de los test estáticos y confirmativos, corroboran que la actividad bacteriana a pH superior a 4,0, debiese ser considerada como complemento para una apropiada predicción del potencial de generación de drenaje ácido de minas. / In the present work, six samples of mining waste from Los Pelambres mining´s tailings were analysed with the purpose of studying the effect of microbial inoculation in the acid mine drainage prediction test. Acid drainage, which affects a significant proportion of mining waste, is one of the major environmental problems that the mining activity has to face. The ferrous and sulphur oxidizing bacteria play an important role in the acid drainage because of its catalytic effect on the oxidation of the sulphides. This process is widely recognized in its advanced stage, acid pH; however there is no consensus on its importance in the initial stage of the process, whenever the pH still remains over 4.0. Acid mine drainage prediction programs, generally involve static and kinetic tests, which seek to simulate weathering conditions of the materials but they are usually carried out without the effective participation of microorganisms. The confirmative test with inoculation of microorganisms, seeks to determine its effect on the generation of acid drainage. Nevertheless, the confirmative test takes into account a very acidic pH level (pH 2,8) which moves away from the conditions in a transitional stage, between the chemical and biological oxidation of sulphides. In the present work, we observed the inoculation effect at a pH above 4.0. Static tests that were previously performed, allowed a first classification of samples in relation to their acid generation potential. Moreover, different classifications were obtained from the results of each test, with dissimilar conclusions. In relation to the confirmative test, of three samples initially described as potentially acid forming by the test at pH 2.8, only one sample had the potential to generate acid when the test was carried out at a higher pH 4.5. With the purpose of estimation of the microbial species that were present in a tailing sample (M2), a CARD-FISH analysis was performed to a mix of solutions coming from the confirmative test. The results showed the presence of Acidithiobacillus ferroxidans, Acidithiobacillus thiooxidans and Leptospirillum ferrooxidans at a similar proportion, followed by Sulfobacillsu sp, which is according to the consulted literature. The classification differences obtained through the static and confirmative tests, corroborates the idea that bacterial activity at pH higher than 4.0, should be considered as a complement to an appropriate classification of the samples regarding to acid rock drainage generation.
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Hacia la búsqueda de moléculas con capacidad antiagregante de proteína tau : implicaciones en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer

Jiménez Rubilar, José Manuel January 2011 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La Enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa, de evolución lenta y que se caracteriza por ser la forma más común de demencia. En el transcurso de la EA, la proteína tau comienza a hiperfosforilarse irreversiblemente en múltiples sitios, y se autoensambla en estructuras anómalas filamentosas denominadas filamentos helicoidales pareados (PHFs), para dar lugar finalmente a los ovillos neurofibrilares (NFTs). Se ha demostrado que los oligómeros de tau son neurotóxicos y más interesante aún, correlacionan con el deterioro cognitivo. Se discute sobre la naturaleza precisa de las especies que causan dicho efecto. Por lo tanto, la inhibición de la agregación de tau en estructuras oligoméricas o filamentosas se muestra como un blanco terapéutico para el tratamiento de la EA. Se ha descrito previamente que moléculas de la familia de quinolinas y polifenoles afectarían la agregación de tau in vitro. En este contexto, la hipótesis de este trabajo se enmarca en que nuevos compuestos derivados de quinolinas y polifenoles como el ácido fúlvico, tendrían capacidad inhibitoria en la agregación de tau. El objetivo central es desarrollar una metodología para el estudio de moléculas con propiedades antiagregantes de tau y sus posibles mecanismos de la inhibición. Para ello se ha purificado htau recombinante y el fragmento 4RMBD desde E. coli y se indujo la polimerización in vitro con heparina. Se caracterizaron los agregados formados mediante técnicas de espectroscopia de fluorescencia, dynamic light scattering (DLS), microscopia electrónica y microscopia de fuerza atómica (AFM). A su vez, se estableció una metodología para el screening de moléculas con capacidad antiagregante de tau. Mediante estas técnicas, hemos determinado que solo el compuesto THQ-55 de las quinolinas ensayadas tendría un potencial efecto antiagregante de tau a altas concentraciones. A su vez, el ácido fúlvico presenta un efecto inhibitorio en la agregación de tau y desensamblaría los agregados preformados de ésta. Hacia el futuro se espera dilucidar el mecanismo mediante el cual el ácido fúlvico afecta los procesos de agregación proteica. / Alzheimer's Disease (AD) is a neurodegenerative disorder of slow progress that affects the brain. AD is the most common form of dementia. In the course of AD, tau protein begins to be irreversibly hyperphosphorylated at multiple sites, and selfassembles into pathological filamentous structures called paired helical filaments (PHFs), and these filaments assemble into neurofibrillary tangles (NFTs). It has been shown that tau oligomers are neurotoxic and correlate with cognitive decline, although the precise nature of the species that cause this effect is unknown. In this context, the inhibition of tau aggregation in oligomeric or filamentous structures appears as a promising therapeutic target for the treatment of AD. Previously, it has been described that the family of molecules of quinolines and polyphenols would affect the aggregation of tau in vitro. In this context, the hypothesis of this research is based on the activity of quinolines compounds and polyphenols such as fulvic acid, and their inhibitory action on tau aggregation. The central goal is the development of an approach for the study of molecules with anti-tau aggregation properties and its possible mechanisms of inhibition. Htau and the 4RMBD fragment have been purified from E. coli and the in vitro aggregation was induced with heparin. Aggregates formed were characterized by fluorescence spectroscopy techniques, dynamic light scattering (DLS), electron microscopy and atomic force microscopy (AFM). Moreover, a methodology for the screening of molecules with antiaggregation capacity of tau was established. Using these techniques, we determined that of the quinolines tested only the THQ-55 compound has an antiaggregation potential on tau at high concentrations. On the other hand, fulvic acid has a significant inhibitory effect on tau aggregation and disassembles tau preformed aggregates. Towards the future, we hope to elucidate the mechanism by which the fulvic acid affects protein aggregation processes.
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Rol de la respuesta a proteínas mal plegadas en la actividad supresora de tumores de Caveolina-1

Díaz Morales, María Inés January 2015 (has links)
Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / El cáncer es la segunda causa de muerte a nivel mundial y en Chile luego de las enfermedades cardiovasculares. Importantemente, las muertes por cáncer van en aumento. Los avances más recientes en el entendimiento de las vías de señalización involucradas en cáncer, ha permitido la identificación de marcadores tempranos y tardíos de la carcinogénesis, los cuales son fundamentales para el diagnóstico y la prognosis del paciente. Basados en estos descubrimientos, existen disponibles nuevas terapias para el tratamiento de esta enfermedad. En esta perspectiva, una respuesta generada en el retículo endoplasmático (RE), denominada unfolded protein response (UPR) ha llamado la atención en el estudio del cáncer en la última década. En células eucariontes, la mayoría de las proteínas secretadas y de transmembrana se pliegan y maduran en el lumen del RE. Las proteínas entran al RE como cadenas polipeptídicas no plegadas cuyo flujo hacia el RE varía en respuesta a condiciones del medio y el estado fisiológico de la célula. De acuerdo a estos requerimientos las células ajustan la capacidad de plegamiento de proteínas del RE asegurando el mantenimiento de la fidelidad del proceso. Este control homeostático es realizado a través de vías de transducción de señales iniciadas por proteínas de transmembrana del RE cuyas porciones luminales sensan el estado de plegamiento de proteínas en el RE y sus regiones efectoras citoplasmáticas señalizan hacia el citoplasma y núcleo. Una de las evidencias que sustenta el rol de la UPR en cáncer está relacionada con la alta tasa de proliferación de células cancerosas observada durante el desarrollo tumoral. Este fenómeno requiere de una elevada síntesis de proteínas y de membrana. Adicionalmente, la proliferación celular asociada al crecimiento tumoral ocurre en condiciones hipóxicas y en presencia limitada de nutrientes. La señalización de la UPR involucra al menos tres sensores distintos localizados en la membrana del RE; IRE1-α, ATF6 y PERK. Estos receptores comparten dominios sensores similares en el lumen del RE y bajo condiciones de stress de retículo in vitro, son simultáneamente activados Caveolina-1 (Cav-1) una proteína de andamiaje asociada a la membrana ampliamente expresada que ha sido descrita como una proteína supresora de tumores. Estudios de nuestro laboratorio, han relacionado esta actividad con su localización en la membrana plasmática y asociada a E-Cadherina. Sin embargo, en modelos celulares de cáncer carentes de E-Cadherina, Caveolina-1 mantiene su rol como supresor de tumores. Estas observaciones indican que esta supresión de tumores puede ocurrir mediante mecanismos independientes de E-Cadherina. Adicionalmente en estos modelos, Cav-1 es altamente prevalente intracelularmente, unida a la membrana de organelos. Estas observaciones han hecho surgir la pregunta si la presencia de Cav-1 en estos organelos, pudiese estar relacionada con la actividad supresora de tumores de Cav-1 en ausencia de E-Cadherina. Con los antecedentes anteriormente mencionados, el objetivo de esta tesis fue evaluar in vivo en un modelo murino inmunocompetente, si la función de Cav-1 como supresor de tumores tenía relación con la vía adaptativa UPR y luego analizar in vitro cómo Caveolina-1 afecta la UPR. Para la primera parte, se utilizaron como modelo células de melanoma B16F10, singénicas con la cepa de ratón C57-BL/6. El análisis de diferentes parámetros en tumores formados por las células B16F10 fueron empleados para establecer una conexión entre la expresión de Cav-1 y la modulación de la vía de UPR in vivo. Los ensayos in vivo mostraron que Cav-1suprimió la formación de tumores. Se observó una reducción del 60 % en el tamaño en aquellos tumores formados por las células que expresaron Cav-1 comparado con las que no la expresaron. El hallazgo más importante observado en tumores generados por células que expresan CAV-1 fue la reducción de genes blanco regulados por las vías señalización de los sensores IRE1-α y PERK de la UPR. Esta regulación negativa fue observada además a nivel de proteínas y se mantuvo incluso en tumores de igual tamaño. En modelos de inducción clásicos de estrés de retículo in vitro, se utilizó hipoxia y el tratamiento con el inhibidor de la glicosilación, tunicamicina. En estos experimentos, nuevamente la presencia de Cav-1 se relacionó con una disminución en los niveles transcripcionales y de sus respectivos blancos proteicos río abajo de IRE1-α y PERK. Además la expresión de Cav-1 se asoció con un aumento en la muerte celular luego de 24 h de tratamiento con tunicamicina o exposición a hipoxia. Resultados similares se obtuvieron in vitro en otra línea celular metastásica de cáncer de mama humano (MDA-MB-231). El rol supresor de tumores de Cav-1 es a menudo atribuido a interacciones proteína-proteína mediadas por el dominio de andamiaje de Cav-1 (CSD), la que frecuentemente resulta en la inactivación de estas proteínas. Es por esto que para evaluar la relevancia de este dominio en la supresión de tumores y la regulación negativa de la UPR, se realizaron distintas mutaciones sitio-dirigidas en aminoácidos potencialmente interesantes de este dominio y sus alrededores para analizar su efecto en el rol supresor de tumores y sobre la UPR. Las mutantes Cav-1(S80A) y (S80E), pierden su capacidad de suprimir crecimiento tumoral y a diferencia de Cav-1(WT), generan tumores de tamaño similar a los generados por células que carecen de la expresión de Cav-1. Por el contrario, tumores generados a partir de células que expresaron Cav-1(W98F) y (W1280F), se comportaron como los tumores generados a partir de de Cav-1(WT). Del mismo modo, La inhibición de la UPR observada para de Cav-1(WT) se pierde en tumores generados por las mutantes Cav-1(S80A) y (S80E) pero no en aquellos que se generan a partir de Cav-1(W98F) y (W1280F). En resumen, los resultados obtenidos en esta tesis, indican que la presencia de Cav-1 en compartimentos intracelulares, tales como el retículo endoplasmático y la inhibición ahí de la UPR están relacionadas con la supresión de tumores de Cav-1 independiente de E-Cadherina. Este trabajo además provee de evidencia que Cav-1 suprime UPR in vitro e in vivo y que el residuo aminoacídico S80 es requerido para suprimir la formación de tumores así como también para inhibir UPR / Cancer is the second most important cause of death worldwide and also in Chile after heart diseases. Importantly, deaths caused by cancer are on the rise. More recent advances in our understanding of cancer signaling pathways have led to the identification of early and late stage markers of carcinogenesis important for patient diagnosis and prognosis. Also, based on such insight, new therapies to treat this disease have become available. Particularly, in this perspective, a stress response generated in the endoplasmic reticulum (ER), referred to as the unfolded protein response (UPR) has attracted a great deal of attention in cancer research in the last decade. In eukaryotic cells, most of the secreted and transmembrane proteins are folded in the ER lumen. The proteins enter into the ER as unfolded polypeptide chains and the extent of transport into this compartment varies in response to environment signals or the physiological status of cells. According to the specific demands, cells adapt their protein folding capacity in order to preserve the fidelity of the process. This process that seeks to maintain ER homeostasis is controlled by signal transduction events initiated by ER transmembrane receptor proteins whose luminal domains sense the protein folding status and then convey signals toward the cytoplasm and nucleus via the cytosolic domains. The importance of UPR in cancer is linked to the high proliferation rates developed by cancer cells during tumor growth, which in turn require augmented protein and membrane synthesis capacity. Additionally, such tumor growth frequently occurs in hypoxia and under conditions of limited nutrient availability. All these events posit the UPR as a crucial adaptive response during tumor growth. The UPR signaling pathway involves at least three distinct sensors located in the ER membrane: IRE1-, PERK, and ATF6. These receptors share luminal sensing domains and under stress conditions in vitro they are simultaneously activated. However, the extent of activation and hence the capacity to respond to stress depends on a large variety of ER associated factors, one of them potentially being the protein caveolin-1. Caveolin-1 (Cav-1) is a broadly expressed, membrane-associated scaffolding protein that has been described to function as a tumor suppressor. Studies from our laboratory have linked this ability to its localization in the plasma membrane and association there with E-cadherin. However, in cancer cell models lacking E-Cadherin, Cav-1 still functions as a tumor suppressor, albeit less efficiently. These observations indicate that Cav-1 tumor suppression may occur via mechanisms that are independent of E-cadherin, additionally, in such models; Cav-1 was highly prevalent in intracellular, membrane-bound compartments. These observations raised the question as to whether the presence of Cav-1 in these organelles could be related to the Cav-1 tumor suppressor activity in the absence of E-cadherin. With this in mind, the objective of this thesis was to evaluate in vivo in an immunocompetent mouse model, whether the function of Cav-1 as tumor suppressor was related to the adaptive UPR signaling pathway and then to analyze in vitro how Cav-1 affects the UPR. To test the first part, we used the syngenic mouse melanoma cell line B16F10 in the murine strain C57-BL/6. The analysis of different parameters in tumors formed by B16F10 cells were employed to establish a connection between the expression of Cav-1 and the modulation of the UPR pathway in vivo. The in vivo assays showed that Cav-1 suppressed tumor growth. A 60% reduction in tumor size was observed in tumors generated by B16F10 cells expressing Cav-1, as compared to those generated by cells lacking Cav-1. Importantly, in the tumors generated by Cav-1 expressing cells, a reduction in the transcription of target genes regulated downstream of the UPR sensors IRE1-α and PERK was observed. This down-regulation was observed also at the protein levels and the observed differences were maintained in tumors of the same size. In in vitro experiments, classic ER stress inducers, such as hypoxia and treatment with the glycosylation inhibitor tunicamicyn were employed. Here too, the presence of Cav-1 was linked to a reduction in the transcription of target genes downstream of IRE1-α and PERK that coincided with reduced protein levels of the respective target proteins.Cav-1 expression was associated with an increase in cell death after 24 h of treatment with tunicamicyn or exposure to hypoxia. Of note, similar results were obtained in vitro using the aforementioned B16F10 cells and also the metastasic human breast cancer cell line MDA-MB-231. Cav-1 tumor suppression is often attributed to protein-protein interactions mediated by the Cav-1 scaffolding domain (CSD) that often lead to inactivation of Cav-1 binding partners. To test the relevance of the CSD in tumor suppression and UPR down-regulation, several potentially interesting amino acids were altered by site-directed mutagenesis in the CSD and flanking regions and their impact on Cav-1-mediated inhibition of UPR and tumor growth were assessed. The Cav-1(S80A) and (S80E) mutants lost their ability to suppress tumor formation, and unlike Cav-1(WT) expressing cells generated tumors similar to those formed by Cav-1 lacking B16F10 cells. On the contrary, tumors generated by cells expressing the Cav-1(W98F) and (W128F) mutants behaved essentially the same as Cav-1(WT) expressing cells. Likewise, Cav-1-mediated UPR inhibition observed for tumors generated by Cav-1(WT) expressing cells was lost in tumors generated by cells expressing the S80A and S80E mutants, but not in those expressing the W98F and W128F mutants. In summary, the results obtained in this thesis indicate that the presence of Cav-1 in intracellular compartments, such as the ER, and inhibition there of the UPR is linked to Cav-1 tumor suppression independent of E-cadherin. We also provide evidence showing that Cav-1 suppressed the UPR in vitro and in vivo, and that the amino acid residue S80 is required for Cav-1 to suppress tumor formation and inhibit the UPR / Fondecyt Fondap ICGEB CRP/CH108-03
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Proteinas totais de especies de Streptococcus orais : aspectos de eletroforese em gel de poliacrilamida

Palomari, Denise Madalena 11 September 2018 (has links)
Orientador : Jose Francisco Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-09-11T20:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palomari_DeniseMadalena_M.pdf: 3176985 bytes, checksum: 76118d403e3be573a806e42857073b65 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Com o proposito de se aplicar a tecnica de eletroforese em gel de poliacrilamida como contribuiçao aos estudos de identificação e caracterização de Streptococcus orais. amostras de culluras do grupo mutans.. idenlificadas bioquimicamenle. foram analisadas alravés da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida. empregando-se metodologias distinlas na oblençao de proteinas intracelulares. Os resultados obtidos na determinação dos perfis proteicos das amostras microbianas. analisadas pela técnica de solubilização direta. permitiram detectar diferenças entre as mesmas quando comparadas. Esses resultados demonstraram. que a ressuspensão diretà de células normais em mistura solubilizante. permite a possibilidade de se distinguir duas espéci.s como. mutans e S.sobrinus. ou descrever como semelhantes. cepas microbianas supostamente diferentes ou nao relacionadas como XI-3. XII-5. XII-3 e 1-4B / Abstract: As a contribuition to the identi:f'ication and caracterization o:f'oral 5treptococc'US. cul ture sampl es o:f' the mutans group identi:f'iedbyochemically. were analysed through the pol yacr yl ami de gel electrophoresis technique. using distinct methods to isol ate their intracellular proteins. These resul tS showed that the di rect resuspensi on o:f' the whole cell proteins in bu:f':f'ered solubilizing solution. allows to distinguish between species o:f'5. mutans and 5. sobrin'US. or to describe as similar. microbian strains supposely different not related. / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental
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Verificação da formação de complexos protéicos nos telômeros de L. amazonensis /

Moraes, Camila Esteves de. January 2010 (has links)
Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Banca: Maria Carolina Sabbaga / Banca: Alexandrina Sartori / Resumo: Na maioria dos eucariotos, proteínas que ligam aos telomeros, tais como POT1 e TRF2 apresentam papéis cruciais na biologia dos telômeros, interagindo com vários outros reguladores dos telômeros para garantir a manutenção adequada dos mesmos e ainda formam complexos de ordem maior, conhecido como telosome ou shelterin. Os telômeros de Leishmania spp. são compostos por repetições conservadas TTAGGG e são mantidos pela telomerase. A base do complexo de proteínas teloméricas de Leishmania é formado pelas proteínas LaRPA-1 e LaRbp38, que ligam vitro e in vivo, com alta afinidade a DNA telomérico simples fita rico em G, e por proteínas que interagem com a região de DNA telemérico dupla fita, como a proteína recentemente descrita, homólogo de TRF. O genoma de Leishmania spp., como outros tripanossomatídeos, não tem muitas das proteínas conservadas que ligam a simplesfita teloméricos encontrada em eucariontes, tais como os homólogos da proteína CDC13 e POT1. Portanto, nós especulamos que o homólogo de RPA-1 de Leishmania pode desempenhar as mesmas funções como POT1/CDC13 nos telômeros do parasita, embora possa se ligar ao DNA telomérico simples fita com alta afinidade e de forma independente de seqüência. LaRPA-1, juntamente com a proteína multifuncional LaRbp38, que também interage com uma ampla gama de seqüências rico em GT, incluindo os telômeros, parece fazer parte de um complexo telomérico parasita que se assemelha ao complexo CST recentemente descrito. O complexo CST está sendo considerado um segundo modo de proteger os telômeros presentes em umavariedade de espécies, com exceção de leveduras de brotamento, e é constituído principalmente por proteínas RPA-like. Neste estudo, nós usamos diferentes abordagens para demonstrar que LaRPA-1 interage com o LaRbp38 e com a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In most eukaryotes, telomere binding proteins such as POT1 and TRF2 play crucial roles in telomere biology by interacting with several other telomere regulators to ensure proper telomere maintenance and to form high order complexes known as telosome or shelterin. Leishmania spp. telomeres are composed by the conserved TTAGGG repeats which are maintained by telomerase. The basic Leishmania telomeric protein complex is formed by the proteins LaRPA-1 and LaRbp38, which bind in vitro and in vivo, with high affinity, to the G-rich single-stranded DNA, and by proteins that interact with the double-stranded region of telomeres such as the recently described TRF homologue. The Leishmania spp. genome, like other trypanosomatid, lacks many of the conserved single-stranded telomeric proteins found in other eukaryotes, such as the CDC13 and POT1 protein homologues. Thus, we speculate that the Leishmania RPA-1 homologue may play the same roles as POT1/CDC13 at parasite telomeres, although it can also bind to other single-stranded DNA with high affinity and in a sequence-independent manner. LaRPA-1 together with the multifunctional LaRbp38 protein, which also interacts with a wide range of GT-rich sequences, including telomeres, seems to form part of a parasite telomeric complex that resembles the recently described CST complex. The CST complex is being considered a second telomere capping mode occurring in a broad variety of species, except budding yeast, and is mainly formed by RPA-like proteins. In this report we used different approaches to show that LaRPA-1 interacts with both LaRbp38 and with telomerase, and that these protein:protein interactions seem to occur in a cell-cycle independent manner. In addition, LaRPA-1 partially co-localizes with both proteins, probably... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Isolamento de proteínas associadas aos cromossomas de drosophila melanogaster

Moreira, Maria do Carmo Pinto Basto Avides January 1994 (has links)
No description available.
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Proteins separation and purification by expanded bed chromatography and simulated moving bed technology

Ping, Li January 2006 (has links)
Tese de doutoramento. Engenharia Química. 2006. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto

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