El creixement i el desenvolupament dels vedells durant l’alletament és crucial per la seva futura productivitat. En aquesta tesi es van realitzar quatre estudis per avaluar diferents estratègies de millora dels paràmetres productius i de salut dels vedells alletats Holstein. Al primer estudi es va avaluar la integritat intestinal dels vedells recent nascuts i es va associar aquesta amb la incidència de diarrees durant els primers dies de vida. Es va veure que els vedells que desenvolupaven diarrees durant els primers 7-14 dies de vida havien nascut amb una permeabilitat intestinal elevada, la qual cosa suggereix que els vedells que més endavant desenvolupen diarrees possiblement hagin nascut més predisposats a patir-les. Al segon estudi es van avaluar els efectes de l’addició del probiòtic L. rhamnosus en dues dosis diferents (107 or 109 CFU/50kg de pes viu) durant 14 dies en el període de deslletament sobre la microbiota fecal, la immunitat i el creixement. Va resultar que els vedells complementats amb el probiòtic no van tenir millor immunitat ni creixement possiblement perquè la microbiota fecal no es va veure afectada per la ingestió de L. rhamnosus. Al tercer estudi es van avaluar els efectes de l’addició de butirat en forma de butirat sòdic o tributirina al lactoreemplaçant, amb dosis de 3 g/kg de matèria seca, durant 42 dies en el creixement, el metabolisme de la glucosa i la incidència de diarrees. Els vedells complementats amb butirat van tendir a tenir una major incidència de diarrees i els vedells complementats amb tributirina van tenir un creixement menor que els vedells control. A més, l’addició de butirat al lactoreemplaçant no va influenciar el metabolisme de la glucosa. Al quart estudi es van avaluar els efectes en el creixement d’incrementar el nivell d’alimentació dels vedells durant el període d’alletament i fins a dues setmanes després. Els vedells prenien 4 o 6 L/d de lactoreemplaçant en combinació amb un pinso baix (4.1%) o alt (11.2%) en greix. Es va veure que els vedells que prenien més lactoreemplaçant creixien més durant el període d’alletament i quan aquests menjaven un pinso alt en greix seguien creixent més també després del deslletament, a diferència dels que menjaven un pinso baix en greix que van disminuir el seu creixement un cop es va deixar d’oferir lactoreemplaçant. En conclusió, els vedells que pateixen diarrees durant el seu desenvolupament van néixer amb una permeabilitat intestinal elevada. A més, suplementar els vedells alletats amb L. rhamnosus i amb butirat al lactoreemplaçant després del deslletament (amb dosis de 107 o 109 CFU/50kg de pes viu durant 14 dies) i abans del deslletament (amb dosis de 3 g/kg de matèria seca durant 42 dies), respectivament, no va resultar en avantatges sobre la salut i el creixement. En canvi, incrementar el nivell de greix del pinso (fins al 11.2%) quan els vedells prenien 6 L/d de lactoreemplaçant va resultar en un major pes viu abans i després del deslletament. / Growth and development of young calves is crucial for the later productive parameters. In this thesis, four studies were conducted to evaluate different strategies to improve performance and health of suckling Holstein calves. In the first study, intestinal integrity of newborn calves was evaluated and associated with the development of diarrhea during the first days of life. It was found that calves that incurred diarrhea during the first 7-14 days of life had been born with an increased intestinal permeability suggesting that diarrheic calves may have been more predisposed to suffer scours. In the second study, the effects of supplementing calves with the probiotic L. rhamnosus around weaning in two different doses (107 or 109 CFU/50kg of body weight) for 14 days on the modulation of the fecal microbiota, performance and immunity around weaning were evaluated. Calves that had been supplemented with the probiotic showed no improved performance or immunity possibly due to the lack of modulation of the fecal microbiota by the ingestion of L. rhamnosus. On the third study, the effects of supplementing lactating calves with butyrate in the form of sodium butyrate or tributyrin in the milk replacer, at doses of 3 g/kg of dry matter, for 42 days on performance, glucose metabolism and incidence of diarrhea were evaluated. Calves that had been supplemented with butyrate tended to have increased incidence of diarrhea and calves supplemented with tributyrin showed retarded growth compared to control calves. Also, butyrate addition in the milk replacer resulted in no improved glucose metabolism. The fourth study evaluated the effects on performance parameters of an enhanced feeding program before and after weaning. Calves were fed either 4 or 6 L/d of milk replacer in combination with a low fat (4.1%) or a high fat (11.2%) starter feed. Results showed that calves fed increased daily amount of milk replacer had improved growth before weaning and calves that were also fed a high-fat starter feed had the greatest body weight after weaning in contrast with calves fed 6 L/d of MR and a low-fat starter feed that showed decreased growth once milk replacer was no longer provided. In conclusion, calves that experienced diarrhea early in life were born with increased intestinal permeability. Moreover, supplementing calves with L. rhamnosus or with butyrate in the milk replacer at weaning (at doses of 107 or 109 CFU/50kg of body weight for 14 days) and during the preweaning period (at doses of 3 g/kg of dry matter for 42 days), respectively, had no beneficial effects on performance and health. However, increasing the amount of fat in the starter feed to 11.2% when calves were fed 6 L/d of milk replacer increased overall body weight before and after weaning.

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La gripe es un problema de salud pública en todo el mundo, siendo una de las enfermedades infecciosas más comunes y una patología de las vías aéreas altamente contagiosa. Desde abril de 2009, un nuevo virus de influenza A H1N1, con origen porcino dio lugar a la aparición de brotes en todo el mundo siendo declarada posteriormente como una situación de pandemia. Hoy en día el virus pdmH1N1 de 2009 continúa en circulación, generalmente provocando infecciones leves y autolimitadas. Sin embargo, un pequeño porcentaje de pacientes requieren hospitalización y atención especializada en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI). Es digno de mención comentar que se ha identificado un aumento en la producción de citoquinas proinflamatorias en pacientes de UCI. Esta observación sugiere la hipótesis de que la heterogeneidad en el resultado de la infección por virus de la gripe pdmH1N1 de 2009 podría ser debido no sólo a la diferencia entre fitness /virulencia de las diversas cepas de virus pandemico circulantes, sino también por el medio ambiente inmune del huésped que pueden contribuir a la patogénesis respiratoria grave, probablemente por una respuesta inmune exacerbada asociada a hipercitoquinemia. Para probar esta hipótesis el presente trabajo se divide en cuatro estudios que describen los experimentos realizados en ratones y hurones con los virus pdmH1N1 de 2009 aislados durante el brote de 2009 de pacientes que mostraron grados de enfermedad desde leve a severa con el fin de analizar las características patológicas de la infección. Los experimentos en los capítulos 5 y 6 se llevaron a cabo con el fin de evaluar si los altos niveles de citoquinas proinflamatorias y, en particular IL-6, podrían afectar a la respuesta inmune del huésped y al curso clínico de la infección. Los ratones fueron tratados con LPS o ratones que expresaron altos niveles de IL-6 fueron infectados con el virus pdmH1N1 de 2009 (CAT09) simultáneamente. En el caso de la exposición a LPS, los resultados mostraron que los signos clínicos y la pérdida de peso fueron directamente influenciadas por LPS en los animales infectados con CAT09. Sin embargo, no se detectaron diferencias en la carga viral de los pulmones de los ratones infectados con exposición de LPS, lo que indica que el tratamiento con LPS no estaba afectando a la replicación viral in vivo. La secreción de IL-6 después de la exposición a LPS correlacionó con pérdida de peso corporal a mayor grado de patología. El papel de la IL-6 en la infección por influenza se abordó mediante la inducción de IL-6 en ratones antes de ser infectados con CAT09. Una vez más, los niveles de IL-6 se correlacionaron con la pérdida de peso. Sorprendentemente, la replicación viral no fue afectada por altos niveles de IL-6 debido a que la carga viral no mostró diferencias significativas cuando se compararon los dos grupos infectados, aunque los animals infectados con alto nivel de IL-6 aclararon el virus antes que los animales infectados con CAT09. Se detectó una fuerte respuesta de anticuerpos en los animales infectados, siendo los ratones infectados sólo con CAT09 sin tratamiento con IL-6, los que obtuvieron los mayores títulos de inhibición de hemaglutinación. IL-10 correlacionó con los niveles de IL-6 en el suero y en los pulmones en los primeros días después de la infección. Finalmente, las lesiones histopatológicas fueron más graves en los ratones con altos niveles de IL-6 e infectados con CAT09. Desde el inicio de la pandemia de 2009, mutaciones de resistencia a oseltamivir (OsR) se han descrito en virus circulante pdmH1N1 de 2009. En el capítulo 7 estudios in vitro e in vivo en el que se compararon dos cepas (R6 y R7) de virus pandémico OsR. Hubo diferencias in vitro en la cinética de ambos virus que finalmente se reflejó en la patogénesis de la infección in vivo. Los resultados obtenidos en el análisis in vitro mostraron diferencias en el fitness en la replicación viral de los virus estudiados respecto a un virus sensible a oseltamivir (F), siendo F > R6 > R7. En el siguiente experimento in vivo, ambas cepas OsR produjeron un resultado fatal aunque en diferente magnitud y cinética; el grupo infectado con R6 experimentó un 40 % de letalidad y el grupo R7 un 20 % a los 4 dpi. Sin embargo, a 7 dpi el porcentaje de supervivencia fue de un 50 % para ambos grupos infectados con virus OsR. La replicación viral detectada en los pulmones de los grupos infectados con virus OsR obtuvo los valores no estadísticamente diferentes para R7 que para R6. Hubo una fuerte respuesta de anticuerpos a los 14 dpi en ambos grupos infectados para cada virus, pero no anticuerpos de reacción cruzada. Curiosamente, se detectaron altos niveles de IL-6 en el suero de los ratones R7 con diferencias significativas. Sorprendentemente, los niveles de IL-6 en los pulmones de R6, R7 y animales control fueron similares a todos los tiempos sin diferencias estadísticas. Niveles de IL-10 de suero y pulmón mostraron valores ligeramente más altos también en ratones R7 en comparación con los controles a los 3 y 5 dpi, respectivamente. Hallazgos histopatológicos mostraron lesiones más severas en ratones R7 a 5 dpi. Para analizar las posibles diferencias de virulencia, se infectaron hurones con dos virus pdmH1N1 de 2009 de dos pacientes sin condiciones comórbidas conocidas, uno con consecuencia fatal (F), mientras que el otro sólo mostró enfermedad respiratoria leve (M). Este estudio está comprendido en el capítulo 8. Los hurones desarrollaron diferente grado de severidad de signos clínicos que no se correlacionaron con el origen del virus utilizado en la infección, exhibiendo patología severa (S) o no severa (NS). Se detectó una disminución significativa en el peso corporal en los animales S en comparación con los animales NS a 4 a 7 dpi. La evolución clínica de la infección se relaciono directamente con los hallazgos histopatológicos. El análisis de las proteínas de fase aguda mostró que las concentraciones de haptoglobina (HP) y amiloide A sérico (SAA) incrementaron en ambos grupos después de 2 pi. Los títulos de virus en todos los tejidos fueron más altos en los hurones pertenecientes al grupo S en comparación con los hurones pertenecientes al grupo de NS a 4 dpi. Los animales infectados con ambos virus mostraron una fuerte inhibición de la hemaglutinina de la respuesta de anticuerpos en el suero de ambos virus a 10 y 14 dpi. Los hurones con un progreso severo de la infección clínica mostraron respuestas de anticuerpos ligeramente más altos y los títulos virales más altos después de la infección. / Influenza is a worldwide public health concern, being one of the most common infectious diseases and a highly contagious airborne pathology. From April 2009, a new influenza A H1N1 virus with swine origin gave rise to the emergence of worldwide outbreaks which was subsequently declared as a pandemic situation. Nowadays pdmH1N1 2009 virus continues on circulation and generally triggers mild and self-limiting infections. Nevertheless, a small percentage of the patients require hospitalization and specialized attention in Intensive Care Units (ICUs). Noteworthy, in ICU patients an increased proinflammatory cytokine production has been identified. This observation would suggest the hypothesis that the heterogeneity in the outcome of pdmH1N1 2009 influenza virus infection could be due not only to differential fitness/virulence of the diverse circulating pandemic virus strains but also to the host immune environment that may contribute to severe respiratory pathogenesis, probably by an exacerbated immune response associated to hypercytokinemia. To test such hypothesis the work was divided in four studies describing the experiments performed in mice and ferrets with pdmH1N1 2009 viruses isolated during the 2009 outbreak from patients that showed mild to severe disease in order to analyse pathological features of the infection. Experiments in chapters 5 and 6 were conducted in order to evaluate whether high levels of proinflammatory cytokines and in particular IL-6, might affect host immune responses and the clinical course of infection. Mice were treated with LPS or mice expressing with high levels of IL-6 were infected with pdmH1N1 2009 (CAT09) simultaneously. In the case of LPS exposure, results showed that clinical signs and weight loss were directly influenced by LPS in CAT09 infected. However, no differences in viral load of lungs from infected mice were detected upon LPS exposure, indicating that LPS treatment was not affecting viral replication in vivo. IL-6 secretion upon LPS exposure correlated with body weight loss and higher pathology. The role of IL-6 in influenza infection was addressed by inducing IL-6 in mice prior CAT09 infection. Again, IL-6 levels correlated with weight loss. Surprisingly, viral replication was not affected by high levels of IL-6 since viral load did not exhibit significant differences when both infected groups were compared, although high level of IL-6 in infected animals correlated with sooner viral clearance than the CAT09 infected animals. A strong antibody response was detected in infected animals, being only CAT09 infected mice without IL-6 treatment, the ones with the highest hemagglutinin inhibiting titers. IL-10 levels correlated with IL-6 levels in serum and lungs in the first days after infection. Finally, histopathological lesions were more severe in mice with high levels of IL-6 and CAT09 infected. From the onset of the 2009 pandemic, oseltamivir resistance (OsR) mutations have been described on circulating pdmH1N1 2009 viruses. In chapter 7, in vitro and in vivo experiments in which two strains (R6 and R7) of OsR pandemic virus were compared. There were kinetics differences in both virus in vitro that finally were reflected in the pathogenesis of infection in vivo. The results obtained in the in vitro analysis showed different fitness in viral replication in the virus studied in comparison with a oseltamivir sensitive virus (F), being F>R6>R7. On the following in vivo experiment, both OsR strains produced a fatal outcome although with different magnitude and kinetics, R6-infected group experimented a 40% of lethality and R7-group a 20% at 4 dpi. However, at 7 dpi the percentatge of survival was a 50% in both OsR-infected groups. Viral replication detected in lungs from OsR-infected groups had higher but not statistically different values for R7 than for R6. There was a strong antibody response at 14 dpi on both infected groups for each virus but no cross- reactive antibodies. Interestingly, high levels of IL-6 were detected in serum from R7-mice with significant differences. Surprisingly, levels of IL-6 in lungs of R6, R7 and control animals were similar at all time-point with no statistical differences. Serum and lung IL-10 had also slightly higher values in R7-mice when compared with controls at 3 and 5 dpi respectively. Histopahological findings showed more severe lesions on R7-mice at 5 dpi. To analyze possible virulence differences in viral fitmess, ferrets were infected with two contemporary pdmH1N1 2009 viruses from two patients without known co-morbid conditions, one that became fatal (F) while the other only showed mild (M) respiratory disease. These were studied in chapter 8. Ferrets developed different degree of clinical signs severity that did not correlate with the origin of the virus used in the infection, exhibiting severe (S) or non severe (NS) pathology. A significant decrease in body weight was detected in S animals compared to NS animals at 4 to 7 dpi. Clinical progress of the infection correlated directly with histopathological findings. The analysis of the acute phase proteins showed that the concentrations of haptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) increased in both groups after 2 dpi. Virus titres in all tissues were higher in ferrets belonging to S group when compared to ferrets belonging to NS group at 4 dpi. Animals infected with both virus showed a strong hemagglutinin inhibiting antibody response in sera to both viruses at 10 and 14 dpi. Ferrets with a severe progress of the clinical infection showed slightly higher antibody responses and higher viral titers after infection.

Un total de 141 granjas porcinas de Cataluña se analizaron con el fin de averiguar la prevalencia de portadores de Salmonella spp, caracterizar las cepas aisladas y determinar que factores pueden influir en la aparición y mantenimiento de este microorganismo en las granjas. Para ello se realizó una encuesta epidemiológica y se recogieron muestras individuales de heces de reproductoras y de los corrales de los animales de engorde. Las muestras se sembraron en caldo Rapapport-Vassiliadis y se realizaron subcultivos a las 24 y 48 horas en agar XLT4. De las colonias identificadas como Salmonella spp. se realizó el serotipado, fagotipado y el estudio de sensibilidad frente a 18 antimicrobianos. Por otra parte, se evaluaron serológicamente 141 unidades de engorde en la comarca de Osona y se realizó una comparación de dos ELISAs disponible comercialmente para el diagnóstico de la salmonelosis porcina. Las muestras de sangre recogidas se evaluaron mediante ELISA (Svanova Biotech, Uppsala, Suecia). Para la prueba de comparación se seleccionaron 361 (reproductoras y engordes) sueros porcinos de estatus bacteriológico conocido y se analizaron mediante el ELISA Svanova y otro ELISA comercial (Salmotype, Labor Diagnostik, Leipzig, Alemania). Los resultados de ambas pruebas se compararon mediante el valor kappa. Los resultados bacteriológicos permitieron clasificar 39 granjas (28,06%) con una o más muestras positivas a Salmonella, identificándose 17 serotipos diferentes en el total de explotaciones. De ellos, el más frecuente fue Salmonella Anatum en las reproductoras y Salmonella Typhimurium en los engordes. El 68,8% de las cepas aisladas fue resistente a las tetraciclinas, un 67,7% a la sulfamida y un 53,1% a la combinación sulfamida + trimetoprim. El 62,50% de las cepas presentó resistencia a tres o más antimicrobianos simultáneamente. Todas las cepas analizadas fueron sensibles a la ceftriaxona y a la colistina. En el análisis serológico se determinó una seroprevalencia del 77,3% de granjas positivas. Los factores epidemiológicos que se relacionaron con la presencia de portadores de Salmonella en las granjas de reproductoras (p<0,05) fueron tener censo de hembras adultas superior a 250 cabezas, la presencia de drenajes de purines abiertos y la ausencia de métodos de control de roedores. En las granjas de engorde la presencia de otras especies de animales de abasto y el número de plazas de engorde (>1600) fueron factores de riesgo significativos. Con respecto a la serología, dos factores se asociaron significativamente con la infección: la falta de medidas para evitar la entrada de pájaros y el uso de aguas de bebida provenientes de pozos artesanos. En la comparación de pruebas serológicas se vió una pobre concordancia (kappa= 0,191) entre ambos ELISAs. De estos resultados se concluye que un porcentaje considerable de granjas porcinas de Cataluña presentan animales con excreción activa de Salmonella, presentándose una gran variedades de serotipos con unos perfiles de multirresistencia a los antimicrobianos muy amplios. El estudio epidemiológico realizado muestra que, en los cerdos, la infección por Salmonella está estrechamente relacionada con factores de bioseguridad elementales. / A total of 141 pig farms of Catalonia were analysed to determine the prevalence of carriers of Salmonella spp. and the factors can influence the entrance and maintenance of this microorganism in the farms. To achieve these goals, an epidemiological survey was carried out. Sampling was done by collection of faecal samples of sows and pooled faecal samples in finishing pens. Faeces were inoculated in Rapapport-Vassiliadis broth and subcultures were performed onto XLT4 agar at 24 and 48 hours of incubation. Bacterial colonies suspected to be Salmonella were further confirmed by serotyping and phagetyping and were also tested for its susceptibility against a panel of 18 antimicrobial agents. On the other hand, 141 fattening units of Osona county were examined serologically by means of an ELISA. Three hundred and sixty-one of these serum samples were further used to compare two ELISAs commercially available for the diagnosis of swine salmonellosis by using the kappa value. The bacteriological analysis yielded 39 farms (28%) with one or more positives samples to Salmonella. The isolated strains belonged to 17 different serotypes. The most frequent was Salmonella Anatum in the sows and Salmonella Typhimurium in the fattening pigs. Antimicrobial susceptibility tests showed that the highest level of resistance was against tetracicline (68.8%), sulphonamides (67.7%) and their combination with trimethoprim (53.1%). Sixty-two percent of the strains showed resistance to three or more antimicrobial agents. None of the strains was resistant to colistin or ceftriaxone. With regards to the serological analysis, we found a seroprevalence of 77.3% of positives farms. The epidemiological factors that were related to the presence of carriers of Salmonella in sows (p<0,05) were to have census of adult females >250 heads, the presence of open drainages of sewage and the absence of rodent control programmes. In fattening pigs, risk factors were: the number of present pigs (> 1600) and presence of other species of livestock in the farm were significant factors of risk. In the serological study, two factors were significantly associated with the infection status: the lack of measures to avoid the entrance of birds and the use of water obtained from wells. Comparison of serological tests, showed a poor agreement (kappa = 0.191) between both ELISA. Of these results we can conclude that a considerable percentage of farms pig of Catalonia have animals with active excretion of Salmonella and that there is a great diversity of serotypes all of which can have multidrug resistance profiles. The epidemiological study showed that, in the pigs, infection by Salmonella is closely related to elementary factors of biosafety.

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Las nuevas vacunas de subunidades están abriéndose paso dentro de la vacunología veterinaria y entre ellas, las pseudopartículas virales o VLPs (por su nombre en inglés “virus-like particles”) son una de las estrategias más atractivas que están abriendo nuevas fronteras en la vacunación de animales. Las VLPs son estructuras proteicas rígidas con un tamaño dentro del rango de los nanómetros, que presentan una geometría muy bien definida y una espectacular uniformidad que mimetiza la estructura de los virus nativos de los que proceden. Las VLPs tienen importantes ventajas en relación a la seguridad por el hecho de carecer de genoma viral, que elimina cualquier riesgo asociado a la replicación viral, reversión, recombinación o reorganizamiento genómico. La proteína de la cápside del virus de la fiebre hemorrágica del conejo (por su nombre en inglés “Rabbit haemorrhagic disease virus” o RHDV) es capaz de formar RHDVVLPs y estas partículas han demostrado poseer una fuerte inmunogenicidad, protegiendo al hospedador natural tras un desafío mortal. Además, estudios anteriores apuntaron la posibilidad de usar RHDV-VLPs como vector para mejorar la inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, no hay estudios que hayan investigado la posibilidad de usar las RHDV-VLPs como vector vacunal con epitopos de enfermedades virales de animales. El objetivo de esta tesis es estudiar el potencial inmunogénico de las RHDV-VLPs como vectores vacunales de enfermedades virales en diferentes animales. En los dos primeros estudios, se investigó la inmunogenicidad de las RHDV-VLPs en el modelo murino, tanto in vitro como in vivo. Los resultados de estos estudios demostraron que el epítopo insertado era procesado y presentado mediante MHC-I por células dendríticas y que la inmunogenicidad dependía de los diferentes sitios de inserción. Las RHDV-VLPs quiméricas fueron capaces de proteger a los ratones frente a un desafío viral. También, la respuesta se vio alterada según la ruta de administración del antígeno. El tercer estudio confirmó los resultados en ratón, pero esta vez en experimentos in vitro con células de cerdo. Por último, se estudió inmunogenicidad de las RHDV-VLPs quiméricas en cerdo. Los resultados mostraron que la ruta de administración y el adjuvante determinaron la respuesta inmune después de la inmunización con las RHDVVLPs quiméricas y que los animales presentaban muy buena respuesta inmune celular y humoral, no solo frente a RHDV-VLPs sino frente al epítopo antigénico. Estudios posteriores se tendrán que abordar para demostrar la protección de los cerdos. En conclusión, en esta tesis se demuestra el potencial de las RHDV-VLPs como inmunógenos en dos sistemas animales diferentes. / New subunit vaccines are getting a foothold in veterinary vaccinology and virus-like particles (VLPs) are one of the most appealing approaches opening up frontiers in animal vaccines. VLPs are robust protein cages in the nanometer range exhibiting welldefined geometry and remarkable uniformity that mimic the overall structure of the native virions. VLPs have an important advantage in terms of safety; indeed, lacking the genome of the virus avoid any of the risks associated with virus replication, reversion, recombination or re-assortment. Rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) capsid protein is able to form RHDV-VLPs and these particles showed a strong immunogenicity and protected the natural host after a lethal challenge. Additionally, previous studies described the possibility to use RHDV-VLPs as platform for the insertion of foreign epitopes or for DNA packaging. Nowadays, one study has shown the possibility to use RHDV-VLPs as carrier for improving cancer immunotherapies but no studies have investigated the possibility to use RHDV-VLPs as vaccine vectors carrying epitopes corresponding to viral animal diseases. This thesis is aimed to study the potential immunogenicity of RHDV-VLPs as epitope carriers for viral disease in different animal models. In the first two studies, the immunogenicity of chimeric RHDV-VLPs was investigated in a murine system in vitro and in vivo. Results from these studies demonstrated that the inserted epitope was processed and presented in an MHC-I context by dendritic cells (DCs) and that the different sites of insertion of the epitope influenced the immunogenicity of the VLPs. Chimeric RHDV-VLPs were able to protect mice from a viral challenge. Also, the route of antigen delivery influenced the immunogenicity of the particles. The third study confirmed the initial results but this time in in vitro experiments using porcine cells. Lastly, chimeric RHDV-VLPs were studied as immunogens in pigs. The results showed that the delivery route and adjuvant influenced immune responses after chimeric RHDV-VLP immunization and more importantly that pigs exhibited very good cellular and humoral immune responses against not only RHDV-VLPs but also against the antigenic epitope. Further studies have to be performed to prove protection in pigs. In conclusion, in this thesis we demonstrated the potential of RHDV-VLPs as immunogens in two different animal systems.

La leche y los productos lácteos son alimentos con un alto valor nutritivo pero también susceptibles de contaminación y principales vehículos de introducción de aflatoxina M1 (AFM1) en la dieta, ya que no es destruida por los tratamientos convencionales térmicos de pasteurización o esterilización usados en la industria láctea para higienizar estos productos, y así puede estar presente en yogurt, queso, leche deshidratada y otros productos lácteos. La International Agency for Research on Cancer (IARC) de la OMS, ha categorizado la AFM1 como carcinogénica y tóxica para humanos en el Grupo 1. En este trabajo se analizó la presencia de AFM1 en leche y productos de base láctea comercializados en el área metropolitana de Monterrey, N.L., México, y se evaluaó el consumo de estos productos susceptibles de contaminación por AFM1 en la población por grupos de edad, así como el índice de riesgo carcinogénico. En el primer muestreo se analizaron 84 muestras por la técnica ELISA, de las cuales 20 fueron leche pasteurizada y 64 con proceso térmico UHT, de las cuales 48 fueron leches con presencia de grasa butírica y 16 producto lácteo con presencia de grasa vegetal. Las leches pasteurizadas presentaron un 100% de presencia de AFM1, con una media de 0,39 μg/L y un 20% de las muestras por encima de lo que establece la NOM-243-SSA1-2010 (0,5 μg/L), mientras que de los productos UHT, todas mostraron presencia de AFM1, siendo la leche que contiene grasa butírica la que en promedio se encontró dentro de la NOM con 0,45 μg/L y un 38% de las muestras sobre el límite marcado por la NOM, mientras que el producto lácteo mostró un promedio de 0,66 μg/L y un 69% de las muestras por encima de lo que establece la NOM. En el segundo muestreo se analizaron 162 muestras de leche, incluyendo leche bronca (n = 51), fórmula infantil (n = 55), leche deshidratada (n = 15) y leche y producto lácteo UHT (n = 41), colectadas en supermercados y analizadas por extracción en columnas de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales y cuantificadas mediante HPLC con detector de fluorescencia. Con el objetivo de determinar la ingesta promedio diaria de AFM1 por grupos de edad y poder establecer el índice de riesgo carcinogénico se utilizó la encuesta ENSANUT-2012 correspondiente a Nuevo León, aplicando la fórmula descrita por Kuiper-Goodman (1994). De las 51 muestras de leche bronca analizadas, 16 de éstas resultaron positivas (31%), obteniéndose 2 muestras (4%) por encima del límite máximo que establece la NOM y una media de 0,07 μg/kg. De las 55 fórmulas infantiles analizadas, 11 de éstas mostraron resultados positivos a la presencia de AFM1, mostrando todas valores por encima de lo que establece el Códex Alimentarius (0,025 μg/kg) y una media de 0,04 μg/kg. De las 15 muestras de productos deshidratados, 12 fueron leche (con grasa butírica) y 3 producto lácteo (con grasa vegetal), con una media de 0,13 μg/L y 10 de éstas tuvieron presencia de AFM1. De las 41 muestras UHT, 27 fueron leche y 14 producto lácteo, con una media de 0,30 μg/L y 26,8% de las muestras con niveles de AFM1 por encima de lo establecido por la NOM. Según los datos obtenidos de la ingesta promedio diaria de AFM1 por grupos de edad, se observó que los niños de edades comprendidas entre recién nacidos y edad escolar (0 - 11 años) fue el grupo poblacional que presentó los niveles más elevados de ingesta de AFM1, ya que en este grupo se encuentran los lactantes cuya principal dieta hasta los 6 meses es a base de leche materna o bien leches maternizadas, presentando niveles de ingesta de AFM1 (4,40 ng/kg PCP/día) por encima del límite de índice de riesgo carcinogénico (2 ng/kg PCP/día). Aunque en la población pre-escolar y escolar se modifica la frecuencia, el tipo y el consumo de leche y productos lácteos, el peso corporal todavía no es suficientemente alto para revertir los valores de ingesta promedio diaria de AFM1 presentando niveles elevados de riesgo carcinogénico (5,01 ng/kg PCP/día). Al disminuir la ingesta de leche y productos lácteos por la población adolescente, adulta y adulta mayor y al relacionar esta ingesta con el peso corporal, la ingesta promedio diaria de AFM1 (0,68 ng/kg PCP/día) se encontró por debajo del índice de riesgo carcinogénico, no representando riesgo a este respecto. / Milk and dairy products are foods with a high nutritional value but also susceptible to contamination and main vehicle entry of aflatoxin M1 (AFM1) in the diet because it is not destroyed by the conventional thermal treatments such as sterilization or pasteurization usually used in the dairy industry to sanitize these products, and thus may be present in yogurt, cheese, dried milk and other dairy products. The International Agency for Research on Cancer (IARC) of WHO has categorized the AFM1 as carcinogenic and toxic to humans in Group 1. This paper analyzed the presence of AFM1 in milk and milk-based products marketed in the metropolitan area of Monterrey, NL, Mexico, and the consumption of these products, which are susceptible to contamination by AFM1 was evaluated in the population by age group and as the index of carcinogenic risk. In the first sampling, 84 samples were analyzed by ELISA, of which 20 were pasteurized milks and 66 were UHT-treated products, including 48 milks containing butyric fat and 16 milk products containing vegetable fat. The pasteurized milks showed 100% presence of AFM1, with an average of 0.39 μg/L and 20% of the samples above the provisions of the NOM-243-SSA1-2010 (0,5 μg/L), while UHT products, all showed the presence of AFM1, with milk containing butyric fat which on average were within the NOM with 0.45 μg/L and 38% of the samples above the limit set by the NOM, while the dairy product showed an average of 0.66 μg/L and 69% of the samples above the provisions of the NOM. In the second sampling, 162 milk samples were analyzed, including raw milk (n = 51), infant formula (n = 55), milk powder (n = 15) and UHT-treated products (n = 41), collected from supermarkets and analyzed by extraction in immunoaffinity columns containing monoclonal antibodies, and quantified by HPLC with fluorescence detection. In order to determine the average daily intake of AFM1 by age group and to establish the carcinogenic risk index, ENSANUT corresponding 2012 survey was used to Nuevo León, applying the formula described by Kuiper-Goodman (1994). Among the 51 raw milk samples analyzed, 16 were positive (31%), obtaining 2 samples (4%) above the maximum limit established by the NOM and an average of 0.07 μg/kg. Among the 55 infant formulas analyzed, 11 were positive for the presence of AFM1, showing all values above that established by the Codex Alimentarius (0.025 μg/kg) and a mean of 0.04 μg/kg. Among the 15 dehydrated samples, 12 were milk (milk fat) and 3 milk products (vegetable fat), with an average of 0.13 μg/L and 10 had presence of AFM1. Among the 41 UHT samples 27 were milk and 14 dairy product, with a mean of 0,30 μg/L and 26,8% of samples above the AFM1 levels established by the NOM. According to the data of the average daily intake of AFM1 by age group, it was observed that children aged between newborn and school age (0 - 11 years) was the population group that had the highest intake levels of AFM1, since in this group of infants whose main diet is up to 6 months is breast milk or milk-based infant formula presented AFM1 intake levels of 4.40 ng/kg PCP/day over the limit carcinogenic risk index (2 ng/kg PCP/day). Although the pre-school and school population the frequency, type and consumption of milk and milk products is changed, the body weight is not yet high enough to reverse the values of average daily intake of AFM1 presenting high levels of carcinogenic risk (5.01 ng/kg PCP/day). By reducing the intake of milk and dairy products by the adolescent, adult and older adult population and to relate this intake to body weight, average daily intake of AFM1 (0.68 ng/kg PCP/day) was below the carcinogenic risk index, and representing no risk in this regard.

Los ácaros Demodex son habitantes normales de la piel de los mamíferos. Los mismos se han adaptado a vivir dentro de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas de la piel de sus huéspedes mamíferos. La demodicosis puede ser definida como una enfermedad inflamatoria cutánea caracterizada por la presencia de una sobrepoblación de ácaros Demodex. Se considera que la respuesta inmunitaria celular es la responsable del control de la población de ácaros, mientras que los roles de las respuestas inmunitarias humoral e innata, son desconocidos. En los animales domésticos, la forma más grave de la demodicosis, la padecen los perros. En consecuencia, la demodicosis canina es la enfermedad más estudiada. Se han identificado dos especies de ácaros Demodex en perros: Demodex canis y Demodex injai; mientras se ha propuesto una tercera especie denominada Demodex cornei. Muchos estudios han tratado de documentar la prevalencia de ácaros Demodex en los perros sanos mediante diferentes métodos. En la presente tesis doctoral, se describe una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real para detectar ADN de Demodex (secuencia del gen de la quitina sintetasa) en pelos de perros. Ésta técnica demostró la presencia de ácaros Demodex en porcentajes más altos que en los estudios anteriores, sugiriendo que los ácaros Demodex están presentes en todos los perros sanos independientemente de la edad, sexo, raza o pelaje. Además, la técnica demuestra que las poblaciones de Demodex están distribuidas a lo largo del cuerpo de los perro en pequeño número. Con el fin de establecer las relaciones filogenéticas entre las dos especies caninas y la propuesta tercera especie, amplificamos y secuenciamos un fragmento del ADN mitocondrial de la subunidad ribosomal 16S. El análisis filogenético demuestra que D. injai es una especie diferente de D. canis y que D. cornei es probablemente una variante morfológica de D. canis. Además, se desarrolló y estandarizó una técnica de PCR convencional para la detección específica de ADN de D. injai. Ésta técnica demostró que D. injai también es un habitante normal de la piel de algunos perros y que en la mayoría de los casos clínicos de demodicosis canina, la sobrepoblación de D. injai es infrecuente. Finalmente, con el fin de ampliar los conocimientos de la respuesta humoral en la demodicosis canina, obtuvimos un extracto antigénico crudo de D. canis y demostramos, mediante una técnica de Western-blot, la presencia de inmunoglobulinas G contra diversos antígenos de D. canis en el suero de perros sanos, de perros con demodicosis juvenil generalizada con o sin infección cutánea secundaria. En conclusión, ésta tesis doctoral demuestra que los ácaros Demodex son habitantes normales de la piel canina y que se distribuyen en pequeño número a lo largo del pelaje canino. Además, los ácaros D. canis deben ser considerados una especie diferente a ácaros D. injai y, los ácaros D. cornei, una variante morfológica del mismo. Por otro lado, los perros sanos y los perros con demodicosis juvenil generalizada presentan una respuesta humoral adquirida y anticuerpos dirigidos contra diversos antígenos proteicos de D. canis. / It is considered that Demodex mites are normal inhabitants of the mammalian skin. They have been adapted to live inside skin hair follicles and sebaceous glands of mammalian hosts. Demodicosis can be defined as an inflammatory skin disease characterized by the presence of Demodex mite overpopulation. It is considered that the cellular immune response is responsible for the control of mite population, while the role of the humoral and innate immune responses remains unknown. In domestic animals, the most severe form of demodicosis occurs in dogs. Consequently, canine demodicosis is the most studied disease produced by Demodex mites. Two canine Demodex species have been identified: Demodex canis, and Demodex injai, while a third species unofficially named Demodex cornei, has been proposed. Many studies have tried to report Demodex prevalence in healthy dogs by different methods. In the present doctoral thesis, we described a real-time PCR technique to detect Demodex DNA (sequence of chitin synthase gene) in canine hair samples. This technique demonstrated the presence of Demodex mites in higher percentages than previous reports, suggesting that Demodex mites are present in all healthy dogs independent of age, sex, breed, or coat. Furthermore, Demodex populations were distributed in small numbers along the dog’s body. In order to analyze the phylogenetic relationships between the two canine Demodex species and the proposed third species, we amplified and sequenced a fragment of the mitochondrial 16S rDNA gene. Phylogenetic analysis revealed that D. injai is a different species from D. canis. In addition, it demonstrated that D. cornei is probably a morphological variant of D. canis. A conventional PCR for the specific detection of D. injai DNA was also developed and standardized. This technique demonstrated that D. injai is also a normal inhabitant of some dogs. Moreover, it suggested that in the majority of clinical canine demodicosis cases, an overgrowth of D. injai is unlikely. Finally, to enlighten the field of the humoral response in canine demodicosis, a D. canis crude extract antigen was obtained and we demonstrated the presence of immunoglobulins G against several D. canis antigens in the sera of healthy dogs and in the sera of dogs with juvenile generalized demodicosis with and without secondary complicating pyoderma by western blot technique. In conclusion, this doctoral thesis demonstrated that Demodex mites are normal inhabitant of the canine skin, they are present in the majority of dogs, and are distributed in very low numbers along all the haired skin. Furthermore, Demodex injai must be considered a different species from D. canis, and D. cornei is a probable morphological variant of D. canis. Healthy dogs and dogs with canine juvenile generalized demodicosis have an acquired humoral immune response against Demodex mites and present serum antibodies directed against several Demodex canis protein antigens.

La esterificación química de ácidos grasos (AG) libres y glicerol, co-productos de la refinación y de la industria del biodiesel respectivamente, genera nuevas grasas con diferentes características físico-químicas y nutricionales. La introducción de estos co-productos en dietas comerciales para perros contribuye a reducir la cantidad de residuos y a conseguir un sistema de producción de alimentos para animales de compañía más sostenible. Por todo ello, el objetivo de esta Tesis es evaluar el uso de diferentes aceites ácidos esterificados (AAE) para dietas caninas. En primer lugar, la presente tesis doctoral explora el efecto de la inclusión en dietas para perros adultos de AAE de palma con diferente contenido en mono- (MG) y diglicéridos (DG), en comparación con un aceite convencional de palma, sobre las preferencias alimentarias, la digestibilidad y los niveles de lípidos plasmáticos, tanto postprandiales como en ayuno. La hipótesis de este capítulo se centra en que la esterificación de aceites ácidos de palma incrementará la digestibilidad de ciertos AG, como la de los AG saturados (AGS), debido a un incremento de los AGS localizados en la posición sn-2 de la molécula de glicerol y a un incremento en el contenido de MG y DG, que poseen propiedades emulsificantes de la grasa. Nuestros resultados indicaron que los perros tienen una preferencia por las dietas con AAE de palma en su composición en comparación con las que incorporaban aceite convencional de palma. Además, la inclusión de AAE de palma no produjo ninguna diferencia ni en la digestibilidad de la grasa ni en la lipemia, tanto postprandial como en ayuno, en comparación con el aceite de palma convencional. No observamos ninguno de los beneficios hipotetizados con la inclusión de aceites de palma esterificados, que se podrían haber visto neutralizados por los efectos negativos de los AAE sobre su digestión y absorción relacionados con su punto de fusión. Por otro lado, la presenta memoria investiga el uso de AAE, obtenidos a partir de aceite de coco, con alto contenido en ácidos grasos de cadena media (AGCM) en comparación con AG de cadena más larga, obtenidos a partir de aceite de colza y soja. Para ello, se determinó el efecto sobre las preferencias alimentarias, la digestibilidad de la dieta y el control de peso en perros adultos con sobrepeso. Diferentes estudios han confirmado el potencial de los AGCM para reducir la grasa corporal (GC) en humanos y roedores. Sin embargo, no se han publicado estudios que estudien este efecto en perros. Nuestros resultados indicaron que la incorporación de AG de aceite de coco no tiene ningún efecto negativo ni en la palatabilidad ni en la digestibilidad de la materia orgánica y la energía en comparación con AG insaturados de cadena más larga. Además, nuestros resultados también muestran una mayor digestibilidad total de la grasa en los animales alimentados con AGCM, debido a una mejor digestibilidad de los AGCM respecto a AGS de cadena más larga. Por otro lado, la incorporación de AGCM del aceite de coco disminuye el porcentaje de peso perdido y aumenta la GC después de un tratamiento de pérdida de peso en comparación con AG insaturados de cadena más larga, aportados por aceites de colza y soja. Sin embargo, las dietas experimentales no sólo difieren en longitud de cadena sino que también lo hacen en grado de saturación, por lo cual es necesario más investigaciones enfocadas a diferenciar estos efectos. / Chemical esterification of free fatty acids (FA) and glycerol, by-products of the refinery and the bio-diesel industries respectively, generates new technological fats with different physico-chemical and nutritional characteristics. Moreover, re-introducing these by-products in commercial canine diets minimizes the amount of residues and contributes to sustainable food manufacturing systems. Thus, this thesis aims to evaluate the use of different esterified acid oils (EAO) for canine diets. On the one hand, this thesis aims to explore the effect of palm EAO with different mono- (MAG) and diacylglycerides (DAG) content on food preferences, digestibility, and post-prandial and fasting plasma lipids compared to palm native oil in adult dogs. It is hypothesized that esterification of palm acid oil improves the digestibility of certain FA, such as saturated FA (SFA), due to a predicted increase of SFA at the sn-2 position within the glycerol molecule and also due to their increased MAG and DAG content, which have fat emulsifying properties. Our results indicate that dogs preferred diets with palm EAO in their composition compared to those with palm native oil. Additionally, the inclusion of palm EAO in a canine basal diet did not result in any differences on lipid digestibility, and fasting and post-prandial lipaemia compared to palm native oil. We did not observe any of the hypothesized expected benefits of the inclusion of palm EAO, which might have been counteracted by negative effects of EAO associated to their melting point on digestion and absorption. On the other hand, this dissertation also aims to investigate the use of EAO with different medium chain fatty acid (MCFA) content from coconut oil on food preferences, digestibility, and weight management compared to longer chain FA from canola and soybean oils in overweight adult dogs. Several studies have confirmed the potential of MCFA to reduce fat mass (FM) in humans and rodents. However, to our knowledge, there are no published studies in dogs assessing this effect. Our results indicate that the incorporation of FA from coconut oil does not have a negative effect neither on palatability nor on organic matter and energy digestibility compared to unsaturated long chain FA. Moreover, our results also show an improvement in overall fat digestibility in dogs fed diets with MCFA, explained by the better digestibility of saturated MCFA versus longer chain SFA. On the other hand, incorporation of MCFA from coconut oil decreases the percentage of body weight lost and increases body FM after weight loss in comparison to longer unsaturated FA from canola and soybean oils. However, since the experimental diets differed not only in chain length but also in chain saturation, further research is needed to clearly differentiate these effects.

El cáncer es una de las principales causas de muerte en la población humana del mundo desarrollado. Los avances en las terapias convencionales, cirugía, quimioterapia, radioterapia, detección y diagnóstico del cáncer han permitido una mejora en los niveles de supervivencia y calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, restan multitud de tipos de enfermedades oncológicas donde poco o nada se puede hacer por combatirlas. La viroterapia con adenovirus emerge como una aproximación esperanzadora para el tratamiento del cáncer. Esta terapia permite minimizar la dosis inicial administrada gracias a la replicación viral en el tumor, amplificando exponencialmente los niveles de virus. Además, los avances en el conocimiento biológico del adenovirus y de las técnicas moleculares, permiten conferir selectividad y potencia oncolítica a los adenovirus. Por otra parte, el gran número de vías implicadas en la replicación viral impide la aparición de las clásicas resistencias a los agentes quimioterapéuticos. De todas formas, al alcanzar los ensayos preclínicos in vivo y sobretodo las fases clínicas en pacientes humanos, se hacen patentes nuevas limitaciones relacionadas con esta terapia. Una de estas limitaciones es la falta de potencia oncolítica. Esta falta se debe, en parte, al ciclo viral del adenovirus salvaje, el cual está optimizado para maximizar su producción, limitando la liberación viral al medio inicialmente y disminuyendo la respuesta inmune antiviral. En los tumores existe, sin embargo, un estado de inmunidad deprimida. Además, el aumento y aceleración de la liberación adenoviral se correlaciona con mayor actividad antitumoral. En el primer capítulo de este trabajo hemos combinado los adenovirus con virus adeno-asociados ya que previamente se ha descrito un aumento de la apoptosis y necrosis celular al darse coinfecciones de ambos virus. Esta combinación ha resultado en un aumento de la liberación adenoviral al medio, aumentando la propagación y la citotoxicidad in vitro de los adenovirus y la actividad antitumoral in vivo tras la administración intratumoral de ambos virus. Otra limitación de la viroterapia adenoviral es la falta de modelos adecuados que reflejen fielmente la realidad que los adenovirus oncolíticos se encuentran en pacientes humanos. Los modelos murinos son ampliamente utilizados para los ensayos de toxicidad y eficacia. Sin embargo, son poco o nada permisivos a la replicación viral, disponen de sistemas inmunes comprometidos para permitir la implantación artificial de tumores humanos, que evolucionaran de forma muy diferente a los tumores espontáneos de los pacientes. Esto provoca bajas correlaciones de los índices terapéuticos y, a veces, de los efectos adversos, entre modelos y pacientes. En el segundo capítulo de este trabajo hemos generado y caracterizado preclínicamente un adenovirus canino oncolítico, ICOCAV17, para su uso como agente terapéutico en la clínica veterinaria y como modelo para la viroterapia en clínica humana. Su replicación esta ligada a la vía del Retinoblastoma, incorpora el gen de la hialuronidasa para aumentar su diseminación intratumoral y hemos insertado el motivo RGD en su cápside para aumentar la infectividad de células tumorales. Además, cinco pacientes caninos con diferentes tipos de tumores han sido tratados intratumoralmente. Los resultados obtenidos indican que ICOCAV17 parece seguro administrado por vía intratumoral y su actividad antitumoral ha sido comprobada en tres pacientes observando necrosis y reducciones tumorales. / Cancer remains as a main cause of death in the developed world. The improvements made in conventional therapies as chemotherapy, surgery, radiotherapy, detection, and diagnosis of cancer have led to increased survival indexes and higher patient quality of live. However, some tumor types have not effective treatments yet. Virotherapy with adenoviruses is as a promising therapy for cancer treatment as it allows minimizing the initial administered dose due to the amplification of the virus within the tumor. This amplification increases the amount of virus present in the tumor. Moreover, the knowledge about adenoviruses and new molecular technics allows us to confer the virus tumor selectivity and oncolytic potency. Further, due to the multiple pathways that are involved in the virus cycle, the development of tolerance is quite difficult, as it happens for the well-known chemotherapeutic agents. Nevertheless, when viruses reach preclinical in vivo assays or clinical phases in human patients, new limitations related with this therapy appear. Low oncolytic potency is an example of these limitations. Life cycle of wild type adenovirus is one of the reasons of this low potency as it is optimized to maximize the total production what needs of low levels of released virus at early times decreasing the immune response against virus. However, immune response in tumor environment is inhibited. Moreover, enhanced adenovirus release correlates with increased antitumor activity. In the first part of this work we have combined adenovirus with adeno-asociated virus as enhanced apoptosis and cell death is described when combination of both viruses is performed. This combination resulted in enhanced adenovirus release, increasing adenovirus propagation and cytotoxicity in vitro, and antitumor activity in vivo when both virus were injected intratumoraly. Another problem of virotherapy with adenovirus is the lack of good predictive models. Murine models are widely used for toxicity and efficacy assays. However, these models are poor permissive to adenovirus replication, they have compromised immune system to allow artificial implanted human tumors to grow subcutaneously, and these tumors show different clinical evolution compared to spontaneous tumors within patients. All these factors led to poor correlated therapeutic indexes when adenoviruses reach clinical phases and less frequently to unexpected adverse events. In the second part of this work we have generated and characterized in preclinical assays a canine oncolytic adenovirus named ICOCAV17. This virus was conceived as a therapeutic veterinary agent and a model to human virotherapy. ICOCAV17 is a retinoblastoma pathway controlled virus, expressing a hialuronidase to enhance virus spread through the tumor, and has an RGD motif in the fiber to increase tumor cell infectivity. Moreover, five canine patients with different tumor types have been treated intratumoraly. Results suggest a good safety profile injecting the virus intratumoraly and efficacy has been observed in three patients.