Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El virus HTLV-I (Virus Linfotrópico humano Tipo I) es el agente etiológico de dos patologías principales, la Mielopatía asociada al HTLV-I/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), una axonopatía neurodegenerativa, donde existe falla en el transporte axonal y la Leucemia de células T del adulto (ATL). No se ha detectado infección por HTLV-I en neuronas, desconociéndose el mecanismo por medio del cual se produce la neurodegeneración en HAM/TSP. Puesto que el reservorio principal del virus son los linfocitos T CD4+, algunos productos virales secretados por estos linfocitos infectados infiltrados en el sistema nervioso central, podrían afectar vías de transducción de señales relacionadas con la reorganización de citoesqueletos y transporte axonal, produciendo el daño axonal de distal a proximal observado en pacientes HAM/TSP. Los productos secretados por células MT2 (linfocitos infectados con HTLV-I) provocan retracción en células de neuroblastoma SH-SY5Y diferenciadas y disminuyen la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12 durante su diferenciación a tipo neuronal. Entre las proteínas virales secretadas, se encuentra Tax, la disminución de la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12, podría estar mediada por esta proteína viral a través de la vía transduccional que involucra a semaforinas y sus receptores Plexinas. Como un ejemplo, en el caso de Sema3A-Plexin A, un aumento de la actividad de Cdk5 causa hiperfosforilación de Tau y CRMP-2. El fallo en el transporte axoplásmico, podría explicarse por una desregulación de la fosforilación de las subunidades de los motores moleculares kinesina KIF5 y dineína citoplasmática Dync en este escenario. En este trabajo, se propuso estudiar el efecto de los productos secretados desde linfocitos infectados que incluyen Tax sobre el proceso de diferenciación neuronal. Para esto, se utilizó la línea celular de feocromocitoma de rata, células PC12 diferenciables a tipo neuronal por acción de NGF. La Hipótesis planteada es la siguiente: “La exposición a productos secretados de linfocitos infectados por HTLV-I provoca un aumento en el estado de fosforilación de proteínas motoras en modelo neuronal de células PC12” El primer objetivo desarrollado, fue determinar si Tax es uno de los productos virales secretados desde medio de cultivo de células MT-2 responsable del efecto de retardo de crecimiento neurítico de PC12. La adición al cultivo celular de anticuerpos monoclonales anti-Tax mostró que se bloqueó este efecto de retardo de crecimiento, lo que apunta a que este efecto se debe a la acción de Tax presente en el medio de secreción de las células MT-2. El segundo objetivo, contempló estandarizar protocolos de inmunodetección selectivos para determinar las subunidades asociadas al control de funcionalidad de kinesina KIF5 y dineína citoplasmática en células PC12. Los análisis por Western blot mostraron que las cantidades de las subunidades de kinesina KIF5 (cadena pesada y liviana) y dineína citoplasmática (cadena intermedia) presentes en las células PC12, no varían durante el período de diferenciación estudiado. Esto significa, que Tax no estaría alterando su expresión proteica. El tercer objetivo planteado fue comparar el grado de fosforilación de las subunidades de proteínas motoras en células expuestas a productos secretados desde células MT-2 con la condición control con medio de cultivo de la línea celular K562. Al no disponer de anticuerpos contra las formas fosforiladas de estas proteínas motoras, se procedió a separarlas mediante la técnica de electroforesis de geles en dos dimensiones. Este objetivo requirió inicialmente estandarizar esta técnica y luego se emplearon las muestras de lisados de PC12 provenientes del tercer día de diferenciación que habían sido sometidas al medio condicionado MT-2 y al de K562. Estos análisis no mostraron diferencias significativas en las migraciones electroforéticas, que podrían dar cuenta de cambios del estado de fosforilación de estas subunidades motoras. No obstante, estos resultados no se puede descartar que existan diferencias en el grado de fosforilación de las subunidades de estos motores moleculares, puesto que las diferencias en el grado de fosforilación pueden ser muy menores para ser observadas como cambios en la migración electroforética. Se debiera usar un método inmunológico más sensible empleando anticuerpos que reconozcan fosforilaciones determinadas estas proteínas / Effect of secretable proteins from HTLV-I infected lymphocytes on phosphorylation of motor proteins in PC12 cells as a model of neuronal culture HTLV-I virus (Human T-cell lymphotropic virus type I) is the etiologic agent of two main pathologies, the Myelopathy associated to HTLV-I/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP), a neurodegenerative axonopathy with impairment of axonal transport, and the Leukemia of adult T-cells (ATL). No infection in neurons has been detected, being unknown the mechanisms of the neurodegeneration in HAM/TSP. Lymphocytes T-CD4+ represent the main reservoir of the virus. Therefore, some secreted products from these infected lymphocytes infiltrated into the central nervous system could produce alteration of signal transduction pathways related with cytoskeletons and axonal transport, thus accounting for the distal to proximal axonal damage observed in HAM/TSP patients. Secreted products from MT-2 cells (HTLV-I infected lymphopcytes cell line) produce retraction in differentiated neuroblastoma SH-SY5Y cells and reduced the rate of neurite growing during PC12 cell differentiation to neuronal type. Among the viral secretable proteins is Tax, hence, the reduction of PC12 neurite growing could be mediated by this viral protein through transduction signalings that involves semaphorins and their receptor Plexins. As an example, in the case of Sema3A-Plexin A, an increase in Cdk5 activity causes Tau and CRMP-2 hyperphoshorylations. The failure of axonal transport could be explained by deregulation of phosphorylation of molecular motor subunits kinesin KIF5 and cytoplasmatic dynein Dync. In this work it was proposed to study the effect of secreted products, including Tax, from infected lymphocytes on the neuronal differentiation process. We employed the rat pheochromocytoma cell line, PC12 cells during NGF-differentiation to neuronal type. The Hypothesis stated expresses that: “Exposure to secreted products from HTLV-I infected lymphocytes causes an increase in the phosphorylation state of motor proteins in a neuronal model of PC12 cells” The first goal developed was to determine if Tax was one of the viral secreted products to the culture medium of MT-2 cell line responsible of retardation of PC12 neurite growing. Addition to the cell culture monoclonal antibodies anti-Tax blocked the effect on retardation rate of neurite growing, this pointed to the action of Tax present in the secretion medium of MT-2 cells. The second goal consisted in the standardization of selective protocols for immunodetection of subunits associated with the functional control of kinesin KIF5 and cytoplasmic dynein present in PC12 cells. Western blots analyses showed that levels of kinesin KiF5 (heavy and light chains) and cytoplasmic dynein (intermediate chain) present in PC12 cells did not change during the followed period of differentiation. This result suggests that their protein expression is not altered by Tax. The third goal included the comparison of phosphorylation levels of the subunits of the motor proteins exposed to MT-2 cell secreted products with the control condition with K562 cell line medium. Due to non-availability of the antibodies against phosphorylated forms of motor proteins, we separated them by two-dimensional gel electrophoresis. This goal initially required the standardization of the technique, and then PC12 lysates obtained at third day of differentiation in the presence of either MT-2 or K562 cell culture medium were used. These analyses did not show significant differences in the electrophoresis migrations of KiF5 and dynein that could account for changes in the phosphorylation levels of these subunits of motor proteins. In spite of our results, it cannot be discarded the existence of differences in the phosphorylation degree of the molecular motor subunits because the differences in the phosphorylation degree could be minors and undistinguishable by electrophoretic migration changes. Thereby, it should be used more sensitive immunological methods employing antibodies capable of distinguish motor proteins phosphorylations

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El estrés corresponde a una respuesta del organismo que se desencadena frente a una situación donde el individuo se siente amenazado, que promueve la adaptación y sobrevida del mismo. Esta respuesta es específica, pues involucra la activación de distintos circuitos neuronales y la liberación de mediadores humorales dependiendo del tipo de agente “estresante”. En el caso del estrés psicosocial se liberan principalmente glucocorticoides (hormonas esteroidales) y catecolaminas, provocando cambios en la expresión génica y en la transducción de señales tanto a nivel central como periférico. Las áreas que son blanco de las hormonas del estrés y en especial de los glucocorticoides incluye la formación hipocampal (Cuerno de Ammón, CA y giro dentado) que participa en la memoria declarativa, la amígdala que participa en la respuesta al miedo y la corteza frontal asociada a la memoria de trabajo. Estudios morfológicos y bioquímicos han demostrado que las variaciones en los niveles de glucocorticoides secretados durante el ciclo circadiano y durante el estrés promueve modificaciones neuroplásticas en estas estructuras, especialmente en el hipocampo, y que incluyen cambios morfológicos, modificación en la excitabilidad celular y en la eficacia sináptica. Se ha descrito que el alza en la secreción de glucocorticoides inducido por un estrés agudo (episodio único) puede actuar como un modulador positivo o negativo de los procesos de memoria y aprendizaje relacionados a la formación hipocampal. Sin embargo, se ha visto que una activación excesiva de la respuesta de estrés, así como la imposibilidad de apagarlo pueden ser altamente contraproducentes, al disminuir la capacidad plástica del tejido neural, afectando especialmente las estructuras del sistema límbico y en particular el hipocampo. Entre los múltiples efectos del estrés a nivel central, uno de los más importantes corresponde a los cambios neuroplásticos asociados a la morfología neuronal, atrofia neuronal, en especial de aquellas relacionadas a la neurotransmisión glutamatérgica. Es probable que los mediadores del estrés modifiquen la citoarquitectura neuronal a través de la modulación de cascadas de señalización involucradas en la dinámica de citoesqueleto. Entre éstas, destaca la CRMP2 (del inglés collapsin response mediator protein-2), proteína involucrada en la polimerización de microtúbulos, proceso que determina en etapas temprana del desarrollo la definición axonal. La regulación de esta proteína es diversa e involucra el procesamiento proteolítico dependiente de calcio mediado por calpaínas. La proteína procesada es transportada al núcleo y produce cambios en la sobrevida neuronal por mecanismos no precisados. Adicionalmente, estudios in vitro han demostrado que la CRMP2 pierde la capacidad de unirse a tubulina al ser fosforilada por la GSK3β (Thr-514) produciéndose el colapso del cono de crecimiento neuronal. Los antecedentes descritos sugieren que CRMP2 juega un rol importante en el control de la dinámica del citoesqueleto de microtúbulos, que puede contribuir a mecanismos de plasticidad, y que su acción podría verse afectada por estímulos de diversa naturaleza, como el estrés (agudo y crónico). Sin embargo no existen antecedentes que indiquen el rol ni la localización en neuronas de cerebro adulto y si se regula por fosforilación. En relación a esto último, la sobreactivación de la GSK3β (del inglés glycogen synthase kinase 3β), una serina-treonina quinasa, produce efectos deletéreos asociados a la hiperfosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos y factores transcripcionales que regulan la expresión de genes de neuroprotección. La GSK3β se encuentra constitutivamente activa y es regulada en forma negativa por una fosforilación en su extremo N-terminal (Ser-9). Debido a los efectos que se le atribuyen a esta enzima, se sugiere que participaría en las alteraciones observadas en estrés crónico, sin embargo dicha relación no se ha comprobado experimentalmente. Más aún, in vivo no se ha determinado la asociación entre la actividad de la GSK3β y el estado de fosforilación de la CRMP2. En base a estos antecedentes se propuso la siguiente hipótesis: “El estrés agudo por restricción de movimiento produce cambios en el estado de fosforilación, procesamiento y localización de CRMP2 en hipocampo de rata adulta”. Se utilizaron ratas macho adultas y se sometieron a 2,5 horas de estrés de restricción de movimiento y fueron sacrificadas inmediatamente finalizado el estímulo o luego de 1,5; 24 y 48 horas post estrés. La efectividad del estrés se comprobó por el incremento en el número de heces e incremento en el nivel de corticosterona observado por la aplicación de la restricción. A su vez, mediante inmunowestern blot se determinaron en extractos hipocampales los niveles de la proteína Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein), la que se sintetiza localmente en las dendritas y cuya función es regular la densidad de receptores glutamatérgicos sinápticos. Se observó, luego de 1,5 horas de estrés, una reducción significativa la que se mantuvo luego de 24 horas post estrés; sugiriendo un aumento en la degradación de esta proteína. En contraste, en animales estresados crónicamente durante 14 días y sacrificados 24 horas post estrés, se observó que los niveles de Arc fueron similares al control, sugiriendo que esta respuesta se adapta ante el estrés crónico. Se determinó mediante inmunowestern blot que el estrés no produjo el procesamiento proteolítico de la CRMP2. Por otra parte, luego de 1,5 horas post estrés se observó una disminución significativa en los niveles de CRMP2-P (Thr-514) la cual se reestablece al valor control luego de 24 horas post estrés. Así mismo, los niveles de GSK3β–P (Ser-9) disminuyeron de manera significativa inmediatamente post estrés que se relaciona a un aumento de la actividad y posteriormente se recuperan al valor control. Estos resultados indican que no existe relación entre la actividad de la quinasa con el estado de fosforilación de la CRMP2 y probablemente los cambios promovidos por el estrés involucran otros actores no considerados en esta tesis como las fosfatasas. Por otra parte en muestras de animales crónicamente estresados y sacrificados 24 horas posterior al tratamiento no presentaron cambios respecto al control. Finalmente se evaluó la localización celular de CRMP2-P mediante inmunohistoquímica en distintas zonas y estratos hipocampales. Se determinó que la inmunoreactividad de CRMP2-P es coincidente con la de un marcador de dendritas maduras (MAP2A) y se observó que existe una acumulación nuclear de CRMP2-P a las 24 horas post estrés en el estrato piramidal CA1 y CA3. Esta tesis demuestra por primera vez que el estrés agudo de restricción de movimiento promueve cambios en el estado de fosforilación de la CRMP2 lo que no se correlaciona con la actividad de la GSK3β. Será muy informativo poder precisar cambios en el estado de fosforilación de estas proteínas durante el estrés con el fin de poder definir nuevos actores en estas respuestas. Como por ejemplo, se debe precisar la contribución de otras quinasas y de fosfatasas en asociación a estos cambios. Por otro lado, se demostró en animal adulto que esta proteína tiene una localización dendrítica lo que hace postular un rol en neuronas adultas. Queda por determinar si efectivamente la CRMP2-P se transporta al núcleo en respuesta al estrés agudo. Así mismo se demostró que el estrés crónico produce una adaptabilidad de la fosforilación de CRMP2-P y GSK3β / Stress is a physiological response that allows adaptation and survival and it triggered when an individual feels threatened. This response is specific and involves the activation of numerous neural circuits and the secretion of different humoral mediators depending on the stressor. In the case of psychosocial stress, glucocorticoids and catecholamines are released into the blood stream, promoting changes on gene expression and signal transduction pathways at a central and peripheral level. The brain areas that are sensitive to stress hormones, especially to glucocorticoids, are the hippocampal formation (Ammon’s Horn, CA and dentate gyrus) involved in declarative memory; the amygdala related to fear response, and the frontal cortex associated to working memory. Morphological and biochemical studies have shown that fluctuation on glucocorticoids levels, due to stress or circadian rhythm, are required to promote changes in neuroplasticity in these brain structures, especially in the hippocampus. These neuroplastic changes include variations in morphology, modification on cellular excitability and synaptic efficiency. It has been reported that an increase on glucocorticoid secretion due to an acute stress (one episode) may act as a positive or a negative modulator of memory and learning processes involving the hippocampus. Nevertheless, an excessive activation of the stress response, as to the inability to terminate it properly, may be highly detrimental due to the negative effect of stress on neuroplasticity, specially the hippocampus. One of the most important effects at a central level associated with stress is the neuroplastic changes on neural morphology, mainly neural atrophy, especially those related with glutamatergic neurotransmission. It is possible that stress mediators promote modification of neural cytoarchitecture through the modulation of signal transduction pathways involved in cytoskeleton dynamics. Among these, we highlight CRMP2 (collapsin response mediator protein 2), whose involved on microtubule polymerization, an event that determinates axon specification at early embryonic stages. This protein is regulated by differents mechanisms involving calcium dependent proteolytic cleavage by calpains. The processed protein translocates to the nucleus and promotes changes in neural survival through mechanisms not full understood. In addition, in vitro studies have demonstrated that CRMP2 loses its tubulin binding ability when phosphorylated by GSK3β (Thr-514), provoking neural growth cone collapse. These evidences suggest that CRMP2 plays a pivotal role on cytoskeleton dynamics and can contribute to plasticity mechanisms. Additionally, its function could be affected by different types of stimuli, including acute and chronic stress. However there is no evidence about its function and location in adult brain neurons and neither if CRMP2 is regulated by phosphorylation. Regarding this event, it is known that the over activation of the serin-threonin kinase GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) results in deleterious effects associated with the hyperphosphorylation of microtubule associated proteins and transcription factors involved in gene expression regulation. GSK3β is constitutively active and regulated by an inhibiting phosphorylation in its N-terminal portion (Ser-9). It has been suggested that GSK3β would participate in the alterations observed on chronic stress, based mainly on their targets: Nonetheless, this relationship has not been proved experimentally. Even more, the association between the activity of GSK3β and phosphorylation state of CRMP2 has not been proved in vivo. Based on this evidence the following hypothesis was proposed “acute restraint stress causes changes on the phosphorylation, processing and cellular localization of CRMP2 in adult rat hippocampus” Adult male rat were subjected to a single 2.5 hours restriction stress session and then euthanized immediately after the stimuli or after 1,5; 24 and 48 hours after stress. The effectiveness of the stress model was proved by the increase in the number of feces and corticosterone levels produced by the restriction protocol. Also Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) protein levels where determined on hippocampal extract by inmunowestern blot. This protein is locally synthetized on dendrites and regulates the synaptic density of glutamatergic receptors. There was a significant reduction in Arc levels 1.5 hours post stress, which remained until 24 hours post stress, suggesting an increase in its degradation. In contrast, such a decrease was not observed on chronically stressed animals euthanized 24 post stress, suggesting that this response adapts in chronic stress. In addition we determined by inmunowestern blot that acute restraint stress does not promote CRMP2 cleavage. Also we proved by inmunowestern blot that acute restraint stress decreases the levels of CRMP2-P (Thr-514) at 1.5 hours post stress and the level is reestablished at 24 hours post stress. Likewise GSK3β–P (Ser-9) levels decreased immediately after stress which relates with an increase in its activity, and then return to control levels. These results indicate that there is no relation between the kinase activity and CRMP2 phosphorylation status. These results raise the possibility that changes induced by stress can involve other proteins that were not considered in this Thesis, like phosphatases. We also determined GSK3β–P levels on chronic stressed animals euthanized 24 hours after the last stress session and found no significant changes in comparison to control animals. Finally we determined by immunohistochemistry the location CRMP2-P in different hippocampal zones and stratum from animals euthanized at 0, 1.5; and 24 hours post stress. We determined that CRMP2-P immunoreactivity co-localized with a mature dendrite marker (MAP2A). We also observed that there is a nuclear accumulation of CRMP2-P on stratum pyramidale of CA1 and CA3 24 hours after stress. This thesis shows by the first time that acute restriction stress promote changes in the phosphorylation state of CRMP2 that does not correlates with GSK3β activity. It would be very informative to determine the changes in the phosphorylation state of these proteins during stress to elucidate the role of new actors on this response. For example, the contribution of other kinases and phosphatases to these changes must be elucidated. On other aspect, we show that CRMP2 has a dendritic localization in the adult brain, which denotes a function in adult neurons. It remains to be determined if acute stress effectively promotes CRMP2-P nuclear translocation. Also we demonstrated that chronic stress induces adaptability in the phosphorylation of CRMP2 and GSK3β.

Doctor en Farmacología / Los cambios en la síntesis de ATP mitocondrial pueden afectar el desempeño de células tumorales, debido a que el primer paso de la glicólisis es dependiente del ATP mitocondrial que proviene de la fosforilación oxidativa. En células normales, la cadena transportadora de electrones es responsable del 90% de la síntesis de ATP, y en células tumorales, a pesar de estar disminuida, es responsable de al menos el 50% de los niveles totales de ATP, incluyendo los cánceres más glicolíticos; por lo tanto, la inhibición de la cadena transportadora de electrones mitocondrial se presenta como un importante blanco terapéutico para el cáncer. Bakuchiol (bk) es el componente mayoritario del extracto metanólico de Psoralea glandulosa y de Psoralea corylifolia. Es un meroterpeno liposoluble con propiedades antidiabéticas, bactericidas, hepatoprotectoras y antitumorales, entre otras. De Psoralea glandulosa o Culén (nombre común), se aisló también un derivado catecólico, 3-hidroxibakuchiol (3-OHbk). Hasta el momento, este último ha sido encontrado solamente en Psoralea glandulosa, planta nativa chilena. Este hecho y sus características estructurales lo convierten en un interesante candidato capaz de interferir con el flujo de electrones mitocondrial. 3-OHbk se encuentra descrita solo en Psoralea glandulosa, lo que explicaría la ausencia de trabajos con este compuesto. El objetivo de esta tesis fue evaluar la citotoxicidad in vitro de 3-OHbk en dos modelos de células tumorales, adenocarcinoma mamario de ratón (TA3) y leucemia linfoblástica aguda humana (CCRF-CEM), y además, relacionar el efecto citotóxico con la efecto inhibitorio de esta molécula sobre la cadena transportadora de electrones mitocondrial de células cancerosas. Para ello se evaluó la actividad citotóxica de 3-OHbk, bk y un derivado acetilado de 3-OHbk (3-OHbk-DA). Se determinó el efecto de estas tres moléculas sobre la proliferación de cuatro líneas celulares cancerosas: la línea TA3, su derivada multirresistente a fármacos antineoplásicos (TA3-MTX-R) células CCRF-CEM y su línea derivada resistente a camptotecina y derivados (CEM/C2). De las 3 moléculas evaluadas, 3-OHbk y 3-OHbk-DA presentaron la mayor actividad antiproliferativa en las cuatro líneas tumorales. Para determinar si este efecto antiproliferativo estaba relacionado con algún efecto sobre la cadena transportadora de electrones mitocondrial, se determinó el efecto de las dos moléculas seleccionadas sobre el consumo de oxígeno de células TA3. Solo 3-OHbk fue capaz de inhibir el consumo de oxígeno, mientras que su derivado di-acetilado no presentó actividad en este sistema. Se determinó el sitio de la cadena transportadora de electrones sobre el cual 3-OHbk ejerció su acción inhibitoria, y el efecto de esta molécula sobre la función mitocondrial de células TA3. 3-OHbk actúa en el complejo I de la cadena transportadora de electrones, disminuyendo la velocidad de oxidación de NADH, provocando una disminución del potencial de transmembrana mitocondrial, la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) y una disminución de la concentración de ATP intracelular total. Además indujo muerte celular, induciendo la activación de caspasa 3 y la fragmentación del DNA nuclear, fenómenos característicos de una muerte celular del tipo apoptótico. La inhibición de la proliferación y la muerte celular se observó sólo en las células cancerosas humanas y de ratón, y fue significativamente menoren dos modelos celulares considerados normales (la línea celular murina MM3MG y las células mononucleares de sangre periférica humana PBMC) Es sabido que diversos inhibidores del complejo I de la cadena transportadora de electrones inducen la muerte celular debido a la generación de ROS, por este motivo, debido a que es capaz de inhibir el complejo I, se estudió la capacidad de 3-OHbk para generar especies reactivas del oxígeno a través de la medición de la oxidación de DCFDA. Sin embargo, no se observó este fenómeno. Cuando se utilizó un sustrato sintético que revierte la inhibición del consumo de oxígeno, entregando electrones directamente al complejo III de la cadena transportadora de electrones, la muerte celular de las células TA3 fue casi completamente prevenida. Este resultado sugiere que la muerte celular está provocada directamente por la disminución del consumo de oxígeno por la inhibición del complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, que es un sistema deficiente pero esencial en células tumorales, y no por la generación de ROS, lo cual podría presentar una serie de ventajas para el tratamiento de esta enfermedad. / Changes in mitochondrial ATP synthesis can affect the performance of tumor cells due to the dependence of the first step of glycolysis on mitochondrial ATP. The mitochondrial electron transport chain (ETC) is responsible for the synthesis of approximately 90% of ATP in normal cells and up to 50% in most glycolytic cancers; therefore, the inhibition of ETC emerges as an interesting therapeutic target. Here, we studied the effect of a lipophilic isoprenylated catechol, 3-hydroxybakuchiol (3-OHbk) and bakuchiol (bk) isolated from Psoralea glandulosa, and an di-acetylated 3-OHbk (3-OHbk-DA) on several tumor cell mitochondrial functions. We expect 3-OHbk and its analogues to kill tumor cells by inhibiting the electron transport chain and decreasing the intracellular concentration of ATP. The effect of these three molecules on the proliferation of four cell lines: mouse mammary adenocarcinoma cell line TA3 and its derivative multi-drug resistant cell line TA3-MTX-R, and human acute lymphoblastic leukemia cell line CCRF-CEM and camptothecin-resistant derivative and derivatives CEM/C2 was evaluated. 3-OHbk and 3-OHbk-DA showed the highest antiproliferative activity on all four cell lines, and were selected as potential inhibitors of mitochondrial electron transport chain in TA3 cells. However, 3-OHbk showed inhibitory activity of the electron transport chain, while its di-acetylated derivative showed no activity in this system, therefore, the site of the electron transport chain which 3-OHbk on exerts its inhibitory action was determined, with other mitochondrial metabolism and cell death parameters. We found that this molecule acts on complex I of the electron transport chain, decreasing the mitochondrial transmembrane potential, opening the mitochondrial permeability transition pore (MPTP), decreasing the intracellular ATP concentration and cell death, inducing the activation of caspase 3 and nuclear DNA fragmentation, a characteristic phenomenon of apoptotic cell death. In addition, the capability of 3-OHbk to generate reactive oxygen species was assessed by measuring the oxidation of DCFDA. This, however, was not observed. When a synthetic substrate, which reverses inhibition of oxygen consumption delivering electrons directly to complex III of the electron transport chain, was added to TA3 cells, cell death was almost completely prevented. This might indicate that cell death is caused directly by the decrease in oxygen consumption by the inhibition of complex I of mitochondrial electron transport chain, an essential system in tumor cells, suggesting a new mechanism to attack cancer cells. / Fondecyt

El objetivo general de este trabajo de Tesis fue profundizar el conocimiento de las proteínas Epac como reguladores de la función miocárdica. En particular, nos centramos en conocer la participación de Epac en la activación de CaMKII y la consiguiente fosforilación de sus sustratos en el RS, involucrados en el manejo del Ca⁺² intracelular asociado a la función contráctil. Los objetivos específicos fueron: 1) Estudiar los efectos de la activación de Epac sobre el manejo de Ca⁺² intracelular y la contractilidad en miocitos cardíacos en diferentes especies y bajo diferentes condiciones experimentales (variaciones de la [Ca⁺²]o). 2) Evaluar el efecto de la activación de Epac sobre el contenido y la pérdida espontánea de Ca+2 del RS en las distintas condiciones experimentales utilizadas. 3) Examinar el impacto de la estimulación de Epac sobre la función diastólica y la aparición de arritmias en dos modelos experimentales: miocitos aislados y corazón aislado y perfundido. 4) Estudiar las vías de señalización de Epac y la importancia de la activación de CaMKII como mecanismo mediador de los efectos de Epac en el miocardio. 5) Disecar la participación de la fosforilación dependiente de CaMKII de PLN y del RyR2 en los efectos de Epac sobre la respuesta contráctil y la generación de arritmias a través del uso de ratones TG. 6) Identificar y estudiar la distribución subcelular de las proteínas Epac1 y Epac2 en el miocardio no estimulado y luego de su estimulación con el activador específico 8-CPT.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El RS es el compartimiento intracelular responsable de la regulación del Ca+2 en las células cardíacas de los mamíferos. En él se ubican las proteínas RyR2, SERCA2a y PLB, responsables de la regulación de la salida y entrada de Ca+2 desde este compartimiento, lo que posibilita la contracción y la relajación del músculo cardíaco. Estas proteínas se regulan mediante fosforilación y desfosforilación de algunos de sus aminoácidos, entre los que se encuentran la Ser2809 y la Ser2815 en el RyR2; la Ser38 en la SERCA 2a y la Ser16 y la Thr17 en el PLB. Se ha desarrollado un modelo de precondicionamiento por taquicardia eléctrica que disminuye el tamaño del infarto producido por una isquemia prolongada. La taquicardia eléctrica aumenta la actividad de las proteínas responsables de la regulación del Ca+2. Aunque las bases moleculares de este aumento de actividad no se conocen, estos pueden deberse a cambios en su fosforilación. Hasta el momento, la fosforilación de los aminoácidos mencionados solo puede detectarse con anticuerpos específicos. En este trabajo se evaluó un método de tinción para proteínas fosforiladas y proteínas totales, el cual permitiría conocer la fosforilación de las proteínas en estudio, sin la necesidad de saber específicamente cuales son todos los sitios de fosforilación de cada una de ellas. Los resultados se compararon con los obtenidos mediante la técnica de Western blot con anticuerpos comerciales para los sitios de fosforilación conocidos. Encontramos que la tinción para proteínas fosforiladas y proteínas totales no tiene la sensibilidad necesaria como para determinar cambios entre las condiciones basales y de taquicardia. La detección de fosforilación en Western blots con los anticuerpos comerciales disponibles, demostraron un aumento de la fosforilación del RyR2 en la Ser2809, así como también en el 8 PLB en la Thr17, lo que sugiere que el modelo de precondicionamiento cardíaco, mediado por taquicardia eléctrica, aumentaría tanto la velocidad de liberación Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático a través de los RyR2, como de su recaptación mediante la acción de la SERCA2a

Tesis para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer corresponde a la segunda causa de muerte en Chile y el mundo, pero los pacientes con cáncer no mueren debido al crecimiento del tumor primario, sino a la diseminación de las células tumorales y posterior colonización de éstas en nuevos órganos o metástasis. En términos generales, el cáncer es la consecuencia de un proceso multifactorial que lleva a la transformación progresiva de células normales en células altamente malignas. La amplia variedad de fenotipos del cáncer se debe a la manifestación de alteraciones esenciales en la fisiología celular, las que colectivamente dictaminan el crecimiento maligno. Dos de las características adquiridas por las células tumorales en las que se enfocará esta tesis son; la invasión de tejidos y metástasis y la reprogramación del metabolismo energético. Caveolina-1 es una proteína integral de membrana a la que se le ha atribuido un rol dual en la progresión tumoral, actuando como supresor de tumores, ya que la disminución de la expresión de caveolina-1 es suficiente para revertir el fenotipo transformado, o como promotor de metástasis en estadios tardíos del cáncer, donde la expresión de caveolina-1 aumenta sin revertir el fenotipo maligno y se correlaciona con un aumento en la migración celular y metástasis, multiresistencia a drogas y una mala prognosis para el paciente. Ambos roles de caveolina-1 se ven afectados por la presencia de la glicoproteína Ecadherina, la cual potencia su acción supresora de tumores y suprime la habilidad de caveolina-1 para promover metástasis in vivo. Sin embargo, el mecanismo por el cual E-cadherina suprime la habilidad de caveolina-1 para promover la metástasis no ha sido estudiado. La habilidad de caveolina-1 para promover un aumento en la migración en células metastásicas se relaciona con un aumento en la activación de Rab-5 y Rac-1. Ya que la reprogramación del metabolismo energético de las células, suple tanto las necesidades bioenergéticas como biosintéticas de las células cancerígenas para sostener una proliferación aumentada y una rápida migración e invasión celular, en este proyecto se caracterizó el fenotipo metabólico de las células metastásicas que expresan o no, caveolina-1 y estudiamos cómo la expresión de E-cadherina afecta el metabolismo. Caveolina-1 sufre modificaciones post-traduccionales que participan en su función intracelular, como la fosforilación en el residuo de tirosina 14 (Y14), mediada por las proteínas tirosina quinasas no receptoras Src, Fyn y Abl en respuesta a varios estímulos como. En células metastásicas de cáncer de mama, se observan altos niveles de expresión de caveolina-1 y un alto grado de fosforilación de ésta en Y14, lo que promueve un aumento en la migración celular por un aumento en el recambio de la adhesiones focales, polarización, velocidad persistencia y direccionalidad de la migración. Todas estas funciones de caveolina-1 son bloqueadas por la inhibición de la fosforilación de caveolina- 1 en Y14 tanto de manera farmacológica como por la utilización de una caveolina-1 que no es fosforilable (Y14F). Por lo tanto, el rol promotor de metástasis de caveolina-1, dependería de su fosforilación en Y14. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipita con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y PTPN14 en células de melanoma murino e induce una disminución en la migración, formación de colonias y crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de colon. Estos antecedentes nos llevaron a proponer la siguiente hipótesis: En presencia de E-cadherina se recluta a la fosfatasa PTPN14 al complejo multiproteíco formado con caveolina-1 lo que reduce la habilidad promotora de migración y metástasis de caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de ésta en tirosina 14. El objetivo principal de esta tesis es determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la fosforilación en tirosina de caveolina-1 (Y14) y β-catenina (Y654) y la migración e invasión celular en células cancerígenas. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre los niveles de fosforilación en tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina y la migración e invasión celular; (2) Estudiar la participación de Src en la fosforilación en tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina en presencia y ausencia de E-cadherina; (3) Determinar si los complejos proteicos formados con caveolina-1 en presencia de E-cadherina contienen PTPN14, la que contribuye a la desfosforilación de caveolina-1 en tirosina 14; (4) Determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la activación de Rab-5 y Rac-1; (5) Caracterización de los cambios metabólicos inducidos por la expresión caveolina-1 y la variación de éstos por la co-expresión con Ecadherina. Para el desarrollo de los objetivos mencionados se utilizaron líneas celulares metastásicas en las que se co-expresan caveolina-1 y E-cadherina. Se realizó ensayos de Western de blot, luego de ensayos de multiherida para determinar los niveles de fosforilación de caveolina-1 en Y14 y β-catenina en Y654, ensayos de migración por transwell, ensayos de invasión, ensayos de precipitación por afinidad para determinar la actividad de Rab-5 y Rac1 en células que expresan caveolina-1 en presencia o en ausencia de E-cadherina. Además, se caracterizaron los complejos multiproteícos formados por caveolina-1, mediante ensayos de inmunoprecipitación y espectrometría de masa en células que expresan o no E-cadherina y se caracterizó el fenotipo metabólico de células que expresan o no caveolina-1, estudiando cómo cambia éste en presencia de E-cadherina. En resumen en esta tesis se buscó dilucidar el mecanismo mediante el cual Ecadherina reduce la habilidad promotora de migración, invasión y metástasis de caveolina-1 en células de cáncer metastásicas. En este trabajo mostramos que la expresión de E-cadherina inhibe el aumento en la migración, invasión y metástasis inducido por caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de caveolina-1 en Y14, además, de bloquear la activación del eje Rab-5/Rac1. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipitó con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y su expresión fue capaz de inhibir el rol promotor de migración, invasión y metástasis de caveolina-1. Finalmente mostramos que la expresión y fosforilación de caveolina-1 induce un switch metabólico a un fenotipo glicolítico aeróbico por el bloqueo del complejo mitocondrial IV, generando cambios en el metaboloma de las células metastásicas congruentes con este switch metabólico. La expresión de Ecadherina bloquea el cambio metabólico inducido por caveolina-1 llevando a las células a un metabolismo quiescente / Cancer is the second leading cause of death in Chile and in the world. Cancer patients do not die due to the primary tumor growth, but rather due to the spread of the cancer cells from the primary tumor and subsequent colonization of new organs, a process known as metastasis. In general terms, cancer is the result of a multifactorial process that leads to the progressive transformation of normal cells into highly malignant cells. The wide variety of cancer phenotypes is due to alterations in cell physiology that collectively lead to the malignant cell behavior. Two of the characteristics acquired by tumor cells, on which this thesis will focus, are tissue invasion, as well as metastasis and reprogramming of energy metabolism. Caveolin-1 is a membrane protein that has been attributed a dual role in cancer progression, acting at early stages as a tumor suppressor given that augmenting the expression of caveolin-1 is sufficient to reverse the transformed phenotype, or as a promoter of metastasis in late stages of cancer, where enhanced expression of caveolin-1 favors the malignant phenotype and correlates with an increase in cell migration and metastasis, multidrug resistance and poor prognosis of the patients. Both roles of caveolin-1 are affected by the presence of the glycoprotein E-cadherin, which enhances caveolin-1 function as a tumor suppressor and suppresses the ability of caveolin-1 to promote metastasis in vivo. However, the precise mechanism by which E-cadherin suppresses the malignant traits of caveolin-1 is unknown. The ability of caveolin-1 to promote migration of metastatic cells is associated with increased activation of Rab-5 and Rac-1. Bearing in mind that the reprogramming of energy metabolism in cancer cells, is required to supplement both the both the bioenergetic and biosynthetic needs of these cells to sustain increased proliferation, rapid migration and cell invasion, this thesis also evaluated the metabolism of metastatic cells expressing or not caveolin-1 and how this was affected by the expression of E-cadherin. Caveolin-1 is subjected to posttranslational modifications relevant to protein function, such as phosphorylation on tyrosine 14 (Y14), by the non-receptors protein tyrosine kinases non-receptor Src, Fyn and Abl. This may occur in response to a large variety of different stimulus. In metastatic breast cancer cells, high levels of caveolin-1 expression and phosphorylation on Y14 are observed and associated with increased cell migration by promoting focal adhesion turnover, polarization, persistence, speed and directionality of migration. All these functions of caveolin-1 are blocked by inhibition of caveolin- 1 phosphorylation on Y14 either pharmacologically or by introducing a nonphosphorylatable caveolin-1 (Y14F) mutation. Therefore, the metastasis promoting role of caveolin-1 depends on Y14 phosphorylation. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of Ecadherin and PTPN14 in murine melanoma cells and decreased migration, colony formation and anchorage-independent growth of colon cancer cells. These results available in the literature led us to propose that in the presence of E-cadherin PTPN14 is recruited to the multiprotein complex including caveolin-1 to reduce Y14 phosphorylation, cell migration and metastasis induced by caveolin-1. The main objective of this thesis was to determine the effect of co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on tyrosine phosphorylation of caveolin-1 (Y14) and β-catenin (Y654), as well as migration and invasion in cancer cells. To address the working hypothesis the following specific objectives were evaluated: (1) To determine the effect of the co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on the levels of tyrosine phosphorylation 14 of caveolin-1 and on tyrosine 654 of β catenin and migration and cell invasion; (2) To study participation of Src in the phosphorylation of the tyrosine 14 of caveolin-1 and on tyrosine β-catenin 654 in the presence and absence of E-cadherin; (3) To determine whether the protein complexes formed with caveolin-1 in the presence of E-cadherin contain PTPN14, and if this phosphatase contributes to dephosphorylation of tyrosine 14 of caveolin-1; (4) To determine the effect of coexpression of caveolin-1 and E-cadherin on the activation of Rab-5 and Rac-1; (5) To characterization of the metabolic changes induced by caveolin-1 expression and the effect of the co-expression with E-cadherin on cell metabolism. To address these objectives metastatic cell lines that co-expressed caveolin-1 and E-cadherin were used. Multiple wounding assays and Western blot analysis was used to determine the phosphorylation levels of caveolin-1 on Y14 and β-catenin on Y654 moreover migration assays, invasion assays, affinity precipitation assays were employed to determine the activity of Rab-5 and Rac1 in cells expressing caveolin-1 in the presence or absence of E-cadherin. Furthermore, protein composition the analysis of the multiprotein complex formed by caveolin-1 and E-cadherin was evaluated following immunoprecipitation assays by mass spectrometry analysis. The metabolic phenotype of cells expressing or not caveolin-1 was characterized using Seahorse extracellular analyzer and metabolic changes in presence of Ecadherin were determined. In summary, this thesis sought to elucidate the mechanism by which E-cadherin reduces the ability of caveolin-1 to promote migration, invasion and metastasis as well as metabolic reprograming of metastatic cancer cells. In this study, we show that the expression of E-cadherin prevented caveolin-1- enhanced migration, invasion and metastasis by reducing caveolin-1 phosphorylation on Y14 and, as a consequence, blocking of the activation of the Rab-5/Rac-1 signaling axis. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of E-cadherin and overexpression or this phosphatase was sufficient to prevent the migration, invasion and metastasis promoting role of caveolin-1, even in the absence of E-cadherin. Finally we show that the expression caveolin-1 induced a metabolic switch to an aerobic glycolytic phenotype, likely by blocking the mitochondrial complex IV. These effects coincided in metastatic melanoma cells with changes in the metabolome. Moreover, the expression of E-cadherin blocked the metabolic changes induced by caveolin-1 leading to a quiescent metabolic phenotype in metastatic cells / Conicyt-FONDAP; Fondecyt ; Anillo ACT / 31 de diciembre de 2018

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[EN] Any living cell needs to maintain adequate levels of nutrients and ions to ensure the continuity of its functions. The first step in the maintenance of both ion and nutrient homeostasis is their uptake from the extrenal environment, where plasma membrane transporter proteins play an important role. The regulation of both the activity and abundance of permeases in the plasma membrane is a pivotal aspect of the cellular response to different environmental conditions. Therefore, deciphering the pathways that regulate the function or the presence of these transport proteins is important for a better understanding of cell physiology and stress responses. Transcriptional regulation is a contributor to the control of the abundance of plasma membrane transporters, and more specifically in the yeast model Saccharomyces cerevisiae a strong transcriptional regulation of the hexose transporters has been demonstrated. However, there are other important levels for the control and maintenance of glucose homeostasis, such as post-translational regulation of glucose transporters, which are still being defined. Ubiquitination, as a signal for endocytosis of membrane proteins, mediated by the E3 ubiquitin ligase Rsp5 has been demonstrated for many transporters, including the HXT family. In recent years, several studies have shown the involvement of the ART protein family (Arrestin-Releated Trafficking proteins) in this process, acting as adapters for Rsp5 and providing specificity to the ubiquitination of permeases in response to changes in environmental conditions. In turn, the members of this family of adapter proteins are targets of post-translational modifications, such as phosphorylation or ubiquitination, affecting their activity and adding an additional level in the regulation of transporter interactions. Previous studies have demonstrated the existence of a genetic interaction between the high affinity glucose transporter Hxt6 and the Rsp5 adapter protein, Rod1 (Art4). In turn, the Snf1 kinase was shown to be involved in the phosphorylation of this adapter protein, suggesting a possible role in the regulation of its activity. With this background, and taking into consideration the interaction of 14-3-3 proteins with other adapter proteins, in this study the biochemical characterization of the Art4-Snf1-14-3-3 signaling pathway involved in the regulation of the endocytosis of the glucose transporter Hxt6 and the effect of Snf1 and 14-3-3 proteins (Bmh2) on intracellular traffic of the Hxt6-Art4 complex will be investigated. Similarly, the effect of Art4, and its paralogue Rog3 (Art7), on Hxt6 levels and the phenotypes of other glucose transporter mutants, such as hxt1 and hxt3 will be analyzed to determine whetherthese transporters display a common regulatory mechanism also involving Art4 and Art7. In short, this thesis aims to provide new data on the post-translational regulation of the HXT transporters through the Rsp5 adapter family of ART proteins, with emphasis on biochemical aspects, such as phosphorylation, and molecular and cellular aspects, such as intracellular trafficking and permease stability / [ES] Cualquier célula viva necesita mantener niveles adecuados de iones y nutrientes para asegurar la continuidad de sus funciones. El primer paso en la conservación de la homeostasis de iones como el potasio o nutrientes como la glucosa, es la toma de los mismos desde el medio externo, teniendo los transportadores de membrana un papel básico en este proceso. La regulación de estos transportadores tiene una función fundamental en la respuesta de las células a diferentes condiciones ambientales, siendo esenciales tanto la modulación de su actividad como la abundancia de permeasas en la membrana plasmática. Por esto, el estudio de las rutas que regulan la función o la presencia de dichos transportadores en la membrana plasmática es importante para un mejor conocimiento de la fisiología celular y la respuesta de las células al estrés. La regulación transcripcional supone un nivel importante en el control de la abundancia de transportadores en la membrana plasmática, y más concretamente en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae se ha demostrado que los transportadores de hexosas poseen una fuerte regulación a nivel transcripcional. Sin embargo, existen otros niveles importantes para el control y el mantenimiento de la homeóstasis de hexosas, como la regulación postraduccional, y que en el caso de los transportadores de glucosa es menos conocida. La ubiquitinación como señal para la endocitosis de proteínas de membrana a través de la E3 ubiquitín ligasa Rsp5 ha sido demostrada para gran número de transportadores, incluidos los de la familia HXT. En los últimos años, varios estudios han demostrado la implicación de la familia de proteínas ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este proceso, actuando como adaptadores de Rsp5 y aportando especificidad a la ubiquitinación de transportadores en respuesta a cambios en las condiciones del medio. A su vez, esta familia de proteínas adaptadoras es diana de modificaciones postraduccionales, como la ubiquitinación o la fosforilación, que repercuten en su actividad y suman un nivel adicional en la regulación de los transportadores con los que interaccionan. Estudios anteriores demostraron la existencia de una interacción genética entre el transportador de glucosa de alta afinidad Hxt6 y la proteína adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). A su vez, la quinasa Snf1 fue implicada en la fosforilación de esta proteína adaptadora, sugiriendo una posible función en la regulación de su actividad. Con estos precedentes, y teniendo en consideración la interacción de las proteínas 14-3-3 con otras proteínas adaptadoras, en el presente estudio se llevará a cabo la caracterización bioquímica de la ruta de señalización Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulación por endocitosis del transportador de glucosa Hxt6 y se estudiará el efecto de Snf1 y las proteínas 14-3-3 (Bmh2) sobre el tráfico intracelular del complejo Hxt6-Art4. Del mismo modo, se analizará el efecto de Art4, y de su parálogo Rog3 (Art7), sobre los niveles de Hxt6 y se caracterizarán los fenotipos de mutantes para otros transportadores de glucosa, como Hxt1 y Hxt3, por la posibilidad de que presenten un mecanismo regulador común que implique también a Art4 y Art7. En definitiva, la presente tesis doctoral pretende aportar nuevos datos acerca de la regulación postraduccional de transportadores de la familia HXT a través de las proteínas ART, adaptadoras de Rsp5, haciendo hincapié en aspectos bioquímicos como la fosforilación y la ubiquitinación, y en aspectos moleculares y celulares, como el tráfico intracelular o la estabilidad de permeasas. / [CAT] Qualsevol cèl-lula viva necessita mantindre nivells adequats d'ions i nutrients per tal d'assegurar la continuïtat de les seues funcions. El primer pas en la conservació de l'homeòstasi d'ions com el potassi o nutrients com la glucosa, és la pressa dels mateixos des del medi extern, tot i tenint els transportadors de membrana un paper bàsic en este procés. De manera directa, la regulació d'aquests transportadors té una funció fonamental en la resposta de les cèl-lules a diferents condicions ambientals, tot i sent processos essencials tant la modulació de la seua activitat com l'abundància de permeases a la membrana plasmàtica. Per això, entendre les rutes que regulen la funció o la presència dels transportadors a la membrana és important per a un millor coneixement de la fisiologia cel-lular i la resposta a l'estrés. La regulació transcripcional suposa un nivell important en el control de l'abundància de transportadors a la membrana plasmàtica, i més concretament en el rent model Saccharomyces cerevisiae s'ha demostrat que les permeases d'hexoses tenen una forta regulació a nivell transcripcional. A banda d'aquest tipus de regulació, existeixen altres nivells importants per al control i el manteniment de l'homeòstasi de la glucosa, com la regulació postraduccional, i , que en el cas dels transportadors de glucosa, és menys coneguda. L'ubiquitinació com a senyal per a l'endocitosi de proteïnes de membrana a través de l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, ha sigut demostrada per a un gran nombre de transportadors, inclosos els de la família HXT. En els últims anys, diversos estudis han posat de manifest la implicació de la família de proteïnes ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este procés, tot i actuant com adaptadores de Rsp5 i aportant especificitat a l'ubiquitinació de transportadors en resposta a canvis en les condicions del medi. Al mateix temps, aquesta família de proteïnes és diana de modificacions postraduccionals, com l'ubiquitinació o la fosforilació, que tenen un efecte en la seua activitat i sumen un nivell addicional a la regulació dels transportadors amb els quals interaccionen. Estudis anteriors demostraren l'existència d'una interacció genètica entre el transportador de glucosa d'alta afinitat Hxt6 i la proteïna adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). De la mateixa manera, la quinasa Snf1 va ser involucrada en la fosforilació d'aquesta proteïna adaptadora, tot i suggerint una possible funció en la regulació de la seua activitat. Amb estos precedents, i tenint en compte la interacció de les proteïnes 14-3-3 amb altres proteïnes adaptadores, en el present estudi es durà a terme la caracterització bioquímica de la ruta de senyalització Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulació per endocitosi del transportador de glucosa Hxt6, i s'estudiarà l'efecte de Snf1 i les proteïnes 14-3-3 (Bmh2) sobre el tràfic intracel-lular del complex Hxt6-Art4. Per altra banda, s'analitzarà l'efecte de Art4, i del seu paràleg Rog3 (Art7), sobre els nivells de Hxt6 i es caracteritzaran els fenotips de mutants per a altres transportadors de glucosa, tals com Hxt1 i Hxt3, per la possibilitat que presenten un mecanisme regulador comú que també implique a Art4 i Art7. En definitiva, la present tesi doctoral pretén aportar noves dades al voltant de la regulació postraduccional dels transportadors de la família HXT a través de les proteïnes ART, adaptadores de Rsp5, tot i aprofundint en aspectes bioquímics com la fosforilació i l'ubiquitinació, i en aspectes moleculars i cel-lulars, com el tràfic intracel-lular o l'estabilitat de permeases / Llopis Torregrosa, V. (2016). Mecanismos de regulación de transportadores de iones y nutrientes a través de proteínas de tráfico relacionadas con las arrestinas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/60149 / TESIS

La supervivencia de los organismos superiores depende de que sus células se organicen y actúen de manera sincronizada para cumplir funciones específicas, para lo cual es fundamental la comunicación intercelular. Este proceso es básico para la vida de todas las células, pero es la razón de ser en las neuronas que están especializadas en recibir información, procesarla y comunicarla a otras células. En el sistema nervioso, la principal forma de comunicación se realiza a través de la sinapsis química, en la que una neurona libera un mensajero químico, el neurotransmisor, que es reconocido por un receptor presente en otra célula permitiéndole responder al mensaje. La acetilcolina es uno de los principales neurotransmisores utilizados por las neuronas, y sus receptores, tanto metabotrópicos como ionotrópicos, están expresados en muchos tipos celulares. Los receptores ionotrópicos de acetilcolina, llamados receptores nicotínicos, son canales catiónicos pentaméricos que pertenecen a la familia de receptores Cys-loop. El receptor nicotínico de acetilcolina α7 es un homopentámero que exhibe propiedades funcionales particulares fundamentales para su rol neuromodulador, incluyendo la elevada permeabilidad al Ca2+ y la capacidad para transformar respuestas ionotrópicas transitorias en eventos más sostenidos de señalización metabotrópica. Es uno de los receptores nicotínicos más abundantes en el sistema nervioso, aunque también se encuentra presente en otros tejidos. En el sistema nervioso central cumple un rol importante en procesos de cognición, atención y memoria, al regular la liberación de neurotransmisores, mediar la transmisión sináptica rápida y modular la excitabilidad neuronal. Una disminución de su actividad se ha asociado con diversos desórdenes neurológicos y neurodegenerativos, incluyendo esquizofrenia, autismo y enfermedad de Alzheimer. El receptor α7 también se expresa en células no neuronales, tales como -entre otras-, los astrocitos, la microglía, los linfocitos B y T, las células epiteliales, los macrófagos, cumpliendo un rol importante en inmunidad, inflamación y neuroprotección. Las acciones neuromoduladoras, neuroprotectoras y antinflamatorias sistémicas del receptor nicotínico de acetilcolina α7 junto a sus propiedades únicas de activación, desensibilización, permeabilidad al Ca2+ y rol dual ionotrópico-metabotrópico, lo han convertido en un blanco farmacológico emergente muy importante en diversos desórdenes neurológicos, neurodegenerativos e inflamatorios. Este trabajo de tesis se basó en el estudio de los aspectos moleculares relacionados a diferentes tipos de modulación de las funciones ionotrópicas y metabotrópicas del receptor nicotínico de acetilcolina α7 humano. Para ello se utilizaron principalmente técnicas electrofisiológicas a nivel de canal único y de corrientes macroscópicas, en conjunto con análisis de proteínas por western blot y ensayos de movimiento de Ca2+ intracelular. El capítulo I se centró en el estudio de la modulación de las funciones ionotrópicas y metabotrópicas del receptor α7 por eventos de fosforilación/desfosforilación. Se demostró que favorecer el estado desfosforilado de las tirosinas del dominio intracelular de α7 potencia la actividad ionotrópica del receptor. A nivel de corrientes unitarias, el efecto potenciador involucró un aumento en la frecuencia y duración de los episodios de activación, mientras que a nivel de corrientes macroscópicas se manifestó por una disminución en la velocidad de decaimiento de la corriente, y un aumento en la tasa de recuperación desde el estado desensibilizado. Por el contrario, la desfosforilación de las tirosinas tuvo un efecto negativo en la actividad metabotrópica del receptor, estudiada por western blot a partir de la vía de ERK 1/2. Además, a diferencia de lo observado para las tirosinas, las alteraciones en el estado de fosforilación de serinas y treoninas del dominio intracelular no ocasionaron cambios importantes en la actividad ionotrópica de α7 en las condiciones experimentales aquí utilizadas. En síntesis, los resultados presentados en este capítulo ponen en evidencia que la fosforilación de las tirosinas, si bien es absolutamente necesaria para la actividad metabotrópica de α7 mediada por la vía ERK 1/2, actúa como un modulador negativo de la actividad ionotrópica del receptor. El capítulo II abordó el estudio de la asociación funcional entre un fragmento peptídico de la glicoproteína S del SARS-CoV-2 (Y674-R685) y el receptor nicotínico de acetilcolina α7 humano. La asociación entre SARS-CoV-2 y los receptores nicotínicos fue propuesta en forma de hipótesis al comienzo de la pandemia. Más adelante, simulaciones de dinámica molecular mostraron que el fragmento Y674-R685 no solo tiene afinidad por α7, sino que penetra profundamente en el bolsillo de unión a agonista del receptor. En este capítulo, en primer lugar, se demostró que el fragmento Y674-R685 actúa como un agonista silente de α7, ya que es capaz de provocar corrientes unitarias y macroscópicas del receptor, pero solo en presencia de un modulador alostérico positivo. Por otro lado, se demostró que Y674-R685 también ejerce una modulación negativa de α7, que se evidenció por una profunda disminución, dependiente de la concentración, en la duración de los episodios de activación de los canales potenciados y en la amplitud de las respuestas macroscópicas provocadas por la acetilcolina. De esta manera, utilizando distintos enfoques electrofisiológicos, se develó la existencia de una interacción funcional entre el fragmento Y674-R685 de la glicoproteína S del SARS-CoV-2 y el receptor α7 que proporciona las bases moleculares para seguir explorando la participación de los receptores nicotínicos en la fisiopatología de la COVID-19. El capítulo III se basó en el estudio del receptor α7 como blanco del cannabidiol, lo cual resulta de gran interés debido al uso expandido de este fitocannabinoide para tratar diferentes condiciones patológicas gracias a sus propiedades terapéuticas y a la ausencia de efectos psicoactivos. Para ello se exploró el efecto del cannabidiol en las funciones ionotrópicas y metabotrópicas de α7 mediante técnicas electrofisiológicas y ensayos de movimiento de Ca2+ intracelular. En lo que respecta a las funciones ionotrópicas, se demostró que el cannabidiol produce una rápida disminución de la actividad del canal a nivel de corrientes unitarias evidenciada por la reducción en la frecuencia de los episodios de activación. Este efecto fue dependiente de la concentración y se dio con una CI50 en el rango submicromolar, lo que indica una potente modulación negativa. Por otra parte, el cannabidiol también produjo una modulación negativa en la función metabotrópica de α7 que se evidenció por una marcada disminución en las respuestas de Ca2+ intracelular tras la activación del receptor. Estos resultados demuestran que el cannabidiol ejerce una modulación negativa de α7 de relevancia farmacológica que debe tenerse en cuenta a la hora de evaluar los posibles usos terapéuticos del fitocannabinoide. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis amplían el entendimiento de los aspectos moleculares relacionados con la modulación de las funciones ionotrópicas y metabotrópicas del receptor nicotínico de acetilcolina α7 en distintas condiciones, a saber, fisiológicas (eventos de fosforilación/desfosforilación), patológicas (fragmento peptídico derivado de la glicoproteína S del SARS-CoV-2) y terapéuticas (cannabidiol). / The survival of higher organisms depends on the ability of their cells to be well organized and to behave in a synchronized manner to fulfill specific functions for which intercellular communication is of pivotal importance. This process is basic for the life of all cells, but it is the raison d'être in neurons that are specialized in receiving information, processing it, and communicating it to other cells. In the nervous system, the main form of communication is carried out via the chemical synapse, in which a neuron releases a chemical messenger, the neurotransmitter, which is identified by a receptor present in another cell, allowing it to respond to the message. Acetylcholine is one of the main neurotransmitters used by neurons, and its receptors, both metabotropic and ionotropic, are expressed in many cell types. Ionotropic acetylcholine receptors, called nicotinic receptors, are pentameric cation channels belonging to the Cys-loop receptor family. The α7 nicotinic acetylcholine receptor is a homopentamer with particular functional properties critical to its neuromodulatory role, including high Ca2+ permeability and the ability to transform transient ionotropic responses into more sustained metabotropic signaling events. It is one of the most abundant nicotinic receptors in the nervous system, although it is also present in other tissues. In the central nervous system, it plays an important role in cognition, attention, and memory, by regulating the release of neurotransmitters, mediating rapid synaptic transmission, and modulating neuronal excitability. A decrease in α7 activity has been associated with various neurological and neurodegenerative disorders, such as schizophrenia, autism, and Alzheimer's disease. The α7 receptor is also expressed in non-neuronal cells; namely, astrocytes, microglia, B and T lymphocytes, epithelial cells, and macrophages, and plays an important role in immunity, inflammation, and neuroprotection. The neuromodulatory, neuroprotective, and systemic anti-inflammatory actions of α7, together with its unique activating, desensitizing, Ca2+ permeability, and dual ionotropic-metabotropic properties, have made the receptor a very important emerging drug target in various neurological, neurodegenerative, and inflammatory disorders. This P.D. thesis work was based on the study of molecular aspects related to different types of modulation of the ionotropic and metabotropic functions of the human α7 nicotinic acetylcholine receptor. To this end, electrophysiological techniques at the single channel and macroscopic current levels were mainly used, as well as protein analysis by western blot and intracellular Ca2+ movement assays. Chapter I focused on the study of α7 receptor ionotropic and metabotropic function modulation by phosphorylation/dephosphorylation events. It was shown that favoring the dephosphorylated state of α7 intracellular domain tyrosine residues potentiates its ionotropic activity. At the single-channel level, this potentiating effect involved an increase in the frequency and duration of activation episodes, while at the macroscopic level it was manifested by a decrease in the rate of current decay and by an increase in the rate of recovery from the desensitized state. In contrast, tyrosine dephosphorylation had a negative effect on receptor metabotropic activity, studied by western blot from ERK 1/2 pathway. In addition, unlike what was observed for tyrosine residues, alterations in the phosphorylation status of serine and threonine residues present in the intracellular domain did not cause any significant changes in α7 ionotropic activity under the experimental conditions used. Summing up, the results collected in this chapter show that tyrosine phosphorylation, although it is absolutely necessary for α7 metabotropic activity mediated by ERK 1/2 pathway, acts as a negative modulator of receptor ionotropic activity. Chapter II focused on the study of the functional association between a peptide fragment of SARS-CoV-2 S glycoprotein (Y674-R685) and human α7 nicotinic acetylcholine receptor. The association between SARS-CoV-2 and nicotinic receptors was hypothesized at the beginning of the pandemic. Later, molecular dynamics simulations showed that the Y674-R685 fragment not only has affinity for α7 but also penetrates deep into its agonist-binding pocket. In this chapter, it was firstly stated that the Y674-R685 fragment acts as a silent α7 agonist, since it is capable of triggering single-channel and macroscopic currents, but only in the presence of a positive allosteric modulator. On the other hand, it was shown that Y674-R685 also exerts α7 negative modulation, which was evidenced by a profound concentration-dependent decrease in the duration of acetylcholine-induced activation episodes from potentiated channels and macroscopic responses. In this way, using different electrophysiological approaches, the existence of functional interaction between SARS-CoV-2 S glycoprotein Y674-R685 fragment and α7 receptor was revealed, which provides the molecular bases to further explore nicotinic receptor participation in COVID-19 pathophysiology. Chapter III was based on the study of the α7 receptor as a target of cannabidiol, which is of great interest due to the expanded use of this phytocannabinoid to treat different pathological conditions thanks to its therapeutic properties and the absence of psychoactive effects. To this end, the effect of cannabidiol on α7 ionotropic and metabotropic functions was explored using electrophysiological techniques and intracellular Ca2+ movement assays. Regarding ionotropic functions, it was shown that cannabidiol produces a rapid decrease in single-channel activity evidenced by the reduction in activation episodes frequency. This concentration-dependent effect occurred with an IC50 in the submicromolar range, indicating a potent negative modulation. On the other hand, cannabidiol also produced a negative modulation in α7 metabotropic function that was evidenced by a marked decrease in intracellular Ca2+ responses after receptor activation. These results demonstrate that cannabidiol exerts α7 negative modulation of pharmacological relevance that must be taken into account when evaluating possible therapeutic uses of the phytocannabinoid. Taken together, the results presented in this thesis broaden the understanding of molecular aspects related to the modulation of α7 nicotinic acetylcholine receptor ionotropic and metabotropic functions under different conditions, namely physiological (phosphorylation/dephosphorylation events), pathological (SARS-CoV-2 S glycoprotein fragment) and therapeutic (cannabidiol).

DYRK1A is the most studied member of the DYRK family of protein kinases, because is one of the human chromosoma 21 proteins for which changes in gene dosage result in neuropathological alterations. DYRKs are activated by autophosphorylation on a tyrosine residue in the activation loop, a one-off event that takes place during translation. Accordingly, DYRK1A would be constitutively active once is synthesized. However, DYRK1A is extremely sensitive to gene dosage, and thus it is predictable that not only its activity but also its actual protein amounts have to be tightly regulated by mechanisms not yet characterized. In the present study, the protein kinase NLK has been identified as a novel regulator of DYRK1A protein stability. DYRK1A interacts with NLK in physiological conditions. The interaction results in the phosphorylation of DYRK1A at multiple sites, which have been identified by mass spectrometry analysis. These phosphorylation events promote DYRK1A proteasome-dependent degradation. Moreover, DYRK1A degradation is induced by stimulating cells with Wnt1 or Wnt3a, or overexpressing elements of the Wnt signaling cascade such as the Frizzled-1 receptor or NLK activators such as HIPK2. In addition, DYRK1A interacts with and phosphorylates -catenin and TCF-4 and enhances -catenin-dependent transcriptional activity, at least by phosphorylation of -catenin. Thus, these results suggest that DYRK1A acts as a positive factor in the Wnt--catenin signaling pathway and NLK acts as a negative regulator by targeting both DYRK1A and TCF/LEF transcription factors for proteasome-mediated degradation. / DYRK1A es el miembro más estudiado de la familia de proteína quinasas DYRK, porque es una de las proteínas de la cromosoma humano 21 para la que cambios en la dosis génica dan lugar a alteraciones neuropatológicas. Las quinasas DYRK se activan por autofosforilación en un residuo tirosina localizado en el lazo de activación, un evento único que ocurre durante la traducción. Como consecuencia, DYRK1A sería constitutivamente activa una vez se ha sintetizado. Sin embargo, DYRK1A es extremadamente sensible a la dosis génica, y por tanto es predecible que no sólo su actividad, pero también los niveles de proteína han de estar estrictamente controlados por mecanismos reguladores que todavía no han sido caracterizados. En este trabajo, la proteína quinasa NLK ha sido identificada como un nuevo regulador de la estabilidad de DYRK1A. DYRK1A interacciona con NLK en condiciones fisiológicas, y la interacción tiene como resultado la fosforilación de DYRK1A en residuos serina/treonina, varios de los cuales han sido identificados por espectrometría de masas. La interacción con NLK y la subsecuente fosforilación promueven la degradación de DYRK1A vía el proteasoma. Además, la degradación de DYRK1A es inducida por estimulación de la células con Wnt1 o Wnt3a, o por sobreexpresión de miembros de la cascada de señalización de Wnt, como el receptor Frizzled-1 o de un activador de NLK como HIPK2. Finalmente, se ha demostrado que DYRK1A se une y fosforila -catenina y TCF-4. La fosforilación de, al menos, -catenina es responsable del incremento de la actividad transcripcional dependiente de esta proteína en presencia de DYRK1A. Todos estos resultados sugieren que DYRK1A actúa como un factor positivo en la vía de señalización Wnt--catenina y NLK actúa como un regulador negativo al inducir la degradación vía proteasoma no sólo de los factores de transcripción TCF/LEF sino también del modulador positivo DYRK1A.