La coagulació intravascular disseminada (CID) és una complicació freqüent en cavalls amb problemes gastrointestinals (GI) greus que ha estat associada amb un mal pronòstic. La CID té com a conseqüència el dipòsit microvascular de fibrina que pot acabar causant disfunció multiorgànica . Estudis experimentals recents han demostrat que la detecció i tractament precoç de les coagulopaties subclíniques permet reduir la morbiditat i mortalitat associades amb la CID. La concentració plasmàtica de dímer-D es considera la prova més sensible per diagnosticar pacients amb malaltia tromboembòlica i CID en medicina humana, i també ha demostrat ser un bon predictor de mortalitat. En medicina equina, elevacions plasmàtiques de dímer-D s'han associat amb hipercoagulabilitat en cavalls amb còlic i septicèmia en poltres, i alguns estudis defensen la seva utilitat per ajudar a formular un pronòstic en cavalls amb problemes gastrointestinals aguts. Els objectius d'aquesta tesi doctoral han estat aprofundir en l'estudi de les coagulopaties en cavalls amb còlic per millorar la detecció precoç i el tractament de la coagulació intravascular disseminada, així com avaluar les possibles aplicacions clíniques de mesurar la concentració plasmàtica de dímer-D en cavalls amb còlic . Per això es van dur a terme tres estudis en una població hospitalària de cavalls amb diferents diagnòstics de malaltia gastrointestinal, en què es va avaluar el perfil hemostàtic (incloent dímer-D, temps de protrombina, temps de tromboplastina parcial activada i antitrombina III) i la presència de CID laboratorial en tres moments diferents de la malaltia: l’ ingrés, durant l'hospitalització i abans de morir. A més, en el tercer estudi, aquestes dades clínico-patològiques van ser comparades amb dades histopatològiques dels mateixos cavalls que avaluaven la presència i quantitat de dipòsits microvasculars de fibrina per tal de detectar qualsevol correlació . Els resultats del primer estudi suggereixen que la determinació de la concentració plasmàtica de dímer-D en el moment de l'admissió pot contribuir al diagnòstic i a l'emissió d'un pronòstic en cavalls amb còlic. A més a més, aquest estudi aporta informació nova i d'utilitat clínica , proposant diversos punts de tall amb utilitat pronòstica i diagnòstica. Durant l'hospitalització (segon estudi), l'avaluació de la concentració plasmàtica de dímer-D ha demostrat ser una eina útil per monitoritzar estats d'hipercoagulació en cavalls amb còlic. Així mateix, i confirmant resultats d'estudis previs, es van observar importants elevacions plasmàtiques de dímer-D en la fase postoperatòria. Finalment, el tercer estudi va concloure que la concentració plasmàtica de dímer-D prèvia a la mort no és més útil que la resta de paràmetres hemostàtics avaluats per predir quins pacients presenten microtrombes de fibrina compatibles amb CID a la necròpsia . En conjunt, els tres estudis d’aquesta tesi contribueixen a un millor coneixement de les coagulopaties en cavalls amb problemes gastrointestinals i han proporcionat nova informació sobre les possibles aplicacions de la determinació plasmàtica de dímer-D en diferents etapes del còlic equí. / Disseminated intravascular coagulation (DIC) is a frequent complication in horses with severe gastrointestinal (GI) disorders that has been associated with poor outcome. It results in microvascular fibrin deposition and eventually organ dysfunction. Recent experimental studies have shown that rapid detection and treatment of subclinical coagulopathies reduce morbidity and mortality associated with DIC. Plasma D-dimer concentration is considered the most sensitive test to diagnose thromboembolic disease and DIC in human medicine, and it has been shown to be a good predictor of mortality as well. In horses, D-dimers have been found to be useful to detect hypercoagulation in horses with colic and septic foals and some studies advocate its use as prognostic aid in horses with acute GI problems. The objectives of this PhD thesis were to go further into the study of coagulopathies in horses with colic to improve early detection and management of DIC as well as to evaluate the potential clinical applications of the measurement of plasma D-dimer concentration in horses with colic. With that purpose, three studies were conducted in a hospital population of horses with different diagnoses of gastrointestinal disease, evaluating hemostatic profiles (including D-dimer, prothrombin time, activated partial thromboplastin time and antithrombin III) and the presence of laboratorial DIC at three different stages of the disease: on admission, during hospitalization and before dead. Furthermore, in the third study, this clinicopathological data was compared to histopathological data from the same horses evaluating microvascular fibrin deposition to detect any correlation. Results of the first study suggest that measurement of plasma D-dimer concentration at the time of admission can be used to facilitate diagnosis and outcome prediction in horses with colic. Furthermore, this study brings new clinically useful information, proposing several cut-offs with prognostic and diagnostic utility. During hospitalization (second study), evaluation of plasma D-dimer concentration has shown to be a useful tool to monitor hypercoagulative states in equine colic cases. Important increases in D-dimer concentration were observed postoperatively as well, as mentioned in previous reports. Finally, the third study concluded that antemortem D-dimer concentration was not more useful than the rest of measured hemostatic parameters to predict which patients presented fibrin microthrombi consistent with DIC at necropsy. Overall, the three studies within this thesis have contributed to a better knowledge of coagulopathies in horses with gastrointestinal disorders and have provided new information about applications of D-dimer determination at different stages of the colic disease.

La presencia de enfermedad cardiaca puede tener repercusiones serias sobre la salud y el bienestar de los equinos pero el riesgo a las personas, asociado con el desarrollo de colapso cardiovascular o de muerte súbita cardiaca hacen de la cardiología equina una disciplina con implicaciones que van más allá de la salud animal. La tesis aquí presentada trata de aportar conocimientos sobre problemas cardiacos equinos. En el primer estudio de esta tesis se estudió los efectos de la hemorragia aguda en la concentración plasmática de un marcador específico de daño miocárdico, como es la troponina cardiaca I, y en el desarrollo de arritmias cardiacas. Para realizar este estudio diseñamos un estudio prospectivo en el que un grupo de caballos con hemorragia aguda se comparó a un grupo control. El estudio determinó que la hemorragia aguda causa daño miocárdico que puede ser detectado midiendo la concentración plasmática de troponina cardiaca I y que la presencia de arritmias es frecuente en caballos hospitalizados debido a la presencia de hemorragia aguda. EL segundo estudio de esta tesis se diseñó para estudiar la apariencia clínica, ecocardiográfica y anatomopatológica de la cardiomiopatía hipertensiva en caballos. Diseñamos un estudio retrospectivo en el cual se revisaron los archivos de la Universidad de Pensilvania desde 1995 a 2011 para encontrar casos con hipertrofia del miocardio del ventrículo izquierdo e hipertensión. A partir de esta información se describió la presencia de cardiomiopatía hipertensiva como una comorbilidad en caballos con laminitis y fallo renal crónico. Este problema clínico no había sido descrito previamente en equinos. La cardiomiopatía hipertensiva debería de considerarse en caballos con hipertensión y se debe añadir a la lista de diagnósticos diferenciales en los caballos que presentan hipertrofia del ventrículo izquierdo. El tercer estudio de esta tesis investigó la presencia de un estado de hipercoagulación en caballos con fibrilación atrial. La fibrilación atrial es la arritmia clínicamente mas relevante en caballos y humanos y en humanos causa un estado de hipercoagulación que provoca que las complicaciones tromboembólicas sean la mayor causa de morbilidad y mortalidad en estos pacientes. Diseñamos un estudio prospectivo control en el cual los tests de coagulación más utilizados en medicina equina se realizaron en muestras de sangre obtenidas de caballos con fibrilación atrial y de un grupo control. La proporción de caballos con D-dímeros, paneles de coagulación y resultados anormales fue mayor en el grupo de caballos con fibrilación atrial. La antitrombina fue significativamente mas baja en el grupo de caballos con fibrilación atrial. Ninguno de los caballos mostró signos clínicos de hipercoagulación o tromboembolismo. Este estudio demostró que los caballos en fibrilación atrial presentan un estado subclínico de hipercoagulacion sin sintomatología clínica de tromboembolismo. Como conclusión, los tres estudios que forman parte de esta tesis doctoral han contestado cuestiones relevantes que no habían sido investigadas previamente. La hemorragia aguda causa daño miocárdico y arritmias en caballos. Caballos con laminitis y enfermedad renal crónica pueden desarrollar cardiomiopatía hipertensiva y los caballos con fibrilación atrial permanecen en un estado de hipercoagulabilidad sin consecuencias tromboembólicas. / The presence of cardiac disease can have serious repercussions to horses’ health and wellbeing but the risks for humans associated with equine cardiovascular collapse or sudden cardiac death make equine cardiology a discipline that has implications that go beyond animal health. The thesis presented here was designed to gain further knowledge in equine cardiac problems The first study of this thesis studied the effects of acute hemorrhage on the plasma concentration of a marker of myocardial injury (cTnI) and in the development of cardiac arrhythmias. We designed a prospective controlled study in which a group of horses presented with acute hemorrhage were compared to a control group. We concluded that acute hemorrhage results in myocardial injury that can be detected by measuring cTnI and that arrhythmias are frequent in hospitalized horses with acute hemorrhage. The goal of the second study of this thesis was to study the clinical, echocardiographic and pathological appearance of hypertensive cardiomyopathy (HC) in horses. To achieve this goal we designed a retrospective study in which the medical records of the University of Pennsylvania’s New Bolton Center (between 1995 and 2011) were searched for the presence of horses with myocardial hypertrophy and hypertension. We described the presence of HC as a comorbid diagnosis in horses with laminitis or chronic renal failure. This clinical entity had not been previously diagnosed in horses. Hypertensive cardiomyopathy should be borne in mind when evaluating horses with hypertension and added to the list of differentials diagnoses for horses that present left ventricular hypertrophy. The third part of this thesis had the motivation of investigating the presence of a hypercoagulable state in horses with atrial fibrillation. Atrial fibrillation is the most common and clinically relevant arrhythmia in horses and in humans. Humans in atrial fibrillation are in a hypercoagulable state that makes stroke and thromboembolism the major cause of morbidity and mortality in patients with this rhythm disturbance. We designed a prospective controlled study in which common tests to evaluate coagulation and fibrinolysis in horses were performed on blood samples obtained from equine patients with atrial fibrillation and in a control group. The proportion of horses with abnormal D-dimer concentrations, abnormal coagulation profiles and the proportion of abnormal coagulation tests was larger in the atrial fibrillation group than in the control group. Antithrombin activity was lower in the atrial fibrillation group. No clinical signs of hypercoagulability or thrombogenesis were detected in any of the horses. This study demonstrated that atrial fibrillation causes a state of hypercoagulability in horses without thromboembolic consequences. In conclusion, the three studies have contributed to the body of knowledge in equine cardiology and have answered relevant questions that had not been previously investigated. Acute hemorrhage causes myocardial injury and arrhythmias during acute hemorrhage in horses. Horses with laminitis or chronic renal failure can develop HC and horses in atrial fibrillation present subclinical hypercoagulation without thromboembolic consequences.

Els mètodes tradicional i quantitatiu per l’ interpretació de l’equilibri àcid-base (AB) s’han aplicat a la medicina esportiva i la clínica veterinària equina. Els problemes argumentats pels detractors del mètode quantitatiu són la complexitat de les equacions emprades i el major nombre de determinacions necessàries per dur a terme l’anàlisi. Després de les simplificacions fetes per Constable, l’aplicació de les formules és més senzilla i requereix menys determinacions, el que permet l’aplicació a la clínica diària. Encara que les equacions simplificades són més fàcils d’emprar, es necessiten d’altres adaptacions per aplicar les equacions de medicina humana al plasma de cavall. La principal diferència es deu a la diferent pKa de l’ATOT (espècie específica) i ha de tenir-se en compte en fer aquestes adaptacions. En publicacions anteriors s’han constatat diferències en els components de les variables emprades en el mètode quantitatiu (electròlits i proteïnes) durant els diferents estats fisiològics. Aquestes diferències podrien donar lloc a canvis en els valors de normalitat dels paràmetres calculats de l’AB (SIDm i ATOT). El present treball avalua els canvis en el SIDm i ATOT en cavalls de raid d’elit i l'efecte de l'edat durant el primer any de vida. Els valors de referència obtinguts en poltres nounats i cavalls d’esport d’elit són més baixos que els valors considerats normals en cavalls adults. A més s’ha observat que els poltres no assoleixen els valors adults d’ATOT fins als 6 mesos de vida, mentre que el SIDm assoleix el valor dels adults després del període neonatal. A causa de les diferències observades en els valors de ATOT en nounats, la simplificació publicada per cavalls adults utilitzant les proteïnes plasmàtiques no és l'adequada per nounats i en aquest treball es proposa una nova equació més acurada per a poltres durant el període neonatal. Una altra possible font d'errors en la interpretació AB en situacions d'emergència són els analitzadors disponibles durant les urgències. Aquests dispositius utilitzen mètodes de determinació diferents del laboratori de referència (potenciometria directa vs. indirecta) i poden donar-se grans diferències en els resultats obtinguts. El present treball proporciona els valors normals de referència per a poltres nounats, poltres durant el primer any de vida i cavalls de raid utilitzant aquest tipus d'analitzadors. Els valors de referència concrets per cada analitzador permeten disminuir errors d'interpretació de l’equilibri AB. A més aquest treball també avalua els paràmetres d'AB com a marcadors de pronòstic/diagnòstic i la freqüència dels desequilibris AB en poltres malalts. Les alteracions AB més comuns detectades varen ser l’alcalosi respiratòria amb o sense acidosi deguda al SIDm. L’augment de la pressió venosa de CO2 i acidosi làctica metabòlica es van relacionar amb un mal pronòstic, però altres marcadors de pronòstic utilitzats en medicina humana (BE, BEuma o SIG) no varen ser útils. No es van observar diferències específiques en els desequilibris AB entre poltres sèptics i no sèptics. Els desequilibris AB també es van avaluar en cavalls de raid mitjançant l'anàlisi tradicional i quantitativa. La concordança entre ambdós mètodes va ser pobre. L'alteració més freqüentment detectada durant el raid va ser una lleu alcalosi deguda al SIDm (hipoclorèmia), emmascarada per acidosi làctica lleu, acidosi deguda a l’ATOT i acidosi respiratòria lleu. Les equacions de l’anàlisi de l’ AB quantitatiu de medicina humana poden ser aplicades al plasma de cavall tenint en compte les adaptacions necessàries degudes a l’espècie. Per a la interpretació correcta AB en situacions d'emergència, han d’emprar-se els valors de referència adequats a les diferents situacions fisiològiques (nivell d’entrenament o edat de l’animal) i també als analitzadors utilitzats. / Traditional and quantitative methods have been applied to both equine sports medicine and veterinary clinic. One of the problems of quantitative analyses are the complicated equations and large number of determinations needed for its application versus traditional approach to AB analyses. After Constable’s18 simplification, the equations applied to quantitative analyses are easier and need less parameters, thus allowing the application on daily clinic. Although simplified equations are easier to use, other adaptations are required in order to apply human equations to horse plasma. The main difference is due to different horse pKa of ATOT and was taken into account during the recalculation of the equations. Published differences of the AB variables components (electrolytes and proteins) during different physiological states could lead to differences in AB calculated parameters (SIDm and ATOT). The present work evaluates changes of SIDm and ATOT in elite sport endurance horses and the effect of aging during the first year of life. Lower values of ATOT and SIDm were found in neonate foals and elite horses compared to normal adult horses. Adult values of ATOT are not achieved until 6 months of life while SIDm adult values are found after neonatal period. Due to differences observed in neonatal values of ATOT, the published simplification used in adult horses is not adequate and a new equation for neonatal foals is provided in this work. Another possible source of errors on AB interpretation in emergency situations is the point of care analyzers or afterhours analyzers available in veterinary hospitals. These devices use different determination methods from those of the reference laboratory (direct potentiometry vs. indirect potentiometry) and a large difference could be found on results of both types of analyzers. The present work provides normal reference values for neonatal foals, foals during first year of life and endurance horses using these kind of point-of-care analyzers. Concrete reference values for analyzers diminish interpretation mistakes on AB equilibrium during emergency hours. Moreover, the present work also evaluates AB parameters such as prognostic/diagnostic markers in ill foals and the frequency of AB imbalances in these foals. The most common AB disturbance in critically ill foals was respiratory alkalosis with or without SIDm acidosis. Increased pvCO2 and metabolic lactic acidosis were related with poor outcome in critically ill neonatal foals, but other prognostic markers used in human medicine (BE, BEuma or SIG) were not useful. No specific differences on AB imbalances between septic and non-septic foals were observed. Acid-base imbalances were also evaluated on endurance horses using traditional and quantitative analyses. Poor agreement between both methods was observed and complex AB disturbances were detected with quantitative analyses. The most common alteration detected in endurance horses was mild strong ion alkalosis (hypochloremia), attenuated by mild lactic acidosis, non-volatile buffer ion acidosis and mild respiratory acidosis. Human quantitative AB equations could be applied to horse plasma taking into account the necessary adaptation depending on the species. For correct AB interpretation during emergency situations, adequate reference values had to be used in different physiologic situations or depending on the analyzer used.

Canine Leishmaniasis (CanL) is due to Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) and is endemic in Mediterranean countries, Portugal, Latin America and Southern Asia. In the last few decades, imported and even autochthonous cases have been recorded in traditionally non-endemic areas such as Central and Northen Europe and Northen America. This is possibly due to a wider spread of the vector and especially to a larger numbers of travelling dogs. Many studies about CanL have been published in the last years and have contributed in understanding different aspects of this disease, including the alternative ways of transmission and the pathologic mechanisms underlying the clinical findings. However, CanL still remains a very challenging disease to diagnose, treat and prevent. Moreover, it is still very difficult to predict the outcome given the low numbers of controlled studies evaluating markers of prognosis. So, the main aims of the present thesis were to investigate new clinico-pathological aspects of CanL and to possibly identify useful prognostic factors. The first study demonstrated that a significant proportion of dogs with leishmaniasis have increased serum cTnI concentration, suggesting that CanL can cause cardiac disease, mainly myoand endocarditis. In the second study, the iron status and its relationship with C-reactive protein (CRP) was for the first time investigated in CanL. The results indicated that dogs with leishmaniasis have decreased serum iron, total iron-binding capacity (TIBC), unsaturated iron-binding capacity (UBIC) and percentage of transferrin saturation and increased concentrations of ferritin. Increased CRP and decreased TIBC are also risk factors for moratility. Finally, since the disease is progressively changing its geographical distribution, the last investigation was conducted in the United Kingdom (UK), currently considered a non-endemic country. The majority of dogs that were diagnosed of leishmaniasis have been adopted from an endemic area (especially from the Mediterranean countries) respect a minority that have travelled to those regions. No autochthonous cases were recognised. Purebreed dogs and those that were classified in stage D according to the Canine Leishmaniasis Working Group guidelines were at higher risk of death. Differently to what has been reported in endemic countries, serology titre at diagnosis and IRIS staging for chronic kidney disease did not influence the outcome.

Los virus de influenza A (IAVs) son los responsables de brotes pandémicos y de la mayoría de las epidemias anuales en los seres humanos, aves y cerdos. Los virus de influenza A se dividen en subtipos, basado en la naturaleza de sus glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA es una glicoproteína de superficie homotrimérica que media la entrada del virus de influenza a través de la unión celular y eventos de fusión de membranas. El bolsillo de unión al receptor de HA está rodeado por los sitios de unión de anticuerpos antigénicamente variables. Por lo tanto, los anticuerpos limitados a estos sitios debería, en principio, bloquear la unión a las proteínas del receptor, inhibiendo la entrada del virus, lo que demuestra actividad de inhibición de la hemaglutinina y la actividad de neutralización viral. Sin embargo, la subunidad 1 de HA (HA1) es altamente variable a través de los virus de influenza y tiende a cambiar bajo presión inmune; por lo tanto, fácilmente evade los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacunación o infecciones anteriores. Las consecuencias negativas de las infecciones por virus de influenza incentivan al mundo de la ciencia para promover el desarrollo de vacunas multivalentes contra la gripe, que tengan eficaz protección frente a todas las cepas de influenza. Por consiguiente, el campo de la bioinformática se ha convertido en una parte importante de la identificación y validación temprana de nuevas dianas terapéuticas que podrían ser un primer paso esencial en el desarrollo de una vacuna eficaz para el virus de influenza, que representa la alta variabilidad de sus determinantes antigénicos. En esta tesis se postuló que la HA1 podría representar una diana potencial para una vacuna multivalente frente a la infección por influenza virus. Por ende; el objetivo general de esta tesis fue seleccionar péptidos conservados de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe, para evaluar la eficacia de los candidatos seleccionados, para inducir la inmunidad que pueda proteger a los animales contra la infección. Para desarrollar este objetivo, se llevaron a cabo tres estudios experimentales: en ratones (Capítulo 1), cerdos (capítulo 2) y pollos (Capítulo 3). En el primer estudio, se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos HA1 contra la pandemia del virus H1N1 2009 (pH1N1) y el virus de la influenza de alta patogenicidad H7N1 en un modelo de ratón (Capítulo 1). En este estudio, los ratones fueron vacunados por vía intraperitoneal con la mezcla de péptido sintético (NG34 + DC89) y desafiados ya sea con el pH1N1 ó H7N1 del virus de influenza. Una mortalidad del 85% fue observada en los ratones de control, independientemente del virus utilizado para el desafío, 80% y 66% de los ratones vacunados con péptido sobrevivieron al desafío con pH1N1 y H7N1, respectivamente, sin la detección de virus de la influenza (IV). Los ratones vacunados supervivientes se correlacionaron con la presencia de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada en sueros antes de la exposición. La inmunización con NG34+DC89 también indujo respuesta inmune en mucosas; demostrándose con la presencia de IgA en lavado broncoalveolar en el 50% de los animales. Nuestros resultados también muestran que la vacunación de NG34+DC89 es capaz de inducir anticuerpos y la protección cruzada neutralizante frente a dos cepas heterólogas, pH1N1 y H7N1. Por lo tanto, péptidos NG34+DC89 representan un inmunógeno atractivo, lo que podría ser aún más optimizado para futuras formulaciones de vacunas multivalentes frente el virus de influenza. En el segundo estudio, hemos probado la inmunogenicidad de un cóctel HA1-péptido en un modelo porcino para evaluar si esta nueva formulación puede conferir inmunidad a una amplia gama de virus de influenza in vitro (Capítulo 2). En este estudio, hemos utilizado cuatro péptidos de la HA1 del subtipo H1 del virus de influenza (NG34, DC55, RA22 y SS35), evaluamos su inmunogenicidad en cerdos convencionales de granja frente a virus de influenza homólogos y heterólogos. Las vacunas de péptidos sintéticos indujeron anticuerpos con capacidad neutralizante y de inhibición frente a virus homólogos. Aquellos también cros-reaccionaron frente a los virus heterólogos de origen aviar como el virus H7N1 y virus de influenza de baja patogenicidad H5N2 y además el virus circulante H3N2 de origen porcino. Por otra parte, se detectaron anticuerpos específicos de IgA-secretora en hisopos nasales. Los resultados muestran que los péptidos evaluados fueron inmunogénicos en cerdos. La respuesta humoral con la actividad neutralizante y de inhibición de hemaglutinina generada después de la inmunización podría ser utilizada en otros estudios de inmunidad protectora heterosubtípica. En el tercer estudio se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos de HA1 contra el virus altamente patógeno virus de la influenza H7N1 en pollos, un modelo huésped natural (capítulo 3). En este estudio, se utilizaron dos péptidos sintéticos NG34 y SS35 para vacunar pollos de granja. La vacunación tanto con péptidos NG34 ó SS35 indujeron anticuerpos específicos que reconocen virus heterólogos, como H7N1 y H5N2 in vitro. La vacunación con péptido NG34 provocó una respuesta de anticuerpos protectores que confirió una protección parcial frente un desafío letal con H7N1. Además, el péptido NG34 indujo una respuesta inmune de la mucosa, que correlacionaba con la diseminación viral reducida en hisopos orofaríngeos/ cloacales y la pulpa de la pluma. Por el contrario, animales vacunados con el péptido SS35 no pudieron producir una eficiente respuesta inmune protectora frente el desafío letal H7N1. Es necesario recalcar, que todos los péptidos HA1 del subtipo H1 del virus de influenza, fueron seleccionados mediante el Método de espectros informativo (ISM). Cuatro principales conclusiones generales pueden extraerse de estos estudios: (i) Péptidos HA1 son inmunogénicos en todos los modelos animales estudiados (ratones, cerdos y pollos) e inducen una respuesta immune humoral y de mucosa. (ii) Péptidos inmunogénicos de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la influenza confieren una protección parcial contra diferentes subtipos virales en ratones; (iii) Los cerdos vacunados con péptidos HA1 provocan una respuesta de anticuerpos neutralizantes con actividad de inhibición de la hemaglutinina frente a diferentes subtipos de Influenza A virus y (iv) Péptidos HA1 confieren una protección parcial contra un virus altamente patógeno/ H7N1 en modelo de pollo. En general, nuestros resultados proporcionan ideas sobre nuevos enfoques para la vacunación de la gripe y la comprensión de la respuesta inmune frente al virus de influenza en ratones, cerdos y pollos. / Influenza A viruses (IAVs) are responsible for pandemic outbreaks of influenza, and for most of the well-known annual flu epidemics, in humans, poultry and pigs. IAVs are divided into subtypes, based on the nature of their surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). The HA is a homotrimeric surface glycoprotein that mediates influenza viral entry via cellular attachment and membrane fusion events. The receptor-binding pocket of HA is surrounded by antigenically variable antibody binding sites. Therefore, antibodies bounded to these sites should, in principle, block the binding to receptor proteins, inhibiting viral entry, demonstrating hemagglutinin inhibition activity and viral neutralization activity. However, the subunit 1 of HA (HA1) is highly variable across viruses and tends to change under immune pressure and, hence, easily evades the neutralizing antibodies induced by previous vaccinations or infections. The negative implications of influenza virus infections push the world to promote the development of multivalent flu vaccines that protect against all human influenza strains. Therefore, the field of bioinformatics has become a major part of the identification and early validation of new therapeutic targets and could be an essential first step in the development of an effective vaccine for influenza virus that represents the high variability of its antigenic determinants. Therefore, in this thesis it was postulated that the HA1 could represent a potential target for a multivalent vaccine of influenza infection. Consequently, the general objective of this thesis was to select conserved peptides from the HA1 of influenza viruses and to evaluate the efficacy of the selected candidates to induce immunity that can protect animal against infection. To achieve this objective, three studies were undertaken in mice (Chapter 1), pigs (chapter 2) and chickens (Chapter 3). In the first study, we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against the pandemic H1N1 2009 virus and a H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in a mouse model (Chapter 1). In this study, mice were intraperitoneally vaccinated with the peptide mix (NG34+DC89), and next challenged with either the pH1N1 or the H7N1 strain of Influenza virus. Conversely to the 85% mortality observed in control mice, independently of the virus used for challenge, 80% and 66% of the peptide-vaccinated mice survived the challenge with pH1N1 and H7N1, respectively, without detection of influenza viruses (IV). Vaccinated mice surviving correlated with the presence of cross-reactive neutralizing antibodies in sera prior to challenge. The immunization with NG34+DC89 also induced mucosal immune responses demonstrated with the presence of IgA in bronchoalveolar lavage in 50% of the animals. Our results also show that NG34+DC89 is capable to induce cross-neutralizing antibodies and protection against two heterologous IV, pH1N1 and H7N1. Thus, NG34+DC89 represent an attractive immunogen, which could be further optimized for future multivalent vaccine formulations against influenza virus. In the second study, we tested the immunogenicity of a HA1-peptide cocktail in a pig model to assess whether this new formulation can confer immunity to a wide range of IAVs in vitro (Chapter 2). Four peptides (NG34, DC55, RA22 and SS35) within the HA1 from H1 viruses were selected, and evaluated their immunogenicity in conventional farm pigs against homologous and heterologous viruses of influenza. Peptides immunizations induced HA neutralizing and inhibiting antibodies against homologous viruses. Those also cross-reacted against heterologous viruses like H7N1 and H5N2 and, most importantly, the circulating H3N2. Moreover, secretory IgA-specific HA antibodies in nasal swabs were detected. Altogether, the results show that the peptides tested were immunogenic in pigs. The humoral response with hemagglutinin-inhibiting and cross-neutralizing activity generated after immunization could be used in further studies of protective heterosubtypic immunity. In the third study we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in chickens, a natural host model (Chapter 3). In this study, based on ISM, we selected two highly conserved peptides (NG34 and SS35) of a H1 influenza virus strain and used them to vaccinate free-range chickens. The vaccination with both NG34 and SS35 peptides induced specific antibodies that recognized heterologous viruses, as H7N1 HPAIV and H5N2 Low pathogenic avian virus (LPAIV) in vitro. Vaccination with NG34 peptide elicited a protective antibody response that conferred partial protection against a lethal challenge with H7N1 HPAIV. Furthermore, NG34 peptide induced a mucosal immune response, which correlated with reduced viral shedding in oropharyngeal/cloacal swabs and feather pulp. On the contrary, SS35 peptide vaccinated animals failed to produce an efficient protective immune response as no survival against lethal H7N1 challenge was achieved. Finally, it remains to point out that all HA1-peptides from H1 subtype of influenza virus were selected by the method of informative spectra (ISM). Four main general conclusions can be drawn from these studies: (i) HA1-peptides are immunogenic in all the animals models tested (mice, pigs and chickens) and induce humoral and mucosal immune response. (ii) Novel conserved immunogenic peptides from the hemagglutinin subunit 1 protein of influenza viruses confer partial protection against different viral subtypes in mice; (iii) Pigs vaccinated with HA1 peptides elicit neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibody responses against different subtypes of Influenza A virus and (iv) Synthetic peptides from the hemagglutinin of influenza viruses confer partial protection against highly pathogenic A/H7N1 virus in a free-range chicken model. Overall, these data provide insights on new approaches for vaccination in influenza and understanding of the immune response against influenza viruses in mice, pigs and chickens.

La investigación con animales sigue siendo esencial para el avance del conocimiento de los procesos biológicos, especialmente los relacionados con la salud y la enfermedad humana y animal. Los animales más usados en investigación biomédica son los pequeños mamíferos, y más particularmente, los pequeños roedores. Sin embargo, entre estos y el humano hay diferencias esenciales derivadas del tamaño corporal y la longevidad, por lo que el uso de modelos animales de gran tamaño, como la oveja, proporciona en muchos casos una alternativa idónea, principalmente en modelos de ortopedia. Para ello, los animales son normalmente sometidos a anestesia general y por lo tanto, resulta necesario desarrollar nuevas técnicas de refinamiento que disminuyan el dolor en procedimientos experimentales, especialmente en el ovino, cuya evaluación del dolor supone un desafío debido a su especial comportamiento. El presente estudio tuvo como objetivo buscar un refinamiento de la técnica anestésica en ovejas sometidas a un procedimiento ortopédico de defecto óseo segmentario (DOSD), mejorando el bienestar animal y permitiendo disminuir la aplicación de fármacos de rescate, minimizando así el uso de aquellos fármacos que podrían interferir con los objetivos de la investigación. Para la realización de esta tesis se realizó, en primer lugar, una descripción del estudio anatómico correlacionado con la imagen ecográfica de forma detallada del nervio ciático y femoral en la oveja. En segundo lugar, se desarrolló la técnica de bloqueo nervioso ciático y femoral guiado por ultrasonografía y con neuroestimulación. Finalmente, el bloqueo nervioso periférico del nervio ciático pudo aplicarse en la oveja intraoperatoriamente, y prolongarse de forma continua durante el primer periodo postoperatorio con un sistema de infusión. Como conclusión podemos decir que se consiguió reducir el dolor postoperatorio tras la cirugía para la creación del DOSD, haciendo que los animales recuperaran con rapidez la capacidad de carga de la extremidad pélvica. Esto supone un refinamiento de la técnica anestésica, que repercute en una mejora del bienestar animal durante el procedimiento experimental. Creemos, además, que la aplicación de esta técnica podría ser útil en otros procedimientos ortopédicos experimentales en oveja. / Animal research remains essential to advance the understanding of biological processes, especially those related to health and human and animal diseases. The most common animals used in biomedical research are small mammals. However, there are some studies that require larger animals, as rodents often do not faithfully replicate the human disease. Furthermore, between mice and humans there are essential differences in body size and longevity, for which the use of large animal models, among which includes sheep, provides a suitable alternative. Animal models in orthopedic research are usually induced under general anesthesia. Therefore, it is necessary to develop new refining techniques that reduce pain in experimental procedures, especially in sheep, which pain assessment involves a challenge because of the special behavior of these animals. The main objective of this study was to refine the anesthetic technique in sheep that have been included in a segmental diaphyseal bone defect orthopedic study. This suppose a refinement of the anesthetic technique, which results in an improved animal welfare during the experimental procedures, it can allow providing lower doses of rescue medication and also minimizing the use of those drugs that could interfere with the objectives of scientific research. In this Thesis Project, a detailed anatomical description was done, correlated with the echography images of the sciatic and femoral nerves in sheep. Secondly, that peripheral nerve blocking of the sciatic nerve guided with ultrasonography and neurostimulation was applied intraoperatively in sheep. Finally, peripheal nerve blocking of sciatic nerve could be applied intraoperatively and could be extended continuously during the first postoperatory period with an infusion system. As a conclusion, we can expose that pain lowering was achieved after surgery of the segmental diaphyseal bone defect. So, the animals could present a rapid recovery of the load bearing ability of the pelvic limb. This suppose a refinement of the anesthetic technique, which results in an improved animal welfare during the experimental procedures. This new refinement of experimental anesthesia with continuing blockading in sheep could be useful in orthopedic procedures.

La neurología es una de las especialidades veterinarias que más ha evolucionado en los últimos años. Los avances médicos junto a la demanda de la sociedad para diagnosticar y tratar enfermedades neurológicas en perros han contribuido a una mayor compresión de la fisiopatología de estas enfermedades. Aún así, la etiología de ciertas enfermedades sigue siendo desconocida, lo que limita el diagnóstico y tratamiento en muchos casos. La necesidad de nuevas líneas de investigación es clara. Estudios en medicina humana han demostrado la relación existente entre el sistema hemostático y la respuesta inflamatoria, así como la influencia que ejercen los componentes de dicho sistema en la biología tumoral. Ni la posible relación del sistema hemostático con los tumores cerebrales ni la actividad fibrinolítica intratecal han sido estudiados en la especie canina. Los D-dímeros son productos de degradación de la fibrina entrelazada y su presencia es específica de la activación de la cascada de la coagulación. Estudios en humanos y en animales han demostrado que la actividad fibrinolítica local puede medirse mediante la determinación de la concentración de D-dímeros en diferentes fluidos corporales. Esta tesis doctoral ha confirmado que existe activación de la actividad fibrinolítica intratecal en algunas enfermedades neurológicas de los perros y que ésta es independiente de la actividad fibrinolítica sistémica. El incremento significativo de las concentraciones de D-dímeros en el líquido cefalorraquídeo de perros con meningitis-arteritis que responde a cortisona sugiere que la concentración de D-dímeros puede considerarse un biomarcador para dicha enfermedad. Esta tesis doctoral aborda la relación entre el sistema hemostático y el glioma canino y demuestra que el factor tisular, el iniciador de la vía extrínseca de la cascada de la coagulación, se sintetiza en gliomas caninos. Además, demuestra la activación intratumoral de los sistemas de la coagulación y de la fibrinólisis. En conclusión, los resultados de esta tesis doctoral confirman que el sistema hemostático está involucrado en la fisiopatología de algunas enfermedades del sistema nervioso central canino y establece la necesidad de nuevas líneas de investigación, especialmente en enfermedades inflamatorias y neoplásicas del sistema nervioso central de los perros. / Veterinary neurology is one of the most evolving areas in veterinary medicine. Recent medical advances and the greater demand from society to face neurological disorders in veterinary patients have contributed to a better understanding of the underlying mechanisms of neurological diseases in pets. Despite this, the etiologic origin of some diseases still remains obscure, and diagnostic and therapeutic approaches are limited in some cases, so research is needed to solve these problems. Studies in human beings have demonstrated the relationship between the hemostatic system and the inflammatory response as well as the influence of hemostatic system molecules in cancer biology. Neither the activation of the hemostatic system as part of canine brain tumor pathophysiology, nor the intrathecal fibrinolytic activity in dogs with neurologic disorders had been previously studied. D-dimers are specific cross-linked fibrin degradation products and their presence confirms previous coagulation system activation. Previous studies in human beings and animals demonstrated that local fibrinolytic activity can be measured by means of D-dimer concentrations in different biological fluids. In this direction, this PhD thesis confirmed that intrathecal fibrinolytic activity is activated in some canine neurologic disorders, independently of systemic fibrinolytic activity. A significant rise in cerebrospinal fluid D-dimer concentration occurs in dogs with steroid responsive meningitis-arteritis, suggesting that CSF D-dimer concentrations might be potential diagnostic markers of this disease. This PhD thesis also addressed the relationship between the hemostatic system and canine glioma biology and demonstrated that canine gliomas overexpress tissue factor, the extrinsic pathway activator of the coagulation cascade, and that there is intratumoral activation of the coagulation and fibrinolytic systems. In conclusion, the results of this PhD thesis confirm that the hemostatic system is involved in the pathophysiology of some canine central nervous system diseases and provide a new perspective to perform further research, especially on inflammatory and neoplastic disorders of the canine central nervous system.

El virus de la gripe porcina (VGP) es un patógeno importante en el sector veterinario con un gran potencial zoonótico, y por lo tanto se considera también una amenaza potencial para la salud pública. La vigilancia y el control de este patógeno en cerdos es por lo tanto crucial. Los métodos actuales de control se basan en la profilaxis, en particular, en vacunas que suscitan una respuesta de tipo humoral. La capacidad de escape y la alta variabilidad de VGP hacen que la eficacia de estas vacunas pueda verse comprometida; por tanto, deben ser actualizadas periódicamente. El mismo problema se plantea en la salud humana donde se están desarrollando vacunas diseñadas racionalmente con tal de solventarlo. Estas vacunas están siendo diseñadas para potenciar la respuesta de células T contra el virus de la gripe A (VGA). La respuesta de células T esta relacionada con la protección contra la infección por el VGA, centrándose en las proteínas internas y altamente conservadas del virus. Esto permitiría resolver los problemas anteriormente citados. Los epítopos de células T de VGP conocidos en cerdos son sólo unos pocos y están relacionados con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad porcino de clase I (CMHpo-I). La vacunología inversa se utiliza en sanidad humana para identificar los epítopos de células T; sin embargo, en cerdos este concepto se ha sido introducido recientemente y por lo tanto se dispone de pocas herramientas. El objetivo principal de este trabajo era identificar epítopos de células T para diseñar racionalmente vacunas contra VGP. Para este propósito, se abordaron las siguientes estrategias. La vigilancia de VGP es fundamental para un control adecuado. La situación epidemiológica de VGP en España debía ser actualizada y se necesitaban más datos genéticos para permitir el uso de la vacunología inversa. El estudio realizado mostró que la situación epidemiológica de España era similar a la de otros países europeos; las cepas circulantes estaban estrechamente relacionadas y evolucionaron de la misma manera. Sin embargo, también se encontraron exepciones; una cepa evolucionó de forma divergente en España. Se sugiere que el cambio genético pueda ser un evento reciente en la evolución de esas cepas. Los ensayos in vitro para determinar la afinidad de unión de epítopos a CMHpo-I disponibles actualmente son pocos y están basados en moléculas recombinantes. Por lo tanto, en primera instancia se intentó generar una herramienta in vitro basada en la forma nativa del CMHpo-I. Para ello se diseñó y desarrolló casi por completo un ensayo de reconstitución de MHC aplicado a CMHpo-I, para el cual se generaron células C1R que expresaran el alelo SLA-1*es11 de los cerdos singénicos Babraham. Por último se puso a punto el ensayo de desnaturalización. A continuación, se aplicó la vacunología inversa para identificar epítopos de células T. Se predijeron epítopos del VGP in silico mediante NetMHCpan para los alelos CMHpo-I de los cerdos singénicos Babraham (SLA-1*es11 y SLA-2*es22); estos epítopos se probaron mediante ensayos funcionales ex vivo (IFNγ y respuesta de proliferación) usando células de cerdos Babraham inmunizados. Desafortunadamente, este enfoque no dio ningun epítopo positivo. Los epitopos de células T fueron también identificados empíricamente. Las proteínas M1 y NP de un VGA humano fueron seleccionadas como diana, se estudiaron mediante el uso de péptidos solapantes y métodos funcionales (IFNγ y respuestas de proliferación) hasta encontrar epítopos de células T. Los epítopos fueron analizados con células procedentes de cerdos Babraham inmunizados con VGA. Se encontraron dos epítopos CMHpo de clase II solapados, NP405-416 y NP407-420. En otro intento, se utilizó una estrategia más compleja de vacunología inversa. Esta había sido utilizada anteriormente por otros autores y comprende una combinación de métodos: predicción de epitopos in silico mediante NetMHCpan y validación de los resultados utilizando las preferencias de unión del alelo CMHpo determinadas in vitro, analisis in vitro mediante un ensayo de unión y analisis in vivo mediante tetrámeros. Los péptidos fueron identificados en animales infectados y expuestos a dos VGP heterólogos. Esta estrategia demostró ser muy precisa y así se identificó un epítopo inmunodominante (NA171-180). En general, estos datos allanan el camino para el diseño racional de una vacuna contra la SwIV a parte de proporcionar una nueva visión de la respuesta de los cerdos a la infección o inmunización con VGA. / Swine Influenza Virus (SwIV) is an important pathogen in veterinary field with a great zoonotic potential and thus it is considered also a potential threat for public health. Surveillance and control of this pathogen in pigs is therefore crucial. Current methods of control are based on prophylaxis; in particular they are based on vaccines eliciting humoral response. Escaping capacity and high variability of SwIV make that the efficacy of those can be compromised; thus vaccines need to be periodically updated. This problem is shared in human health and thus rationally designed vaccines are being developed. Those are being designed to enhance T cell response against Influenza A Virus (IAV). T cell responses showed to be related with protection against IAV infection, targeting the highly conserved internal protein of the virus. This would solve the problems above cited. T cell epitopes of SwIV in pigs are just few and related to class I Swine Leucocytes Antigens (SLA). Reverse vaccinology is used in human health to identify T cells epitope; however, in pigs this has just recently been introduced and thus just few tools were available. The main aim of this work was to identify T cells epitopes in SwIV to be used in rationally designed vaccines. For this purpose, the following studies were performed. Surveillance of SwIV is fundamental to design a proper control. The epidemiological situation of SwIV in Spain needed to be updated and more genetic data were required to allow the use of reverse vaccinology. The study showed that the epidemiological situation of Spain was similar to other European countries in which circulating strains were closed related and evolving in the same way. However, some exceptions were found; one strain evolved divergently in Spain. Genetic shift has been suggested as a recent event in the evolution of those strains. In vitro assays to determinate binding affinities of epitopes to class I SLA (SLA-I) available were few and based on recombinant molecules. Therefore, in a first instance an in vitro tool based on native forms of SLA-I was attempted. MHC reconstitution assay for SLA-I was designed and almost entirely developed. C1R cells expressing the Babraham pigs allele SLA-1*es11 were generated. Finally, the denaturalization step of the assay was set-up. Reverse vaccinology was then applied to identify T cells epitopes. Epitopes of the virus selected as target were predicted in silico by NetMHCpan on Babraham SLA-I alleles (SLA-1*es11 and SLA-2*es22) and tested by ex vivo functional assays (IFNγ and proliferation responses) using cells from immunised Babraham inbred pigs. Unfortunately, this approach did not give any positive epitope. Additionally, T cells epitopes were empirically identified. Proteins M1 and NP of a human IAV were selected as target and thus dissected by using overlapping peptides and functional methods (IFNγ and proliferation responses) until finding T cells epitopes. The tests were performed using cells from IAV immunised Babraham inbred pigs. Two overlapping SLA-II epitope were found, NP405-416 and NP407-420. In another attempt, a more complex strategy of reverse vaccinology was used. This was previously used by other authors and it is based on a combination of methods: in silico prediction of epitopes by NetMHCpan and validation of results by using in vitro binding preferences of the selected SLA-I allele , an in vitro test binding assay and in vivo test by tetramers. Peptides were identified in animals infected and challenged with two heterologous SwIV. This strategy showed to be highly accurate and thus one immunodominant epitope (NA171-180) was identified. Overall, these data pave the way for rational design of vaccine against SwIV as well as providing new insight into pig responses to infection or immunization with IAV.

Las tortugas terrestres mediterráneas, tortuga mediterránea (Testudo hermanni) y tortuga mora (Testudo graeca), presentan problemáticas similares de conservación en España, si bien, la primera está más amenazada. Los programas de conservación, tanto in-situ como ex-situ, deben incluir una adecuada gestión sanitaria. Uno de los aspectos básicos es el establecimiento de los parámetros sanguíneos de referencia para la adecuada interpretación y evaluación del estado sanitario de cada especie. En el primer estudio, realizado en tortuga mediterránea occidental (T. h. hermanni), se valoró el efecto de dos anticoagulantes, heparina de litio y EDTA tripotásico, sobre los parámetros hematológicos. La heparina de litio fue el anticoagulante de elección para las muestras sanguíneas en estos quelonios. Los procesos infecciosos pueden comprometer la viabilidad de las poblaciones de tortugas y son un importante factor a tener en cuenta para la gestión de los centros de cría en cautividad y para la liberación de animales. En el segundo estudio se describe un brote de rinitis crónica asociada a un herpesvirus en una población cautiva de tortuga mora. Los signos clínicos más relevantes fueron rinitis seromucosa bilateral, estomatitis y glositis. Se realizó un estudio hematológico y bioquímico sanguíneo y se comparó con los datos obtenidos en animales sanos de tres poblaciones diferentes. Los animales enfermos mostraron heteropenia, linfocitosis, incremento en la actividad de la AST y aumento de la concentración de α-globulina. Algunos de ellos tenían anemia normocítica y normocrómica. Las lesiones se circunscribían al aparato respiratorio y a la cavidad oral, con marcada hiperplasia epitelial y presencia de infiltrado mixto inflamatorio en el epitelio de la mucosa oral, nasal y traqueal. La microscopía electrónica evidenció la presencia de partículas virales intracitoplasmáticas e intranucleares que, por su tamaño, forma y patrón de distribución, se correspondían con un herpesvirus. La cría en cautividad de especies en peligro de extinción supone unos riesgos sanitarios que las poblaciones salvajes no tienen. En el tercer estudio se describe un episodio de micobacteriosis sistémica atípica en tortuga mediterránea occidental en una población cautiva. Los síntomas aparecieron al final del período de hibernación, en forma de anorexia, embotamiento y letargia, junto a lesiones inflamatorias y edematosas en las extremidades y cola. Los animales afectados fueron eutanasiados. La mayoría de tortugas presentaron una marcada leucocitosis y anemia. Se observó un incremento de AST, ALT, LDH y FA, disminución de los ácidos biliares e hiperproteinemia, con aumento de la fracción globulina y disminución de la fracción albúmina y del cociente A/G en dos animales. En los aspirados articulares se observaron numerosas células mononucleares con abundantes estructuras bacilares fagocitadas. Mediante una tinción de Ziehl-Neelsen se evidenció la presencia de estructuras bacterianas ácido-alcohol resistente. Las lesiones se localizaron en ovario, páncreas, pulmón, bazo, corazón, musculatura caudal, riñón e hígado. El cultivo e identificación para micobacterias fue positivo, así como la secuenciación molecular, mediante la que se identificó Mycobacterium nonchromogenicum. Los aspectos sanitarios en los reptiles están insuficientemente estudiados y valorados para la cría en cautividad y la conservación de las especies amenazadas. En este estudio se comprueba como la heparina de litio es el anticoagulante de elección para la toma de muestras sanguíneas en tortugas terrestres mediterráneas y como las infecciones por herpesvirus y micobacterias pueden comprometer la conservación ex-situ de estas especies. / Mediterranean tortoises, Hermann’s tortoise (Testudo hermanni) and spur-thighed tortoise (Testudo graeca) have similar conservation issues in Spain, although the first has disappeared from most of its original habitat and is more threatened. Both in-situ and ex-situ conservation programs should include adequate health management. One of the main aspects is the establishment of reference values for blood parameters for the proper interpretation and evaluation of the health status of each species. In the first study, conducted in the western Mediterranean tortoise (T. h. hermanni), the effect of two types of anticoagulants, heparin lithium and EDTA tripotassium, on hematological parameters was evaluated. Heparin lithium is considered as the anticoagulant of choice for blood samples of these chelonians. Infectious diseases can compromise the viability of tortoise populations and are important factors to consider in the management of captive populations and for the release of animals, to reinforce wild populations. In the second study, an outbreak of chronic rhinitis associated with a herpesvirus in a captive population of spur-thighed tortoise is described. The most relevant clinical findings were bilateral effusion rhinitis, accompanied by stomatitis and glossitis. An hematological and serum biochemical study was performed and compared with data from healthy animals from three different populations. Diseased animals showed heteropenia, lymphocytosis, increased AST activity and higher α-globulin concentration. Some tortoises showed normocytic and normochromic anemia. The lesions were confined to the respiratory tract and the oral cavity, with marked epithelial hyperplasia and presence of mixed inflammatory infiltrate in the epithelium of the oral, nasal and tracheal mucosa. Electron microscopy revealed the presence of intracytoplasmic and intranuclear viral particles whose size, shape and distribution pattern corresponded to a herpesvirus. Captive breeding of endangered species are more subjected to health risks that wild populations. In the third study, an episode of systemic atypical mycobacteriosis in a captive population of Western Hermann’s tortoise is described. The symptoms appeared at the end of the period of hibernation, in the form of anorexia, dullness and lethargy, with inflammatory and edematous lesions on the limbs and tail. Blood samples, joint taps and skin biopsies were performed. Lately, euthanasia of affected animals was performed. Most tortoises showed marked leukocytosis, with heteropenia, monocytosis and a large number of mononuclear cells, and five animals had anemia. An increase in the values of AST, ALT, LDH and FA, a decrease in bile acids and hyperproteinemia with increased globulin and decreased albumin and A/G ratio were observed. In joint taps, mononuclear cells with phagocytosed bacillary structures were obseved. Ziehl-Neelsen stain revealed the presence of acid-fast bacteria. Lesions were observed in ovaries, pancreas, lungs, spleen, heart, muscle, kidney and liver. Culture and identification were positive for mycobacteria and molecular sequencing lead to the identification of Mycobacterium nonchromogenicum. Health aspects in reptiles are insufficiently studied and assessed for captive breeding and conservation of threatened species. In this study, it was found that lithium heparin is the anticoagulant of choice for blood sampling in Mediterranean tortoises and infections such as those cause by herpesvirus and mycobacteria may compromise the ex-situ conservation of these species.

El visón europeo Mustela lutreola es uno de los mamíferos más amenazados del Mundo. El visón americano Neovison vison se considera actualmente su principal amenaza. Sin embargo, la introducción del visón americano y la concurrencia ecológica posterior de las dos especies no puede explicar, por si sola, la disminución o desaparición del visón europeo en diferentes épocas y lugares. El parvovirus de la enfermedad aleutiana del visón (AMDV) es el principal problema sanitario mundial en las granjas de visón americano, causante de diferentes síndromes clínicos dependiendo de la cepa vírica y de las características del animal. Se realizaron serologías frente el AMDV en muestras de 492 visones europeos y en 1.735 visones americanos durante un periodo de 16 años. Se realizó una determinación de las edades en tres especies de mustélidos. Caninos procedentes de 1.766 cadáveres de 1.661 visones americanos, 54 visones europeos y 51 turones europeos Mustela putorius se seccionaron y se utilizó el recuento de los anillos en el cemento dental para estimar la edad de los ejemplares. Las muestras de visones americanos procedían principalmente de las campañas de control de esta especie exótica invasora, mientras que los atropellos fueron la causa principal de muerte en las dos especie autóctonas. De forma paralela se realizó un análisis de las estructuras demográficas de tres poblaciones de visón americano sometidas a diferente intensidad de control con el objetivo de detectar posibles variaciones en estas estructuras causadas por la captura. La seroprevalencia del AMDV en el visón europeo fue del 32%. No se detectaron diferencias significativas en la seroprevalencia entre sexos o entre años o pesos. La incidencia de seroconversión (negativo a positivo) en visones europeos recapturados fue de 0,46 casos por animal-año de riesgo. Para los animales positivos, la incidencia de seroconversión de un resultado positivo a uno de negativo fue de 0,18 casos por animal- año de riesgo. En 1.735 visones americanos, la prevalencia global fue del 32,4% y ésta varía entre las seis poblaciones silvestres estudiadas y se incrementa con la edad de los animales. Los resultados indican que la infección es endémica, distribuida por todas las poblaciones y no se observaron efectos sobre la dinámica poblacional de ambas especies. ADN del AMDV se detectó mediante PCR y se secuenció y los resultados sugieren que al menos dos tipos de secuencias de AMDV circulan en España y que los AMDV presentes difieren de otros aislados en Norte América y Europa. En relación a las estructuras demográficas, los individuos con edad anterior a su primera temporada de cría representaron aproximadamente la mitad de todos los animales, sin diferencias significativas entre especies o causa de muerte. Se observaron diferencias en los porcentajes de sub-adultos entre los períodos pre- y post-reproductor, con una alta mortalidad durante el período de dispersión-invierno en las tres especies. Las frecuencias de mortalidad de los animales sub-adultos fueron de 0,46, 0,50 y 0,55 para el visón americano, el visón europeo y el turón europeo. Las tasas de supervivencia del visón americano fueron más altas que para las especies nativas. No se observaron diferencias en la edad media de los animales encontrados muertos en atropellos entre las tres especies ni entre visones americanos atropellados y capturados. No se detectaron evidencias de cambios en la estructura de edades en ninguna de las poblaciones. La proporción de individuos de cada sexo y clase de edad se mantuvieron constantes, lo que sugiere que a pesar de los trabajos de control del visón americano, la estructura de edades se mantuvo estable durante el período de estudio. / The European mink (Mustela lutreola) is one of the most endangered mammals in the world. The invasive American mink (Neovison vison) is considered the main factor for this decline. However, the American mink’s introduction and the subsequent ecological concurrence of the two species cannot solely explain the decline or disappearance of the European mink in different times and places. Aleutian mink disease parvovirus (AMDV) is the main health problem in fur farming worldwide, causing varied clinical syndromes that depend on the viral strain and host factors. Infection with AMDV has been speculated to contribute to the decline of the European mink, but a detailed study has not been performed. To assess the potential effects of AMDV infection on the conservation of the European mink, we surveyed AMDV antibody in samples from 492 native European mink and 1,735 feral American mink collected over 16 yr. In order to investigate a possible AMDV impact on demographic structures, age estimation of three mustelid species was performed. Canine samples of 1,766 carcasses from 1,661 American mink, 54 European mink and 51 European polecats (Mustela putorius) were sectioned, and cementum annuli counts in tooth sections were used for age estimation. American mink samples consisted primarily of trap-captured animals, whereas road casualties were the principal origin of European mink and European polecat carcasses. Simultaneously, the demographic structures of three mink populations subjected to different culling intensities were studied with the aims to detect possible variations in these structures caused by trapping, and identify simple and efficient indicators of successful trapping efforts. The antibody prevalence in European mink was 32%. There were no statistically significant differences in antibody prevalence between sexes, or among years or weight classes. For recaptured European mink, incidence of seroconversion (negative to positive) was 0.46 cases per animal-year at risk. For positive animals, the incidence of conversion from positive to negative was 0.18 cases per animal-year at risk. In 1,735 feral American minks, the overall prevalence was 32.4% and varied among the six wild populations studied. The prevalence increased with age. Infection with AMDV appears to be endemic, distributed across the entire ranges of both species, and no effects on the population dynamics of either species were observed. AMDV DNA was detected PCR and sequenced and the results suggested that two sequence types of AMDV were circulating in Spain, and that the Spanish AMDVs differed from other described isolates from North America and Europe. In demographic structures, individuals prior to their first breeding season (class 0+) represented approximately half of all animals, with no significant differences between species or causes of death. Differences in sub-adult percentages were observed between the pre- and post-reproductive period, with a high mortality during the dispersal-winter period in all three species. Frequencies of mortality of the sub-adult age class were 0.46, 0.50 and 0.55 for American mink, European mink and European polecat, respectively. Survival rates of the American mink were higher than those of the native species. No differences were observed in mean age of animals found dead as road casualties in all three species or between captured American mink and road casualties. In relation with the culling effect over the studied populations, no evidence of age structure changes was detected in any population. The proportion of individuals in each sex and age class remained constant over time, suggesting that despite the control efforts, the age structure remained stable over the study period.