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Optimización de las condiciones de cultivo durante el desarrollo embrionario in vitro en Técnicas de Reproducción AsistidaMoragues Espinosa de los Monteros, Isabel 24 October 2014 (has links)
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Production of New Carbon-Heteroatom Bonds Induced by Visible LightHerrera Luna, Jorge Carlos 05 January 2023 (has links)
[ES] En la presente tesis doctoral se describen metodologías novedosas, simples y rápidas con luz visible para producir compuestos con nuevos enlaces C-heteroátomo como C-B, C-P y C-S que representan estructuras valiosas en la síntesis orgánica moderna. La luz visible se emplea como fuente de energía más suave y sostenible que la tradicional (energía térmica). Por otro lado, también se han empleado nanorreactores espaciales como las redes de gel viscoelástico mediante enfoques 'ascendentes' para mejorar diferentes procesos en comparación con la disolución, en términos de cinética, selectividad o procesabilidad.
Por lo tanto, el Capítulo 3 describe un procedimiento novedoso, directo y rápido para producir tiofenos que contienen boro empleando luz visible en disolución anaeróbica sin el uso de ningún fotocatalizador externo. Este estudio se ha ampliado a la borilación de haluros de heteroareno comerciales en condiciones aeróbicas en un nanorreactor de gel fácil de usar (Capítulo 4). La red de gel proporciona un microambiente estabilizador adecuado para soportar una amplia gama de sustratos, incluidos los ésteres de boronato de furano, tiofeno, selenofeno y de pirrol.
El Capítulo 5 se centra en una nueva estrategia para lograr una fosforilación aeróbica eficiente de heteroarenos de cinco miembros mediante catálisis fotorredox dicromática en un nanorreactor basado en gel. La metodología, que opera mediante un mecanismo de transferencia de electrones fotoinducida consecutiva (ConPET), se ha aplicado con éxito a la síntesis sencilla y limpia de varios fosfonatos de heteroareno diferentes (furano, tiofeno, selenofeno, pirrol, oxazol o tioxazol), extendiéndose a la etapa tardía de la fosforilación del anticoagulante rivaroxabán. Por último, el Capítulo 6 muestra una tiolación (formación enlaces C-S) simple y efectiva, libre de metales, de haluros de heteroareno comerciales usando luz visible. Los resultados experimentales son consistentes con una reacción basada en un complejo aceptor-donador de electrones (EDA) entre una alquilamina y el haluro de heteroareno. El mecanismo del proceso se ha demostrado mediante estudios espectroscópicos, mientras que la robustez se ha demostrado mediante experimentos a escala de gramo y derivatización de última etapa. / [CA] En la present tesi doctoral es descriuen metodologies noves, simples i ràpides amb llum visible per a produir compostos amb nous enllaços C-heteroàtom com C-B, C-P i C-S que representen estructures valuoses en la síntesi orgànica moderna. La llum visible s'utilitza com a font d'energia mes suau i sostenible que la tradicional (energia tèrmica). D'altra banda, també s'han emprat nanorreactors espacials com les xarxes de gel viscoelàstic mitjançant enfocaments 'ascendents' per a millorar diferents processos en comparació amb la dissolució, en termes de cinètica, selectivitat o procesabilitat. Per tant, el Capítol 3 descriu un procediment nou, directe i ràpid per a produir tiofens que contenen bor emprant llum visible en dissolució anaeròbica sense l'ús de cap fotocatalitzador extern. Aquest estudi s'ha ampliat a la borilació d'halurs d'heteroaré comercials en condicions aeròbiques en un nanorreactor de gel fàcil d'usar (Capítol 4). La xarxa de gel proporciona un microambient estabilitzador adequat per a suportar una àmplia gamma de substrats, inclosos els èsters de boronat de furan, tiofé, selenofé i de pirrol. El Capítol 5 se centra en una nova estratègia per a aconseguir una fosforilació aeròbica eficient de heteroarens de cinc membres mitjançant catàlisis fotorredox dicromàtica en un nanorreactor basat en gel. La metodologia, que opera mitjançant un mecanisme de transferència d'electrons fotoinducida consecutiva (ConPET), s'ha aplicat amb èxit a la síntesi senzilla i neta de diversos fosfonats d'heteroaré diferents (furan, tiofé, selenofé, pirrol, oxazol o tioxazol), estenent-se a l'etapa tardana de la fosforilació de l'anticoagulant rivaroxabán. Finalment, el Capítol 6 mostra una tiolació (formació d'enllaços C-S) simple i efectiva, lliure de metalls, d'halurs d'heteroaré comercials usant llum visible. Els resultats experimentals són consistents amb una reacció basada en un complex acceptor-donador d'electrons (EDA) entre una alquilamina i l'halur d'heteroaré. El mecanisme del procés s'ha demostrat mitjançant estudis espectroscòpics, mentre que la robustesa s'ha demostrat mitjançant experiments a escala de gram i derivatització d'última etapa. / [EN] This thesis doctoral describes novel, simple, and rapid methodologies using visible light to produce compounds with new C-heteroatom bonds such as C-B, C-P and C-S that represent valuable scaffolds in modern organic synthesis. The employment of visible light as energy source highlights the concepts of green and sustainable chemistry considering its mild, safe, and eco-friendly advantages. On the other hand, spatially nanoreactors such as viscoelastic gel networks by 'bottom-up' approaches to improve different processes in comparison to solution, in terms of kinetics, selectivity or processability have been also developed.
Thus, Chapter 3 describes a novel, straightforward, and fast procedure to produce boron-containing thiophenes employing visible light in anaerobic solution. Interestingly, the process does not require the use of any external photocatalyst. This study has been extended to the borylation of commercially available heteroarene halides under aerobic conditions in an easy-to-use gel nanoreactor (Chapter 4). The gel network provides an adequate stabilizing microenvironment to support wide substrate scope, including furan, thiophene, selenophene, and pyrrole boronate esters.
Chapter 5 focus on a new strategy to achieve efficient aerobic phosphorylation of five-membered heteraroenes using dichromatic photoredox catalysis in a gel-based nanoreactor. The methodology, which operates by a consecutive photoinduced electron transfer (ConPET) mechanism, has been successfully applied to the straightforward and clean synthesis of a number of different heteroarene (furan, thiophene, selenophene, pyrrole, oxazole, or thioxazole) phosphonates, extending to the late-stage phosphonylation of the anticoagulant rivaroxaban.
Lastly, regarding the construction of new C-S bonds, Chapter 6 shows a simple and effective metal-free thiolation of commercial heteroarene halides using visible light. The experimental results are consistent with the reaction taking place from an electron donor-acceptor (EDA) complex between an alkylamine and the heteroarene halide. Mechanistic aspects of the whole process have been demonstrated by spectroscopic measurements whereas the strength of this novel method has been proven by gram-scale experiment and late-stage derivatization. / Herrera Luna, JC. (2022). Production of New Carbon-Heteroatom Bonds Induced by Visible Light [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191051
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The DNA damage and the DNA synthesis checkpoints converge at the MBF transcription factorIvanova, Tsvetomira Georgieva, 1978- 30 November 2012 (has links)
DNA damage is an ongoing threat to both the ability of the cell to faithfully transmit genetic information to its offspring as well as to its own survival. In order to maintain genomic integrity, eukaryotes have developed a highly conserved mechanism to detect, signal and repair damage in DNA, known as the DNA damage response (DDR). In fission yeast the two DDR pathways converge at the regulation of single transcriptional factor complex (MBF) resulting in opposite directions. We have shown that when the DNA-synthesis checkpoint is activated, Max1 is phosphorylated by Cds1 resulting in the abrogation of its binding to MBF. As a consequence, MBF-dependent transcription is maintained active until cells are able to overcome the replication challenge. In contrast, upon DNA damage, Chk1 the effector kinase of DNA damage checkpoint is activated and blocks the cell cycle progression, inducing DNA repair and repressing the MBF dependent transcription. We have revealed that Cdc10 is the target of the DNA-damage checkpoint and when cells are treated with MMS or are exposed to IR, Chk1 phosphorylates Cdc10 inducing the exit of MBF from chromatin. The consequence is that under these conditions, MBF-dependent transcription is repressed. Thus, Max1 and Cdc10 couple normal cell cycle regulation and the DNA-synthesis and DNA-damage checkpoints into MBF.
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Estudio de la funcionalidad espermática, interacción de gametos y análisis proteico en espermatozoides Epididimarios y Eyaculados en la especie porcinaAvilés López, Karen Guadalupe 29 September 2011 (has links)
La capacitación es un proceso fisiológico que el espermatozoide debe experimentar para que la fecundación del ovocito tenga lugar. Este proceso se encuentra regulado en el espermatozoide por diferentes vías moleculares, varias de las cuales, a día de hoy, se desconocen o no están totalmente dilucidadas. Estos eventos moleculares que acontecen en el espermatozoide durante el proceso de capacitación están condicionados por distintos factores que rodean su entorno, entre los cuales podemos destacar el ambiente epididimario, el plasma seminal o las secreciones del aparato reproductor femenino como el fluido oviductal.
El objetivo principal de este trabajo fue analizar el comportamiento de espermatozoides epididimarios-EP (en contacto con el fluido epididimario y no con el plasma seminal) y eyaculados-EY (en contacto con el plasma seminal) sometidos a 3 tratamientos diferentes: 1) Espermatozoides no tratados (grupo control-C); 2) Lavados a través de gradientes de Percoll e incubados en medio de capacitación TALP (grupo lavados-L); 3) Espermatozoides lavados e incubados en Fluido Oviductal Porcino (grupo FOP).
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Bases moleculares de la especificidad en el mecanismo de transducción de señal en los sistemas de dos componentes bacterianosMideros Mora, Cristina 19 February 2021 (has links)
[ES] El contexto de esta Tesis se enmarca en los sistemas de dos componentes (TCS) para comprender el mecanismo de transducción de la señal. Se analizó la especificidad en el reconocimiento de los TCS abarcando estudios a nivel funcional, estructural y evolutivo. Primero se utilizó el sistema HK853-RR468, que al estar previamente caracterizado nos permitió analizar específicamente las regiones de reconocimiento (HK-RR) correspondientes a los Lß3α3 y Lß4α4 de RR468 mutando residuos que determinaran la influencia en la transferencia del grupo fosfato. Los mutantes se caracterizaron de manera bioquímica y se hicieron aproximaciones estructurales pudiendo asignar la reacción de fosfotransferencia a una estructura formada por un complejo entre HK853 y RR468 mutante. Esta estructura nos permitió observar el carácter disociativo de dicha reacción que ha sido descrito previamente y la nula participación del dominio CA. Al mismo tiempo, se analizó la influencia del pH en los residuos catalíticos de la HK y el RR (His y Asp), utilizando un rango de pH de 5 a 8. Los ensayos bioquímicos generados en este rango nos mostraron como la His catalítica perdía su carácter nucleofílico cuando el pH se acercaba y disminuía de 6. Esto se relaciona con el pKa del anillo de imidazol presente en el residuo de His, que se se encuentra en torno a 6 y la pérdida de protonación. También se cristalizó el complejo HK-RR a diferentes pHs donde observamos que la His adquiría un rotámero gauche- que se asignaba a un estado inactivo o de reposo. Por otra parte, se analizó la influencia de la mutación G63V en el RR OmpR, que fue descrita como una mutación relacionada con la resistencia al antibiótico ertapenem. Para esto se generaron mutantes en OmpR en la posición G63, tanto en el dominio REC aislado como en la proteína completa. Los estudios bioquímicos de estas mutaciones demostraron como la mutación en esta posición disminuía la capacidad del RR para fosforilarse e incluso a dimerizar. Esto afectaba a la afinidad de este RR para interaccionar con su ADN correspondiente, las cajas ompF y ompC. Estos efectos se lograron evidenciar con la estructura de OmpRRECG63V, donde se observó como la mutación generaba un cambio conformacional al reducir el tamaño del Lßα3 y generaba un bolsillo hidrofóbico donde quedaba atrapada la cadena lateral de la Val. Finalmente se analizó el aspecto evolutivo de la señalización, para lo que se buscaron organismos endosimbiontes que presentaran una HK y uno o varios RRs. Estas características nos sugerían que la menor presión selectiva nos iba a permitir encontrar organismos con TCSs menos evolucionados cuya especificidad se haya visto reducida. Se analizaron los sistemas de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Simkania negevensis y Methanobrevibacter sp. Abm4. Solo pudo evidenciarse reacción de fosfotransferencia en el sistema perteneciente a Methanobrevibacter, el cual presenta una HK y 4 RRs. Sin embargo, esta fosfotransferencia presentaba una eficiencia diferenciada, siendo más rápida en RRMet572 y RRMet589-1 mientras que era nula en RRMet589-2. Por su parte las HKs de C. trachomatis y S. negevensis, fueron capaces de fosfotransferir, de manera no selectiva, a RR468, probablemente debido a la alta similitud que presenta la hélice α1 de las HKs con HK853. La aproximación estructural de estos sistemas permitió obtener las estructuras de los RRsMet589-1 y RRMet572, ambos en estado no fosforilado. Las dos estructuras presentaron grandes diferencias conformacionales a partir del Lßα4. Esto sugiere que sus mecanismos de reconocimiento con HKMet y de regulación son diferentes lo que apoya la selectividad diferenciada entre los RRs de este sistema. / [CA] Esta Tesi s'emmarca en l'estudi dels sistemes de dos components (TCS) amb la finalitat d'entendre el seu mecanisme de transducció de senyal basat en l'especificitat de reconeixement a nivell funcional, estructural i evolutiu. Utilitzant el TCS HK853-RR468, analitzarem les regions Lß3α3 y Lß4α4 del regulador de la resposta (RR) RR468, que prèviament s'havien mostrat importants en el reconeixement, generant mutants i determinant la influència en la transferència del grup fosforil. Els mutants foren caracteritzats bioquímicament, observant que afectaven a una reacció específica i permetent-nos captar la reacció de fosfotransferència en una estructura formada per un complex entre HK853 i RR468 mutant. Aquesta estructura va mostrar el caràcter dissociatiu d'aquesta reacció i la nul·la participació del domini CA de la HK. Al mateix tems, s'analitzà l'efecte del pH sobre la transducció del senyal utilitzant els TCS K853-RR468 i EnvZ-OmpR. Els assajos bioquímics generats dins del rang de pH entre 5 i 8 ens mostraren com la His de la HK catalítica perdia el seu caràcter nucleofílic quan el pH s'aproximava i disminuïa de 6, valor del pKa de l'anell d'imidazole de la cadena lateral del residu d'His, indicant que aquesta disminució en l'activitat es correlacionava amb el canvi en la protonació de l'anell. Un exhaustiu estudi estructural del complex HK853-RR468 a diferents pHs mostrà que la His catalítica sempre adquiria un rotàmer gauche- independentment del valor del pH, invalidant el model que proposava que el pH regulava l'activitat de les HKs de la família HisKA induint un canvi en el rotàmer de la His catalítica. D'altra banda, s'analitzà la influència de la mutació G63V en el RR OmpR, que fou descrita com una mutació relacionada amb la resistència a l'antibiòtic ertapenem. Amb aquesta finalitat, es generaren mutants a OmpR a la posició G63 tant al domini REC aïllat com a la proteïna completa. Els estudis bioquímics demostraren com la mutació en aquesta posició disminuïa la capacitat de OmpR per fosforilar-se i per dimeritzar, afectant a la capacitat d'interaccionar amb les seqüències d'ADN palindròmiques diana, corresponents a les caixes ompF i ompC. Aquests efectes es visualitzaren a nivell molecular al resoldre l'estructura del mutant G63V d'OmpRREC, on s'observava com la mutació induïa un canvi conformacional al reduir la mida del Lßα3 generant una butxaca hidrofòbica degut a la presència de la nova Val en posició 63. Aquests canvis es transmeten a la resta de l'estructura d'OmpR produint canvis en Lßα4 i α4 que impedeixen la formació d'una superfície de dimerització competent i impedint la seua interacció amb l'ADN. Finalment, s'analitzà l'aspecte evolutiu de l'especificitat HK-RR. Buscaren organismes endosimbionts que presentaren TCS aïllats consistent en una HK i un o diversos RRs, suggerint que la menor pressió selectiva permetria trobar TCS menys evolucionats, on l'especificitat s'haguera vist reduïda. S'analitzaren HKs i RRs presents en Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Simkania negevensis i Methanobrevibacter sp. Abm4. La reacció de fosfotransferència es va detectar en Methanobrevibacter, que presenta una sola HK i 4 RRs. Aquesta HK mostrà eficiència diferenciada per a la reacció de fosfotransferència, presentant major velocitat per als RRs RRMet572, RRMet589-1 i nul·la per a RRMet589-2. Per la seua banda, les HKs de C. trachomatis i S. negevensis, foren capaces de transferir, de manera no selectiva, a RR468 de Thermotoga maritima, probablement degut a l'alta similitud que presenta l'hèlix α1 de les HKs amb HK853. L'aproximació estructural d'aquests sistemes ens va permetre resoldre les estructures dels RRsMet589-1 i RRMet572 en estat no fosforilat. Les dues estructures presentaren grans diferències conformacionals a partir del Lßα4, els que ens suggereix que els seus mecanismes de reconeixement amb HKMet i de regulació són diferents, cosa que suporta la selectivitat diferenciada entre els RRs d’aquest sistema. / [EN] The context of the Thesis is framed in the two component systems (TCS) to understand the signal transduction mechanism. The specificity in the recognition of TCS was analyzed covering studies at the functional, structural, and evolutionary level. First, the previously characterized HK853-RR468 was used, this allowed us to analyze specific recognition regions corresponding to Lß3α3 and Lß4α4 of RR468 and induce mutations in these regions and understand the recognition between HK and RR and determine the phosphate group transfer's influence. The mutants were characterized biochemically, and structural approximations were prepared, thus assigning the phosphotransfer reaction in a formed structure by an HK8536 and a mutant RR468 complex. This structure allowed us to observe the dissociative character of this reaction that has been previously described and the null participation of the CA domain. Simultaneously, the influence of pH on the catalytic residues of HK and RR (His and Asp) was analyzed, using a pH range of 5 to 8. The biochemical assays generated in this range showed how HK's catalytic His lost the nucleophilic characteristic when pH reached six or below. This is related to the pKa of the imidazole ring present in the His residue that if found around 6 and the loss of protonation. The HK853-RR468 complex was also crystallized at different pHs where we observed that His acquired a gauche- rotamer that was assigned an inactive or resting state. In addition, the influence of mutation G63V in the RR OmpR was analyzed. This mutation was associated with resistance to the antibiotic ertapenem in E. coli. For this, mutants in OmpR were generated in position G63 in both the isolated REC domain and in the whole protein. Biochemical studies of this mutations showed how the mutation in this position reduced the capacity of RR to phosphorylate and even to form a dimer. This affected the affinity of the RR to interact with it's corresponding DNA, the boxes ompF and ompR. These effects were shown with the structure of the REC domain of the OmpR protein mutant G63V. This mutation generated a conformational change by reducing the Lßα3 and generating a hydrophobic pocket that trapped Val's lateral chain. Finally, the evolutive aspect of signaling was analyzed. For this, endosymbiotic organisms that had one HK or many RRs were identified. These characteristics suggested that lower selective pressure would allow us to find organisms with TCSs that showed lower KH-RR specificity. The systems of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Simkania negevensis, and Methanobrevibacter sp. Abm4 were analyzed. The phosphotransference reaction was only evident in the the Methanobrevigbacter system. This system presents only one KH and four RRs. This HK shows differentiated efficiency in the phosphotranference. It has a higher speed in RRMet572, RRMet589-1 and it is null in RRMet589-2. On the other hand, the HKs of C. trachomatis y S. negevensis were able to transfer in a nonselective manner the RR468 of T. maritima. This is due to the similarity between the α1 helix of the HKs with HK853. The structural approach of there systems allowed us to obtain the structure of RRMet589-1 y RRMet572, both in a non-phosphorylated state. The two structures presented large conformational differences from Lßα4. This suggests that the recognition mechanisms with KHMet and regulation are different. This supports differentiated selectivity between the RRs in this system. / Mideros Mora, C. (2021). Bases moleculares de la especificidad en el mecanismo de transducción de señal en los sistemas de dos componentes bacterianos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/161920 / TESIS
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Max1 links MBF dependent transcription upon completion of DNA synthesis in fission yeastGómez Escoda, Blanca 26 November 2010 (has links)
When DNA replication is challenged, cells activate a DNA synthesis checkpoint blocking cell cycle progression until they are able to overcome the replication defects. In fission yeast, Cds1 is the effector kinase of this checkpoint, inhibiting M phase entry, stabilizing stalled replication forks and triggering transcriptional activation of S-phase genes; the molecular basis of this last effect remains largely unknown. The MBF complex controls the transcription of S-phase genes. We have purified novel interactors of the MBF complex and among them we have identified the repressor Max1. When the DNA synthesis checkpoint is activated, Max1 is phosphorylated by Cds1 resulting in the abrogation of its binding to MBF. As a consequence, MBF-dependent transcription is maintained active until cells are able to overcome this challenge. / Cuando la replicación del DNA se ve alterada, las células activan un mecanismo de control bloqueando la progresión del ciclo celular hasta que son capaces de superar el daño. En la levadura de fisión, Cds1 es la proteína kinasa efectora de dicha respuesta, mediante inhibición de la entrada en fase M, estabilización las horquillas de replicación bloqueadas, e inducción de la activación de la transcripción de los genes de fase S; siendo la base molecular de este último proceso poco conocida. El factor de transcripción MBF controla la transcripción de los genes de fase S. Hemos purificado proteínas que interaccionan con MBF, y entre ellas, hemos identificado al represor Max1. Cuando el checkpoint de síntesis de DNA es activado, Max1 es fosforilado por la kinasa Cds1, y esto se traduce en la disociación de Max1 del complejo MBF. Como consecuencia, la transcripción MBF-dependiente se mantiene activa hasta que las células son capaces de superar el daño.
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