Doctor en Bioquímica / El cáncer constituye una de las principales causas de muerte en Chile y el mundo. Particularmente, la agresividad de esta enfermedad subyace en la diseminación de las células tumorales hacia otros tejidos, fenómeno conocido como metástasis. La metástasis es un proceso multifactorial, siendo la migración celular una de las etapas más relevantes. Caveolina-1 es una proteína de membrana que en etapas avanzadas del cáncer aumenta su expresión y promueve la migración celular y metástasis. En este contexto, Caveolina-1 ha sido asociada a un conjunto de cambios morfológicos esenciales que permiten la migración e invasión celular, entre estos, la remodelación del citoesqueleto de actina y el recambio de complejos de adhesión celular. Muchos de estos eventos dependen del tráfico endosomal, el cual a su vez es finamente regulado por diversos factores y moléculas, como las GTPasas pequeñas de la familia Rab. Una de estas proteínas es Rab5, la cual no sólo actúa como regulador maestro de la endocitosis temprana, sino que además cumple un rol fundamental en la migración celular. Trabajos recientes han descrito que la interacción entre Rab5 y Caveolina-1 influye en el tráfico endosomal, sin embargo el rol de esta interacción en la migración celular no había sido investigado. Entre los reguladores de Rab5, p85α (la subunidad reguladora de PI3K), se caracteriza por inhibir a Rab5, ya que posee un dominio RabGAP que estimula su actividad GTPasa. Literatura reciente ha descrito una interacción funcional entre p85α y Caveolina-1, la cual a su vez depende de la fosforilación de Caveolina-1 en tirosina (Y14). Lo anterior cobra relevancia, ya que Caveolina-1 ejerce muchos de sus efectos en migración celular mediante la fosforilación en este residuo. Por otro lado, trabajos recientes indican que Rab5 activa a Rac-1, a través del reclutamiento de la GEF Tiam1, fomentando la formación de lamellipodios y la polimerización de actina en sitios específicos de membrana. Además, trabajos de nuestro laboratorio demostraron que Caverolina-1 promueve la activación de Rac-1 en células metastásicas. Todos estos eventos llevan a que la célula adquiera cambios morfológicos que le permiten migrar. Por lo tanto, es importante investigar el papel potencial que desempeñaría Caveolina-1 en la regulación de este circuito, así como su relevancia en la migración celular. En esta tesis, se investigó los mecanismos asociados al efecto promotor de migración y metástasis de Caveolina-1, identificando un nuevo eje de señalización “p85α/Rab5/Tiam1/Rac-1”. A su vez, se evaluó la relevancia de este eje en un modelo preclínico, evaluando la metástasis in vivo en ratones C57BL/6. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis indican que Caveolina-1 promueve la migración, invasión y la activación de Rab5 en tres líneas celulares metastásicas: HT-29(US) de cáncer de colon, B16-F10 de melanoma murino y MDAMB- 231 de cáncer de mama. En relación a esto último, la expresión de Caveolina-1 promueve un aumento en el tamaño de los endosomas tempranos, pero no debido a la estabilización de Rab5 en éstos, sino que debido al secuestro de p85α en un complejo proteico. Interesantemente, el efecto de p85α en la inhibición de Rab5 es asociado a su actividad GAP, y no involucra la activación de PI3K. Mediante ensayos de silenciamiento y reconstitución, se observó que la expresión y actividad de Rab5 son fundamentales para que Caveolina-1 promueva migración e invasión celular, así como también la activación de Rac-1. La activación de Rac-1 por Caveolina-1 y Rab5 requiere de Tiam1, la cual es reclutada a endosomas tempranos de manera dependiente de Caveolina-1. Finalmente, se demostró que Caveolina-1 requiere de Rab5, p85α y Rac-1 para promover invasión in vitro y metástasis in vivo en ratones C57BL/6. De esta manera, este trabajo de tesis aporta nueva evidencia acerca de los mecanismos moleculares involucrados en la migración y metástasis inducida por Caveolina-1, proponiendo un nuevo eje de señalización p85α/Rab5/Tiam1/Rac-1, el cual involucra proteínas comúnmente alteradas en cáncer, y por lo tanto, contribuyendo con la identificación de nuevos blancos potenciales terapéuticos / Cancer is a leading cause of disease in Chile and worldwide. During the development and progression of this disease, normal cells convert to the cancerous state by acquiring specific characteristics. Of these metastasis is widely considered particularly important because it is this trait of cancer cells that is responsible for the large majority of deaths in cancer patients. Caveolin-1 is a membrane protein with vastly differing roles in cancer that range from functioning as a tumor suppressor to promoting tumor cell migration invasion and metastasis. Concomittant with this unfavorable role in tumor progression, expression of this protein frequently increases in advanced stages of cancer and is viewed there as a marker for poor patient prognosis and survival. In this cellular context, it is important to gain better insight to how Caveolin-1 promotes the acqusition of a more invasive cellular phenotype. In these migration-related events, endosomal trafficking reportedly plays a fundamental role and Caveolin-1 is known to promote recycling of membrane components and the activation of GTPases at the leading edge. A key membrane-associated protein involved in such processes is Rab5, a small Rho GTPase that acts as a master regulator of early endocytosis. Recently, evidence has been provided suggesting that p85α, the regulatory subunit of PI3K, is a Rab5 GAP that controls Rab5 inactivation. Structurally, p85α has two SH2 domains, involved in binding to tyrosine-phosphorylated proteins, often including receptors and adaptor proteins. Caveolin-1, on the other hand, is known to promote the migratory and invasive capacity of tumor cells via phosphorylation on tyrosine-14. Furthermore, Rab5 activates Rac-1 and promotes lamellipodia formation, through recruitment of the GEF Tiam1. Together, these events lead to changes that permit cell migration. However, the precise mechanisms by which Caveolin-1 participates in the regulation of such processes and specifically whether Caveolin-1 enhanced migration and invasion in vitro involves a novel p85α / Rab5 / Tiam1 / Rac-1 signaling axis remained to be determined. Also, a model of B16F10 murine melanoma metastasis in syngeneic C57BL / 6 mice was employed to evaluate the relevance of Rab5, p85α and Rac-1 in promoting Caveolin-1-enhanced lung metastasis in vivo. The results obtained during this thesis demonstrate that Caveolin-1 promoted migration, invasion and activation of Rab5 in the metastatic cell lines HT-29 (US), B16-F10 and MDA-MB-231. Moreover, the expression of Caveolin-1 was shown to increase the average size of early endosomes in B16F10 cells, consistent with a role in the activation of Rab5. To study molecular mechanisms that explain these results, the expression of p85α was shown to decrease Rab5 activation induced by Caveolin-1. Using inhibitors, the activation of Rab5 by Caveolin-1 was shown to be independent of PI3K activity. Moreover, expression of Rab5 was required for Caveolin-1 to promote cell migration and invasion. Importantly, the activation of the small GTPase Rac-1 induced by Caveolin-1 required the presence of Rab5 to promote migration. Furthermore, evidence is provided showing that recruitment of the Rac1 GEF Tiam1 to early endosomes was enhanced in the Caveolin-1 positive cells. Finally, using short-hairpin knock-down technology Rab5, p85α and Rac-1 were shown to be required for Caveolin-1 to promote migration and invasion in vitro, as well as metastasis in vivo in C57BL / 6 mice. In conclusion, the results of this thesis shed light on the molecular mechanisms involved in Caveolin-1-enhanced migration, invasion and metastasis and propose the existence of a novel p85α / Rab5 / Tiam1 / Rac-1 signaling axis downstream of Caveolin-1 that contributes to deregulation in cáncer and potentially represents an interesting target for treatments in cancer patients / Conicyt; Fondecyt; Anillo ACT 1111

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / Caveolina-1 es una proteína de membrana esencial en la formación de caveolas, participa en el transporte de colesterol, actúa como proteína de andamiaje en señalización y ha sido descrita como un supresor de tumores. Por otro lado, la presencia de Caveolina-1 juega un rol esencial en la polarización celular durante el proceso migratorio, ya que controla la localización de moléculas de señalización y regula la activación de proteínas que participan en migración. Sin embargo, no sólo la presencia de Caveolina-1 es esencial para la migración celular, sino también la fosforilación de Caveolina-1 en Tirosina 14. Considerando que la migración celular es esencial para la metástasis, Caveolina-1 ha sido descrita también como un promotor de metástasis. Este comportamiento dual ha causado controversia y ha dado origen a un gran número de investigaciones en desarrollo actúalmente en la comunidad científica. El principal objetivo de esta tesis fue establecer, en un modelo in vivo inmunocompetente, si Caveolina-1 tiene o no este rol dual en cáncer usando como modelo células de melanoma. Estudiamos en ratones C57-BL/6 el comportamiento de las líneas tumorales B16-F0 y B16-F10, ambas líneas singénicas con la cepa C57-BL/6, y por lo tanto no existe rechazo inmunológico. Estas células al ser subcutáneamente en estos ratones tienen la capacidad de formar tumores sólidos y a la vez, si se inyectan por la vía intravenosa, generan focos de metástasis en el pulmón de los ratones. Por lo tanto, con este sistema estudiamos el rol dual de Caveolina-1 en un mismo modelo in vivo. Una vez inoculados los animales en el lomo (vía subcutánea) o por la vena lateral de la cola (vía intravenosa), con las células seguimos la formación de tumores y cuantificamos la metástasis a nivel pulmonar, respectivamente. Los ensayos realizados in vivo en las células B16-F0 mostraron que Caveolina-1 era capaz de suprimir la formación de tumores, retardando al doble el tiempo de aparición de éstos. Al silenciar los niveles de expresión de Caveolina-1 en las B16-F0 Caveolina-1 mostró promover metástasis no sólo a nivel de pulmón, a la vez mostró nódulos metastasicos en ganglios, riñón, bazo e hígado. Los ensayos en los ratones C57BL/6 con las células B16-F10 con y sin expresión de Caveolina-1 mostraron una reducción del 60 % en el tamaño de los tumores formado por las células que expresaron Caveolina-1 comparado con las que no la expresaron. En los ensayos de metástasis, las células que expresaron Caveolina-1 causaron al menos dos veces más metástasis pulmonar. Estos resultados mostraron por primera vez en un modelo in vivo que Caveolina-1 es capaz de actúar tanto como supresor tumoral y como promotor de metástasis. Usando el mismo modelo de estudio, para analizar el rol dual de Caveolina-1 continuamos con un análisis mutacional, específicamente usando una población celular que expresó Caveolina-1 no fosforilable en la posición de la Tirosina-14 (B16-F10(cav-1/Y14F) y se realizaron los ensayos de supresión de tumor y metástasis. Los resultados revelaron que Tirosina-14 era esencial para otorgarla a Caveolina-1 la capacidad de actúar como una molécula promotora de metástasis, pero al mismo tiempo este residuo no era esencial para el rol supresor de tumores. Por otra parte, evaluamos in vivo la capacidad de E-cadherina de modular los dos roles descritos para Caveolina-1 en las células B16-F10. En estas, la presencia de E-cadherina cumple una función sinérgica sobre Caveolina-1 en su rol supresor de tumores, llegando incluso a inhibir completamente la formación de tumor dependiendo de la expresión de E-cadherina de manera directamente proporcional. Al mismo tiempo E-cadherina mostró frenar el efecto promotor de metástasis dado por Caveolina-1, es decir, ambas proteínas juntas en las células B16-F10 evitan la formación de tumores metastasicos en el pulmón o en cualquier otra parte del cuerpo del animal. / Caveolin-1 is a membrane protein essential for the formation of caveolae, is involved in cholesterol transport, acts as a signaling scaffold protein and has been described as a tumor suppressor. On the other hand, the presence of caveolin-1 plays an essential role in cell polarization during the migration process as it controls the localization of signaling molecules and regulates the activation of proteins involved in migration. However, not only the presence of caveolin-1 is essential for cell migration, but also the phosphorylation of caveolin-1 on Tyrosine 14. Whereas cell migration is essential for metastasis, caveolin-1 has also been described as a promoter of metastasis. This dual behavior has caused controversy and led to a large number of investigations currently under development in the scientific community. The main objective of my research is to establish, in an immunocompetent in vivo model, caveolin-1 whether or not this dual role in cancer melanoma. We study a model where we use mice C57-BL / 6 and tumor lines F0 B16, B16 and F10, both lines syngeneic with the strain C57-BL / 6, ie, no immune rejection. These cells to be inoculated subcutaneously in mice have the ability to form solid tumors and also, if injected intravenously, generate foci of metastases in the lungs of mice. Therefore, with this system we can study the dual role of caveolin 1 in the same model in vivo. Once inoculated animals in a case in the back of the animal (subcutaneously) and the lateral tail vein (intravenously), the cells follow the formation of tumors and quantified the lung metastases, respectively. The tests performed in vivo in B16-F0 cells show that caveolin-1 is able to suppress tumor formation, slowing to twice the time of appearance of these. Metastases in trials of these same cells, caveolin-1 showed promote metastases not only in both lung metastatic lymph nodes showed kidney, spleen and liver. By silencing the expression levels of caveolin-1 in B16-F0 results showed that both roles of caveolin-1 is lost. Trials in C57BL / 6 mice with B16 F10 cells with and without expression of caveolin-1 show that there is a 60% reduction in the size of tumors formed by cells expressing caveolin-1 compared with those without expressed. In trials of metastasis, the cells expressing caveolin-1 cause at least twice as lung metastases. These results show for the first time in an in vivo model that caveolin 1 is able to act as both tumor suppressor and a promoter of metastasis. Using the same model to study, to analyze the dual role of caveolin-1 continue with mutational analysis, specifically using a cell population that expresses caveolin-1 is not phosphorylated at the position of tyrosine-14 (B16 F10 (cav 1/Y14F) tests were performed in tumor suppression and metastasis. The results show that tyrosine-14 is essential for caveolin-1 to grant it the ability to act as a metastasis-promoting molecule, but at the same time, this residue is not essential for the role tumor suppressor. Moreover, we evaluate in vivo the ability of E-cadherin to modulate the two roles described for caveolin-1 in B16-F10 cells. In these, the presence of E-cadherin plays a synergistic role of caveolin-1 in tumor suppressor role, even to completely inhibit tumor formation depending on the expression of E-cadherin in direct proportion. While E-cadherin stops the metastasis-promoting effect given by caveolin-1, ie both proteins together in B16 F10 cells prevent the formation of metastatic tumors in the lung or elsewhere in the body of the animal. / Conicyt; FONDECYT-FONDAP

Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / El cáncer es la segunda causa de muerte a nivel mundial y en Chile luego de las enfermedades cardiovasculares. Importantemente, las muertes por cáncer van en aumento. Los avances más recientes en el entendimiento de las vías de señalización involucradas en cáncer, ha permitido la identificación de marcadores tempranos y tardíos de la carcinogénesis, los cuales son fundamentales para el diagnóstico y la prognosis del paciente. Basados en estos descubrimientos, existen disponibles nuevas terapias para el tratamiento de esta enfermedad. En esta perspectiva, una respuesta generada en el retículo endoplasmático (RE), denominada unfolded protein response (UPR) ha llamado la atención en el estudio del cáncer en la última década. En células eucariontes, la mayoría de las proteínas secretadas y de transmembrana se pliegan y maduran en el lumen del RE. Las proteínas entran al RE como cadenas polipeptídicas no plegadas cuyo flujo hacia el RE varía en respuesta a condiciones del medio y el estado fisiológico de la célula. De acuerdo a estos requerimientos las células ajustan la capacidad de plegamiento de proteínas del RE asegurando el mantenimiento de la fidelidad del proceso. Este control homeostático es realizado a través de vías de transducción de señales iniciadas por proteínas de transmembrana del RE cuyas porciones luminales sensan el estado de plegamiento de proteínas en el RE y sus regiones efectoras citoplasmáticas señalizan hacia el citoplasma y núcleo. Una de las evidencias que sustenta el rol de la UPR en cáncer está relacionada con la alta tasa de proliferación de células cancerosas observada durante el desarrollo tumoral. Este fenómeno requiere de una elevada síntesis de proteínas y de membrana. Adicionalmente, la proliferación celular asociada al crecimiento tumoral ocurre en condiciones hipóxicas y en presencia limitada de nutrientes. La señalización de la UPR involucra al menos tres sensores distintos localizados en la membrana del RE; IRE1-α, ATF6 y PERK. Estos receptores comparten dominios sensores similares en el lumen del RE y bajo condiciones de stress de retículo in vitro, son simultáneamente activados Caveolina-1 (Cav-1) una proteína de andamiaje asociada a la membrana ampliamente expresada que ha sido descrita como una proteína supresora de tumores. Estudios de nuestro laboratorio, han relacionado esta actividad con su localización en la membrana plasmática y asociada a E-Cadherina. Sin embargo, en modelos celulares de cáncer carentes de E-Cadherina, Caveolina-1 mantiene su rol como supresor de tumores. Estas observaciones indican que esta supresión de tumores puede ocurrir mediante mecanismos independientes de E-Cadherina. Adicionalmente en estos modelos, Cav-1 es altamente prevalente intracelularmente, unida a la membrana de organelos. Estas observaciones han hecho surgir la pregunta si la presencia de Cav-1 en estos organelos, pudiese estar relacionada con la actividad supresora de tumores de Cav-1 en ausencia de E-Cadherina. Con los antecedentes anteriormente mencionados, el objetivo de esta tesis fue evaluar in vivo en un modelo murino inmunocompetente, si la función de Cav-1 como supresor de tumores tenía relación con la vía adaptativa UPR y luego analizar in vitro cómo Caveolina-1 afecta la UPR. Para la primera parte, se utilizaron como modelo células de melanoma B16F10, singénicas con la cepa de ratón C57-BL/6. El análisis de diferentes parámetros en tumores formados por las células B16F10 fueron empleados para establecer una conexión entre la expresión de Cav-1 y la modulación de la vía de UPR in vivo. Los ensayos in vivo mostraron que Cav-1suprimió la formación de tumores. Se observó una reducción del 60 % en el tamaño en aquellos tumores formados por las células que expresaron Cav-1 comparado con las que no la expresaron. El hallazgo más importante observado en tumores generados por células que expresan CAV-1 fue la reducción de genes blanco regulados por las vías señalización de los sensores IRE1-α y PERK de la UPR. Esta regulación negativa fue observada además a nivel de proteínas y se mantuvo incluso en tumores de igual tamaño. En modelos de inducción clásicos de estrés de retículo in vitro, se utilizó hipoxia y el tratamiento con el inhibidor de la glicosilación, tunicamicina. En estos experimentos, nuevamente la presencia de Cav-1 se relacionó con una disminución en los niveles transcripcionales y de sus respectivos blancos proteicos río abajo de IRE1-α y PERK. Además la expresión de Cav-1 se asoció con un aumento en la muerte celular luego de 24 h de tratamiento con tunicamicina o exposición a hipoxia. Resultados similares se obtuvieron in vitro en otra línea celular metastásica de cáncer de mama humano (MDA-MB-231). El rol supresor de tumores de Cav-1 es a menudo atribuido a interacciones proteína-proteína mediadas por el dominio de andamiaje de Cav-1 (CSD), la que frecuentemente resulta en la inactivación de estas proteínas. Es por esto que para evaluar la relevancia de este dominio en la supresión de tumores y la regulación negativa de la UPR, se realizaron distintas mutaciones sitio-dirigidas en aminoácidos potencialmente interesantes de este dominio y sus alrededores para analizar su efecto en el rol supresor de tumores y sobre la UPR. Las mutantes Cav-1(S80A) y (S80E), pierden su capacidad de suprimir crecimiento tumoral y a diferencia de Cav-1(WT), generan tumores de tamaño similar a los generados por células que carecen de la expresión de Cav-1. Por el contrario, tumores generados a partir de células que expresaron Cav-1(W98F) y (W1280F), se comportaron como los tumores generados a partir de de Cav-1(WT). Del mismo modo, La inhibición de la UPR observada para de Cav-1(WT) se pierde en tumores generados por las mutantes Cav-1(S80A) y (S80E) pero no en aquellos que se generan a partir de Cav-1(W98F) y (W1280F). En resumen, los resultados obtenidos en esta tesis, indican que la presencia de Cav-1 en compartimentos intracelulares, tales como el retículo endoplasmático y la inhibición ahí de la UPR están relacionadas con la supresión de tumores de Cav-1 independiente de E-Cadherina. Este trabajo además provee de evidencia que Cav-1 suprime UPR in vitro e in vivo y que el residuo aminoacídico S80 es requerido para suprimir la formación de tumores así como también para inhibir UPR / Cancer is the second most important cause of death worldwide and also in Chile after heart diseases. Importantly, deaths caused by cancer are on the rise. More recent advances in our understanding of cancer signaling pathways have led to the identification of early and late stage markers of carcinogenesis important for patient diagnosis and prognosis. Also, based on such insight, new therapies to treat this disease have become available. Particularly, in this perspective, a stress response generated in the endoplasmic reticulum (ER), referred to as the unfolded protein response (UPR) has attracted a great deal of attention in cancer research in the last decade. In eukaryotic cells, most of the secreted and transmembrane proteins are folded in the ER lumen. The proteins enter into the ER as unfolded polypeptide chains and the extent of transport into this compartment varies in response to environment signals or the physiological status of cells. According to the specific demands, cells adapt their protein folding capacity in order to preserve the fidelity of the process. This process that seeks to maintain ER homeostasis is controlled by signal transduction events initiated by ER transmembrane receptor proteins whose luminal domains sense the protein folding status and then convey signals toward the cytoplasm and nucleus via the cytosolic domains. The importance of UPR in cancer is linked to the high proliferation rates developed by cancer cells during tumor growth, which in turn require augmented protein and membrane synthesis capacity. Additionally, such tumor growth frequently occurs in hypoxia and under conditions of limited nutrient availability. All these events posit the UPR as a crucial adaptive response during tumor growth. The UPR signaling pathway involves at least three distinct sensors located in the ER membrane: IRE1-, PERK, and ATF6. These receptors share luminal sensing domains and under stress conditions in vitro they are simultaneously activated. However, the extent of activation and hence the capacity to respond to stress depends on a large variety of ER associated factors, one of them potentially being the protein caveolin-1. Caveolin-1 (Cav-1) is a broadly expressed, membrane-associated scaffolding protein that has been described to function as a tumor suppressor. Studies from our laboratory have linked this ability to its localization in the plasma membrane and association there with E-cadherin. However, in cancer cell models lacking E-Cadherin, Cav-1 still functions as a tumor suppressor, albeit less efficiently. These observations indicate that Cav-1 tumor suppression may occur via mechanisms that are independent of E-cadherin, additionally, in such models; Cav-1 was highly prevalent in intracellular, membrane-bound compartments. These observations raised the question as to whether the presence of Cav-1 in these organelles could be related to the Cav-1 tumor suppressor activity in the absence of E-cadherin. With this in mind, the objective of this thesis was to evaluate in vivo in an immunocompetent mouse model, whether the function of Cav-1 as tumor suppressor was related to the adaptive UPR signaling pathway and then to analyze in vitro how Cav-1 affects the UPR. To test the first part, we used the syngenic mouse melanoma cell line B16F10 in the murine strain C57-BL/6. The analysis of different parameters in tumors formed by B16F10 cells were employed to establish a connection between the expression of Cav-1 and the modulation of the UPR pathway in vivo. The in vivo assays showed that Cav-1 suppressed tumor growth. A 60% reduction in tumor size was observed in tumors generated by B16F10 cells expressing Cav-1, as compared to those generated by cells lacking Cav-1. Importantly, in the tumors generated by Cav-1 expressing cells, a reduction in the transcription of target genes regulated downstream of the UPR sensors IRE1-α and PERK was observed. This down-regulation was observed also at the protein levels and the observed differences were maintained in tumors of the same size. In in vitro experiments, classic ER stress inducers, such as hypoxia and treatment with the glycosylation inhibitor tunicamicyn were employed. Here too, the presence of Cav-1 was linked to a reduction in the transcription of target genes downstream of IRE1-α and PERK that coincided with reduced protein levels of the respective target proteins.Cav-1 expression was associated with an increase in cell death after 24 h of treatment with tunicamicyn or exposure to hypoxia. Of note, similar results were obtained in vitro using the aforementioned B16F10 cells and also the metastasic human breast cancer cell line MDA-MB-231. Cav-1 tumor suppression is often attributed to protein-protein interactions mediated by the Cav-1 scaffolding domain (CSD) that often lead to inactivation of Cav-1 binding partners. To test the relevance of the CSD in tumor suppression and UPR down-regulation, several potentially interesting amino acids were altered by site-directed mutagenesis in the CSD and flanking regions and their impact on Cav-1-mediated inhibition of UPR and tumor growth were assessed. The Cav-1(S80A) and (S80E) mutants lost their ability to suppress tumor formation, and unlike Cav-1(WT) expressing cells generated tumors similar to those formed by Cav-1 lacking B16F10 cells. On the contrary, tumors generated by cells expressing the Cav-1(W98F) and (W128F) mutants behaved essentially the same as Cav-1(WT) expressing cells. Likewise, Cav-1-mediated UPR inhibition observed for tumors generated by Cav-1(WT) expressing cells was lost in tumors generated by cells expressing the S80A and S80E mutants, but not in those expressing the W98F and W128F mutants. In summary, the results obtained in this thesis indicate that the presence of Cav-1 in intracellular compartments, such as the ER, and inhibition there of the UPR is linked to Cav-1 tumor suppression independent of E-cadherin. We also provide evidence showing that Cav-1 suppressed the UPR in vitro and in vivo, and that the amino acid residue S80 is required for Cav-1 to suppress tumor formation and inhibit the UPR / Fondecyt Fondap ICGEB CRP/CH108-03

Tesis para optar al grado de Magister en Bioquímica / Las células dendríticas (DCs) son células presentadoras de antígeno capaces de capturar y procesar antígenos que luego son presentados a linfocitos T específicos en órganos linfoides. Para activar a los linfocitos T, las DCs deben pasar por un proceso de maduración y migración hacia los nódulos linfáticos. Para esto, las DCs deben percibir el rastro de quimioquinas como CCL21, a través de receptores como CCR7, que las dirigen hacia los vasos linfáticos y finalmente al nódulo linfático. Dicho proceso se denomina quimiotaxis y es dependiente de la formación protrusiones celulares formadas por haces de filamentos de actina, que están especializadas en percibir el medio por el cual transita la célula. Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, la cual se ha relacionado con la migración celular, regulando a las GTPasas pequeñas Rac-1 y Cdc42, por lo tanto incidiendo en la capacidad de la célula de reorganizar el citoesqueleto y formar protrusiones celulares. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que caveolina-1 aumenta su expresión en DCs al ser estimuladas con LPS y que juega un rol fundamental en la llegada de las DC al nódulo linfático, así como en la generación de la respuestas de linfocitos T CD8+ citotóxicos in vivo. Sin embargo, caveolina-1 no participa en la maduración de las DCs ni en su capacidad de activar linfocitos T CD8+ in vitro. En este trabajo postulamos que caveolina-1 promueve la llegada de DCs al nódulo linfático regulando su capacidad quimiotáctica a través de la generación de filopodios vía Rac-1 o Cdc42. A través de ensayos de tinción cutánea con FITC, observamos que las DCs Cav-1-/- llegan en menor número al nódulo linfático en comparación a las DCs silvestres. Además, se evidenció que las DCs Cav-1-/- poseen una capacidad quimiotáctica disminuída en respuesta a CCL21 en cámaras de Boyden, no así en matrices de colágeno. A nivel molecular, se observó que las DCs Cav-1 -/- poseen menos actividad de Rac-1, pero no de Cdc42, y un menor número de filopodios con respecto a las DCs silvestres. Este trabajo sugiere que caveolina-1 favorece la llegada de las DCs al nódulo linfático, promoviendo la actividad de Rac1 y la formación de filopodios, lo que les permite entrar o migrar a través de los vasos linfáticos

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer de mama corresponde a una de las neoplasias malignas que más se asocia a mortalidad en el género femenino a nivel mundial. Aunque su incidencia ha disminuido gracias a la implementación de mamografías de exploración y aplicación de terapias adyuvantes, esta disminución no parece ser suficiente, ya que el desarrollo de metástasis aún sigue siendo responsable de más del 90% de las muertes asociadas a cáncer de mama, entre otros tipos de cáncer. La progresión de células tumorales hacia un estado metastásico implica la adquisición de características, tales como resistencia a apoptosis, migración e invasividad elevada etc. Teniendo en cuenta esto último, se ha descrito que muchas de estas características son potenciadas por la expresión de Caveolina-1 (CAV1), involucrando a esta proteína de la membrana en la progresión del cáncer. Específicamente en cáncer de mama avanzado se ha observado que una elevada expresión de CAV1 se asocia a una menor sobrevida del paciente. Por otro lado, estudios in vitro realizados en nuestro laboratorio en la línea celular de cáncer de mama metastásico humano, MDA-MB-231, han indicado que el silenciamiento de CAV1 conduce a una disminución en la migración, polarización y recambio de adhesiones focales en comparación con células MDA-MB-231 control. La pregunta que surge ahora es de qué manera CAV1 es capaz de promover migración e invasión, favoreciendo metástasis, considerando que este proceso en sí es ineficiente debido a que menos del 0,1% de las células diseminadas están implicadas en iniciar este proceso. Una de las respuestas puede deberse a que se genera el transporte de CAV1 junto a otras moléculas a través de vesículas xiii extracelulares (EVs), las cuales serían capaces de llevar a esta proteína como mensaje a células contiguas dentro del mismo microambiente tumoral o a células pertenecientes a tejidos distantes idóneos para la formación de un nicho pre-metastásico. En este contexto, se tienen registros de que vesículas de células de la línea celular MDA-MB-231 que contiene niveles endógenos elevados de CAV1 son capaces de promover migración en células de cáncer de mama humano carentes de CAV1, como MCF-7 de carácter no metastásico, pero se desconoce el contenido y su rol en este proceso. Estos antecedentes nos llevaron a plantear la hipótesis que: CAV1 en vesículas extracelulares aumenta el potencial migratorio e invasivo in vitro en células de cáncer de mama y metastásis in vivo en un modelo de xenotrasplante de cáncer de mama. Por consiguiente el objetivo principal de esta tesis fue evaluar la capacidad migratoria e invasora de células de cáncer de mama in vitro y el desarrollo de metástasis in vivo en un modelo de xenotrasplante mamario expuesto a EVs que contienen CAV1. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Purificar y caracterizar vesículas extracelulares de las líneas celulares humanas de cáncer de mama metastásico y no metastásico; (2) Estudiar del efecto de EVs con CAV1 en las propiedades de migración e invasión in vitro en líneas celulares de cáncer de mama humano; (3) Evaluar el perfil proteómico de EVs de las sublíneas de cáncer de mama MDA-MB-231 WT, shC y shCAV1 y por último (4) Evaluar la capacidad metastásica en un modelo murino de xenotrasplante inoculado por la vía intraperitoneal con EVs que contienen CAV1. Los resultados mostraron la obtención de EVs enriquecidos en vesículas del tamaño de exosomas de <200 nm de diámetro a partir de medios condicionados de las líneas xiv celulares de cáncer de mama metástasico humano, MDA-MB-231 WT y MDA-MB-231(shC) que expresan niveles endógenos elevados de CAV1 y en células carentes de CAV1 como MDA-MB-231(shCAV1). Esta caracterización se complementó con imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión de las vesículas aisladas que mostró tamaños de vesículas de alrededor de 100 nm de diámetro en general y con el hallazgo de CAV1 en vesículas provenientes de MDA-MB-231 WT y shC y no así en vesículas de MDA-MB-231(shCAV1). Cabe añadir que se detectaron marcadores de EVs en todas las muestras mediante Western blot. Para evaluar el efecto biológico de vesículas que contienen o no CAV1 en células de cáncer de mama de carácter metastásico o no metastásico, se evaluaron parámetros de migración e invasión de estas células una vez expuestas a EVs. Los resultados indicaron que independiente del tipo celular utilizado como célula recipiente de EVs, aquellas células que son tratadas con EVs que contienen CAV1 aumentan su potencial migratorio e invasivo en comparación con células no tratadas o tratadas con EVs que no contienen CAV1. El análisis por espectrometría de masas reveló la presencia de proteínas específicas relacionadas con la adhesión celular, como Cyr61, tenascina (TNC) y S100A9 sólo en EVs de MDA-MB-231 WT y shC y no en EVs de MDA-MB-231 carentes de CAV1. De manera de evaluar el rol pro-metastásico de CAV1 en EVs en un modelo animal, se inyectaron estas vesículas junto con células de cáncer de mama metastásico o no metastásico por la vía intraperitoneal en un modelo murino denominado Carcinomatosis intraperitoneal. Los resultados indicaron que animales inoculados con células más EVs que contienen CAV1 presentaron un aumento en el número de células tumorales en el líquido ascítico hallado en la cavidad peritoneal junto con un aumento en la masa tumoral en bazo/páncreas y xv mesenterio en comparación con aquellos animales que no fueron tratados o tratados sólo con células o tratados con células más EVs que no contienen CAV1. Cabe recalcar que nuevamente el efecto de las EVs con CAV1 se dio independiente a que se inoculara junto con células de cáncer de mama que contenían o no CAV1 en el modelo murino. Esto nos lleva a sugerir que la importancia del efecto biológico de estas vesículas en la célula recipiente no sólo recae en la presencia de CAV1, sino que en el tipo de cargo molecular que puedan traer consigo CAV1 en estas vesículas / Breast cancer is the leading cause of cancer-related deaths in women. Although the incidence of this disease has decreased thanks to the implementation of screening mammograms and application of adjuvant therapies, this decrease does not seem to be enough, since the development of metastasis is still responsible for more than 90% of deaths associated with breast cancer, among other types of cancer. The progression of tumor cells towards a metastatic state implies the acquisition of characteristics, such as resistance to apoptosis, migration and high invasiveness, etc. Taking into account the latter, it has been described that many of these characteristics are enhanced by the expression of Caveolin-1 (CAV1), thereby implicating this membrane protein in the progression of cancer. Specifically in advanced breast cancer it has been observed that a high expression of CAV1 is associated with a shorter survival of the patient. On the other hand, in vitro studies conducted in our laboratory using the human metastatic breast cancer cell line, MDA-MB-231, have indicated that the silencing of CAV1 leads to a decrease in migration, polarization and focal adhesion turnover in comparison with control MDA-MB-231 cells. The question that arises is how CAV1 may promote migration, invasion and metastasis, considering that this process is very inefficient because less than 0.1% of the disseminated cells successfully establish a metastatic nodule. One possibility may be that CAV1 is present together with other molecules in extracellular vesicles (EVs), which serve as vectors to transport these components to adjacent cells within the same tumor microenvironment and/or to distant sites where they may condition xvii the pre-metastatic niche. Here, it should be noted that EVs from MDA-MB-231 cells reportedly promote migration of non-metastatic MCF-7 human breast cancer cells, but the precise content of these EVs and their role in this process were not defined. This led us to propose the following hypothesis: CAV1 in extracellular vesicles increases the migratory and invasive potential of breast cancer cells in vitro and in a breast cancer xenotransplant model in vivo. Therefore, the main goal of this thesis was to evaluate the migratory and invasive capacity in vitro and metastatic breast cancer cells in vivo in a xenotransplant model exposed to EVs containing CAV1. To address the working hypothesis, the following specific objectives were proposed: (1) To purify and characterize extracellular vesicles from human metastatic and non-metastatic breast cancer cell lines; (2) To study the effect of CAV1-containing EVs on migration and invasion in vitro of human breast cancer cell lines; (3) To evaluate the protein content by mass spectrometry of EVs from the three breast cancer sub lines MDA-MB-231 WT, shC and shCAV1; and finally (4) To evaluate the metastatic potential in vivo in a murine xenotransplant model inoculated intraperitoneally with EVs containing or not CAV1. The results showed that we were able to isolate an EV preparation enriched in vesicles of <200 nm in diameter, which is characteristic of exosomes. The EVs were purified from conditioned media of the human metastatic breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and MDA-MB-231(shC), both expressing elevated endogenous levels of CAV1, as well as from cells lacking CAV1, such as MDA-MB-231(shCAV1) cells. This characterization was complemented by transmission electron microscopy of the isolated vesicles, which revealed that vesicles were around 100 nm in diameter. Finally, by western blotting, CAV1 was detected xviii together with exosome markers in vesicles from MDA-MB-231 WT and shC but not in MDA-MB-231(shCAV1) EVs. To evaluate the biological effects of vesicles with or without CAV1 on metastatic or non-metastatic breast cancer cells, migration and invasion parameters of these cells were evaluated following exposure to EVs. Regardless of the cell type that was used as a recipient cell, those cells that were treated with EVs containing CAV1 increased their migratory and invasive potential in comparison with cells that were either not treated or treated with EVs lacking CAV1. Analysis by mass spectrometry revealed the presence of specific proteins related to cell adhesion, such as Cyr61, tenascin (TNC) and S100A9 only in MDA-MB-231 WT and shC EVs but not in EVs from MDA-MB-231 lacking of CAV1. These results were confirmed by western blotting analysis. In order to evaluate the role of CAV1 in EVs in a murine carcinoma model, these vesicles were injected intraperitoneally together with metastatic or non-metastatic breast cancer cells into recipient mice. For animals inoculated with cells plus EVs containing CAV1, the number of tumor cells found in the ascitic fluid generated within the peritoneal cavity was dramatically increased. Also, a substantial increase in the tumor mass in spleen/pancreas and mesentery was observed in these mice compared to those animals that were either not treated, treated only with cells or treated with cells plus EVs that did not contain CAV1. It should be noted that again these effects of CAV1-containing EVs were observed regardless of whether the reciepient breast cancer cell type employed in these experiments expressed CAV1 or not. Thus, the biological effects of these vesicles in the recipient cell xix appear not to be attributable to CAV1 per se, but rather to depend on differences in the molecular cargos that are incorporated into EVs in the presence of CAV1

Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas, hasta diciembre de 2018 / El cáncer es la 2° causa de muerte en Chile. El desarrollo del cáncer se ha propuesto que es consecuencia de la pérdida de función de los genes supresores de tumores beneficiando la acción de los oncogenes (genes que promueven el crecimiento de tumores). La activación del Factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) en un ambiente reducido en oxígeno (hipoxia) o por óxido nítrico (NO), permiten la proliferación y adaptación metabólica de las células tumorales. Por otro lado, Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, que ha sido descrita como un supresor de tumores y promotor de metástasis. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que E-Cadherina y Caveolina-1 actúan cooperativamente en supresión de tumores in vivo. Sin embargo, Caveolina-1 suprime el crecimiento de tumores incluso en células carentes de E-Cadherina, de un modo menos eficiente. La isoforma endotelial de la sintasa de óxido nítrico (NOS3), es uno de los blancos inhibidos por Caveolina-1 más ampliamente descritos en la literatura, que recientemente ha sido implicado en mantenimiento tumoral. Cómo la inhibición de NOS mediada por Caveolina-1 afecta la activación de HIF1α contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina, aún no ha sido evaluado. En este trabajo, evaluamos la posibilidad que la inhibición de NOS por Caveolina-1 pueda reducir la transcripción dependiente de HIF1α y contribuir así a la función supresora de tumores de Caveolina-1. Líneas celulares transfectadas con un plasmidio que codifica para Caveolina-1 [HT29(US), B16F10 y HEK293T] o células en que la expresión endógena de Caveolina-1 fue disminuida utilizando un shRNA [MDA-MB231], fueron tratadas en hipoxia (1% O2, 4-24 h). La actividad transcripcional de HIF, la expresión de genes blanco de HIF1α, la distribución subcelular de HIF1α, Caveolina-1 y NOS3, fueron evaluados mediante ensayos de gen reportero, RT-PCR/qPCR, Western Blot y microscopía confocal, respectivamente. Además, se realizaron ensayos de formación de tumores en ratones inmunosuprimidos SCID-Beige y en ratones inmunocompetentes C57BL/6. Los principales hallazgos de este trabajo fueron, que Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de VEGF en hipoxia en las líneas celulares analizadas. Además, la reducción del crecimiento tumoral de células de melanoma murino B16F10(Cav-1) fue coincidente con la reducción de la expresión del mRNA de vegf in vivo. El tratamiento de las células con el dador de NO (DETA/NO) o el inhibidor de arginasa BEC, previnieron la inhibición de la actividad transcripcional de HIF1α mediada por Caveolina-1. Además, la inhibición de NOS con L-NAME o con el inhibidor selectivo de NOS3, L-NIO, reducen el incremento en la actividad transcripcional de HIF en hipoxia. In vivo, la sobreexpresión de HIF1α en células HT29(US)(Cav-1) revierte la supresión de tumores mediada por Caveolina-1 en ratones SCID-Beige. Finalmente, el tratamiento sistémico de ratones C57BL/6 con L-NAME, reduce el volumen tumoral a niveles comparables con los observados en los tumores formados por células B16F10(Cav-1). En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de NOS3 mediada por Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de sus genes blanco, in vitro e in vivo, contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina / Cancer, the 2nd most important cause of death in Chile, is thought to develop due to loss of tumor suppressor and gain of oncogene function. Activation of Hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) in the low oxygen environment (hypoxia) present in tumors or by nitric oxide (NO), favors cancer cell proliferation and metabolic adaptation. Caveolin-1 is a scaffolding protein that reportedly functions both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. Results from this laboratory have shown that E-cadherin and Caveolin-1 cooperate in tumor suppression in vivo. However, Caveolin-1 expression suppresses tumor growth even in cancer cells lacking E-cadherin, albeit less efficiently. The endothelial isoform of nitric oxide synthase (NOS3), one of the best-established targets for inhibition by Caveolin-1, has recently been implicated in maintence of tumor growth. Whether, Caveolin-1-mediated NOS inhibition may impact on HIF1α activation and account for tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin has not been yet assessed. Here, we evaluated the possibility that NOS inhibition by Caveolin-1 may reduce HIF1α - dependent transcription and thereby contribute to the tumor suppressor function of Caveolin-1. Cell lines transfected with a Caveolin-1-encoding plasmid [HT29(US), B16F10 and HEK293T] or cells where endogenous Caveolin-1 protein levels [MDA-MB231] were reduced using shRNA-technology, were exposed to hypoxia (1% O2, 4-24 h). In these cells, HIF transcriptional activity, HIF1α target-gene expression, HIF1α, Caveolin-1 and NOS3 protein levels and subcellular localization were evaluated by gene reporter assays, RT-PCR/qPCR, Western Blot and confocal microscopy, respectively. Tumor forming capacity was evaluated in immunodeficient SCID-Beige and immunocompetent C57BL/6 mouse strains. The main findings of this study are that Caveolin-1 reduced HIF1α transcriptional activity and VEGF expression in hypoxia in vitro in all cell lines. Also, reduced tumor growth of B16F10(Cav-1) melanoma cells in C57BL/6 mice correlated with reduced vegf gene expression in vivo. Treatment of cells with the NO donor (DETA/NO) o arginase inhibition with BEC, prevented Caveolin-1-mediated inhibition of HIF1α transcriptional activity. Furthermore, NOS inhibition with L-NAME or selective NOS3 inhibition with L-NIO, reduced hypoxia-enhanced HIF transcriptional activity. In vivo HIF1α overexpression in HT29(US)(Cav-1) cells reversed tumor suppression due to Caveolin-1 in SCID-Beige mice. Finally, systemic treatment of C57BL/6 mice with L-NAME, reduced tumor volumes to levels comparable to those observed for tumors formed by B16F10(Cav-1) cells. In summary, our observations suggest that Caveolin-1-mediated inhibition of NOS3 activity reduces HIF1α transcriptional activity and target gene expression, both in vitro and in vivo, and that this ability contributes to tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin / CONICYT, FONDECYT, FONDAP, MECESUP

Tesis para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer corresponde a la segunda causa de muerte en Chile y el mundo, pero los pacientes con cáncer no mueren debido al crecimiento del tumor primario, sino a la diseminación de las células tumorales y posterior colonización de éstas en nuevos órganos o metástasis. En términos generales, el cáncer es la consecuencia de un proceso multifactorial que lleva a la transformación progresiva de células normales en células altamente malignas. La amplia variedad de fenotipos del cáncer se debe a la manifestación de alteraciones esenciales en la fisiología celular, las que colectivamente dictaminan el crecimiento maligno. Dos de las características adquiridas por las células tumorales en las que se enfocará esta tesis son; la invasión de tejidos y metástasis y la reprogramación del metabolismo energético. Caveolina-1 es una proteína integral de membrana a la que se le ha atribuido un rol dual en la progresión tumoral, actuando como supresor de tumores, ya que la disminución de la expresión de caveolina-1 es suficiente para revertir el fenotipo transformado, o como promotor de metástasis en estadios tardíos del cáncer, donde la expresión de caveolina-1 aumenta sin revertir el fenotipo maligno y se correlaciona con un aumento en la migración celular y metástasis, multiresistencia a drogas y una mala prognosis para el paciente. Ambos roles de caveolina-1 se ven afectados por la presencia de la glicoproteína Ecadherina, la cual potencia su acción supresora de tumores y suprime la habilidad de caveolina-1 para promover metástasis in vivo. Sin embargo, el mecanismo por el cual E-cadherina suprime la habilidad de caveolina-1 para promover la metástasis no ha sido estudiado. La habilidad de caveolina-1 para promover un aumento en la migración en células metastásicas se relaciona con un aumento en la activación de Rab-5 y Rac-1. Ya que la reprogramación del metabolismo energético de las células, suple tanto las necesidades bioenergéticas como biosintéticas de las células cancerígenas para sostener una proliferación aumentada y una rápida migración e invasión celular, en este proyecto se caracterizó el fenotipo metabólico de las células metastásicas que expresan o no, caveolina-1 y estudiamos cómo la expresión de E-cadherina afecta el metabolismo. Caveolina-1 sufre modificaciones post-traduccionales que participan en su función intracelular, como la fosforilación en el residuo de tirosina 14 (Y14), mediada por las proteínas tirosina quinasas no receptoras Src, Fyn y Abl en respuesta a varios estímulos como. En células metastásicas de cáncer de mama, se observan altos niveles de expresión de caveolina-1 y un alto grado de fosforilación de ésta en Y14, lo que promueve un aumento en la migración celular por un aumento en el recambio de la adhesiones focales, polarización, velocidad persistencia y direccionalidad de la migración. Todas estas funciones de caveolina-1 son bloqueadas por la inhibición de la fosforilación de caveolina- 1 en Y14 tanto de manera farmacológica como por la utilización de una caveolina-1 que no es fosforilable (Y14F). Por lo tanto, el rol promotor de metástasis de caveolina-1, dependería de su fosforilación en Y14. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipita con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y PTPN14 en células de melanoma murino e induce una disminución en la migración, formación de colonias y crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de colon. Estos antecedentes nos llevaron a proponer la siguiente hipótesis: En presencia de E-cadherina se recluta a la fosfatasa PTPN14 al complejo multiproteíco formado con caveolina-1 lo que reduce la habilidad promotora de migración y metástasis de caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de ésta en tirosina 14. El objetivo principal de esta tesis es determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la fosforilación en tirosina de caveolina-1 (Y14) y β-catenina (Y654) y la migración e invasión celular en células cancerígenas. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre los niveles de fosforilación en tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina y la migración e invasión celular; (2) Estudiar la participación de Src en la fosforilación en tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina en presencia y ausencia de E-cadherina; (3) Determinar si los complejos proteicos formados con caveolina-1 en presencia de E-cadherina contienen PTPN14, la que contribuye a la desfosforilación de caveolina-1 en tirosina 14; (4) Determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la activación de Rab-5 y Rac-1; (5) Caracterización de los cambios metabólicos inducidos por la expresión caveolina-1 y la variación de éstos por la co-expresión con Ecadherina. Para el desarrollo de los objetivos mencionados se utilizaron líneas celulares metastásicas en las que se co-expresan caveolina-1 y E-cadherina. Se realizó ensayos de Western de blot, luego de ensayos de multiherida para determinar los niveles de fosforilación de caveolina-1 en Y14 y β-catenina en Y654, ensayos de migración por transwell, ensayos de invasión, ensayos de precipitación por afinidad para determinar la actividad de Rab-5 y Rac1 en células que expresan caveolina-1 en presencia o en ausencia de E-cadherina. Además, se caracterizaron los complejos multiproteícos formados por caveolina-1, mediante ensayos de inmunoprecipitación y espectrometría de masa en células que expresan o no E-cadherina y se caracterizó el fenotipo metabólico de células que expresan o no caveolina-1, estudiando cómo cambia éste en presencia de E-cadherina. En resumen en esta tesis se buscó dilucidar el mecanismo mediante el cual Ecadherina reduce la habilidad promotora de migración, invasión y metástasis de caveolina-1 en células de cáncer metastásicas. En este trabajo mostramos que la expresión de E-cadherina inhibe el aumento en la migración, invasión y metástasis inducido por caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de caveolina-1 en Y14, además, de bloquear la activación del eje Rab-5/Rac1. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipitó con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y su expresión fue capaz de inhibir el rol promotor de migración, invasión y metástasis de caveolina-1. Finalmente mostramos que la expresión y fosforilación de caveolina-1 induce un switch metabólico a un fenotipo glicolítico aeróbico por el bloqueo del complejo mitocondrial IV, generando cambios en el metaboloma de las células metastásicas congruentes con este switch metabólico. La expresión de Ecadherina bloquea el cambio metabólico inducido por caveolina-1 llevando a las células a un metabolismo quiescente / Cancer is the second leading cause of death in Chile and in the world. Cancer patients do not die due to the primary tumor growth, but rather due to the spread of the cancer cells from the primary tumor and subsequent colonization of new organs, a process known as metastasis. In general terms, cancer is the result of a multifactorial process that leads to the progressive transformation of normal cells into highly malignant cells. The wide variety of cancer phenotypes is due to alterations in cell physiology that collectively lead to the malignant cell behavior. Two of the characteristics acquired by tumor cells, on which this thesis will focus, are tissue invasion, as well as metastasis and reprogramming of energy metabolism. Caveolin-1 is a membrane protein that has been attributed a dual role in cancer progression, acting at early stages as a tumor suppressor given that augmenting the expression of caveolin-1 is sufficient to reverse the transformed phenotype, or as a promoter of metastasis in late stages of cancer, where enhanced expression of caveolin-1 favors the malignant phenotype and correlates with an increase in cell migration and metastasis, multidrug resistance and poor prognosis of the patients. Both roles of caveolin-1 are affected by the presence of the glycoprotein E-cadherin, which enhances caveolin-1 function as a tumor suppressor and suppresses the ability of caveolin-1 to promote metastasis in vivo. However, the precise mechanism by which E-cadherin suppresses the malignant traits of caveolin-1 is unknown. The ability of caveolin-1 to promote migration of metastatic cells is associated with increased activation of Rab-5 and Rac-1. Bearing in mind that the reprogramming of energy metabolism in cancer cells, is required to supplement both the both the bioenergetic and biosynthetic needs of these cells to sustain increased proliferation, rapid migration and cell invasion, this thesis also evaluated the metabolism of metastatic cells expressing or not caveolin-1 and how this was affected by the expression of E-cadherin. Caveolin-1 is subjected to posttranslational modifications relevant to protein function, such as phosphorylation on tyrosine 14 (Y14), by the non-receptors protein tyrosine kinases non-receptor Src, Fyn and Abl. This may occur in response to a large variety of different stimulus. In metastatic breast cancer cells, high levels of caveolin-1 expression and phosphorylation on Y14 are observed and associated with increased cell migration by promoting focal adhesion turnover, polarization, persistence, speed and directionality of migration. All these functions of caveolin-1 are blocked by inhibition of caveolin- 1 phosphorylation on Y14 either pharmacologically or by introducing a nonphosphorylatable caveolin-1 (Y14F) mutation. Therefore, the metastasis promoting role of caveolin-1 depends on Y14 phosphorylation. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of Ecadherin and PTPN14 in murine melanoma cells and decreased migration, colony formation and anchorage-independent growth of colon cancer cells. These results available in the literature led us to propose that in the presence of E-cadherin PTPN14 is recruited to the multiprotein complex including caveolin-1 to reduce Y14 phosphorylation, cell migration and metastasis induced by caveolin-1. The main objective of this thesis was to determine the effect of co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on tyrosine phosphorylation of caveolin-1 (Y14) and β-catenin (Y654), as well as migration and invasion in cancer cells. To address the working hypothesis the following specific objectives were evaluated: (1) To determine the effect of the co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on the levels of tyrosine phosphorylation 14 of caveolin-1 and on tyrosine 654 of β catenin and migration and cell invasion; (2) To study participation of Src in the phosphorylation of the tyrosine 14 of caveolin-1 and on tyrosine β-catenin 654 in the presence and absence of E-cadherin; (3) To determine whether the protein complexes formed with caveolin-1 in the presence of E-cadherin contain PTPN14, and if this phosphatase contributes to dephosphorylation of tyrosine 14 of caveolin-1; (4) To determine the effect of coexpression of caveolin-1 and E-cadherin on the activation of Rab-5 and Rac-1; (5) To characterization of the metabolic changes induced by caveolin-1 expression and the effect of the co-expression with E-cadherin on cell metabolism. To address these objectives metastatic cell lines that co-expressed caveolin-1 and E-cadherin were used. Multiple wounding assays and Western blot analysis was used to determine the phosphorylation levels of caveolin-1 on Y14 and β-catenin on Y654 moreover migration assays, invasion assays, affinity precipitation assays were employed to determine the activity of Rab-5 and Rac1 in cells expressing caveolin-1 in the presence or absence of E-cadherin. Furthermore, protein composition the analysis of the multiprotein complex formed by caveolin-1 and E-cadherin was evaluated following immunoprecipitation assays by mass spectrometry analysis. The metabolic phenotype of cells expressing or not caveolin-1 was characterized using Seahorse extracellular analyzer and metabolic changes in presence of Ecadherin were determined. In summary, this thesis sought to elucidate the mechanism by which E-cadherin reduces the ability of caveolin-1 to promote migration, invasion and metastasis as well as metabolic reprograming of metastatic cancer cells. In this study, we show that the expression of E-cadherin prevented caveolin-1- enhanced migration, invasion and metastasis by reducing caveolin-1 phosphorylation on Y14 and, as a consequence, blocking of the activation of the Rab-5/Rac-1 signaling axis. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of E-cadherin and overexpression or this phosphatase was sufficient to prevent the migration, invasion and metastasis promoting role of caveolin-1, even in the absence of E-cadherin. Finally we show that the expression caveolin-1 induced a metabolic switch to an aerobic glycolytic phenotype, likely by blocking the mitochondrial complex IV. These effects coincided in metastatic melanoma cells with changes in the metabolome. Moreover, the expression of E-cadherin blocked the metabolic changes induced by caveolin-1 leading to a quiescent metabolic phenotype in metastatic cells / Conicyt-FONDAP; Fondecyt ; Anillo ACT / 31 de diciembre de 2018

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-26T15:43:37Z No. of bitstreams: 1 daniel_a_p_martins_ioc_bcm_0024_2010.pdf: 10130276 bytes, checksum: 596c01e9402f3b4dd80395ef8bc4aa50 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-26T15:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniel_a_p_martins_ioc_bcm_0024_2010.pdf: 10130276 bytes, checksum: 596c01e9402f3b4dd80395ef8bc4aa50 (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Departamento de Neurobiologia. Rio de Janeiro, RJ,Brasil / A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi sendo a principal causa de morbi-mortalidade entre as cardiopatias na América Latina, onde é endêmica. No presente trabalho nós utilizamos modelos experimentais tais como cultivo celular e infecção de camundongos albinos para avaliar aspectos relacionados à patogênese desta doença. Primeiramente utilizamos a técnica de microarranjos de oligonucleotídeos para determinar as diferentes assinaturas transcriptômicas induzidas por quatro diferentes cepas de T. cruzi em uma linhagem de células musculares. Neste trabalho, verificamos que os genes alterados significativamente nas células infectadas (p<0,05) foram diferentes para cada cepa e apenas 21 sofreram a mesma alteração nas quatro cepas estudadas. No entanto, mioblastos apresentaram assinaturas transcriptômicas únicas após infecção pelas quatro cepas de T. cruzi utilizadas. Estes resultados indicam que a infecção com diferentes cepas do parasito modula vias similares, porém não idênticas, nas células hospedeiras. Em seguida analisamos o impacto da infecção de cardiomiócitos murinos na expressão de caveolina-3 (Cav-3), proteína formadora das cavéolas, importantes para a manutenção da homeostase de cálcio intracelular e envolvida em processos de hipertrofia cardíaca. A infecção in vitro e in vivo por T. cruzi induziu redução significativa (p<0,05) nos níveis de Cav-3. Esta redução foi acompanhada pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK), majoritariamente envolvida no processo de remodelamento e hipertrofia cardíacos, sugerindo a participação desta via de sinalização na patogênese da doença de Chagas. Por último, avaliamos a capacidade tripanocida do composto antiarrítmico amiodarona em culturas de cardiomiócitos infectadas. Este composto apresentou atividade seletiva anti-T. cruzi, promovendo danos ultra-estruturais às formas amastigotas intracelulares e a recuperação da célula hospedeira, incluindo restabelecimento do citoesqueleto de actina e junções comunicantes, além da contratilidade espontânea das culturas. O conjunto de dados gerado com esta tese traz importantes avanços para o entendimento do estabelecimento da doença de Chagas cardíaca e novas opções para o tratamento etiológico desta doença negligenciada. / Chagas’disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and is the main cause of morbidity and mortality by heart problems in endemic countries in Latin America. In the present work we employed as experimental models cell cultures and murine experimental infection to evaluate aspects related to the pathogenesis of this disease. In the first part we determined through oligonucleotide microarrays the transcriptomic signatures induced in a myoblast cell line by four reference T. cruzi strains. We observed that the significantly altered (p<0.05) genes differed for each strain studied and only 21 suffered changes in the same direction in all four strains. However, infected myoblasts presented proportional alterations in the the overall transcriptome. These results indicate that the infection with distinct strains modulate similar, but not identical, pathways in the host cell. Next we analyzed the impact of T. cruzi infection on cardiac caveolin-3 (Cav-3) expression, which has an important role in the maintenance of intracellular calcium homeostasis and is also involved in cardiac hypertrophy pathways. Both in vitro and in vivo infection induced a significant reduction of Cav-3 levels. This reduction was followed by the activation of extracellular signal regulated kinase (ERK), which plays a major role in cardiac remodeling and hypertrophy, suggesting that this pathway may be involved in the pathogenesis of Chagas’ heart disease. Finally we tested the tripanocidal potential of the anti-arrhythmic drug amiodarone in infected cultures of cardiac myocytes. This compound displayed a selective anti-T. cruzi activity, inducing ultrastructural alterations in intracellular amastigotes and promoted host cell recovery with actin cytoskeleton and gap junction reassembly, followed by restoration of the spontaneous contractility. The data generated in this work bring important advances into the understanding of Chagas heart disease establishment and also a new option for the etiological treatment of this neglected disease.