Desde su aparición en 1987, el Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) ha provocado un enorme impacto en la producción porcina mundial. Estudios recientes estiman que sólo en Estados Unidos las pérdidas por costes directos ascienden a 560 millones de dólares anuales. Los resultados obtenidos con las vacunas que se comercializan arrojan ciertas dudas sobre su eficacia. Una de las razones por la que no se han podido desarrollar vacunas más eficientes es la falta de un conocimiento profundo de la respuesta inmune (RI) que ocurre tras la infección.El agente etiológico de esta enfermedad es conocido como virus del PRRS (PRRSV) o arterivirus porcino. Se han descrito dos genotipos, el americano y el europeo. Existe, además, una elevada variabilidad genética dentro de cada genotipo. Hasta la fecha, la mayoría de estudios sobre la RI tras la infección o tras la vacunación con este virus han sido realizados usando cepas americanas. El objetivo de esta tesis doctoral es caracterizar la RI del cerdo frente a cepas del PRRSV del genotipo europeo; primero, durante la infección de lechones con una cepa de campo español y, segundo tras la vacunación con cepas atenuadas (vacunas comerciales), evaluando su eficacia frente a un desafío homólogo o heterólogo. Primer estudio: Los hallazgos más significativos de la RI de los cerdos infectados experimentalmente con una cepa española son: ausencia de producción de IL-2 e IL-4, aparición temprana de anticuerpos no neutralizantes, respuesta neutralizante inconstante y tardía y un desarrollo lento e irregular de CP-IFN-gamma específicas de PRRSV que, sin embargo, podría estar relacionado con el fin de la viremia. Una de las hipótesis que planteamos para explicar la anómala respuesta celular observada es la producción de IL-10 y de haptoglobina en las primeras fases de la infección. Planteamos también la hipótesis que quizás la RI desempeña un papel secundario en la resolución de la infección, tal y como ya se ha demostrado con otros arterivirus como el virus elevador de la lactato-deshidrogenasa del ratón.Segundo estudio: Los cerdos vacunados presentan periodos de viremia muy largos (42 días). Las largas viremias descritas con ambas vacunas denotan una situación indeseable dónde se posibilita la excreción del virus y por tanto la transmisión y la hipotética reversión a virulencia. Sorprendentemente, tras el desafío, se detectó el virus en sangre sólo en los animales vacunados con la cepa homóloga (V1) (4/5). La respuesta humoral neutralizante no aparece antes de los 2 meses post-vacunación y por tanto este parámetro no puede relacionarse con la protección otorgada por las vacunas. Nuestros resultados sugieren que son las CP-IFN-gamma el parámetro inmune que debería considerarse como marcador de protección. Independientemente de la vacuna que les administra, los animales que alcanzan una magnitud mínima de CP-IFN-gamma en el momento del desafío quedan protegidos. De hecho, la vacuna que aporta un mayor grado de protección es la vacuna heteróloga (V3), ya que induce los mayores niveles de CP-IFN-gamma. La falta de protección homóloga (V1) podría explicarse por la capacidad intrínseca de esta cepa de inducir IL-10 incluso en las células de los animales control. Todo ello sugiere que la protección conferida por una vacuna contra el PRRSV no depende sólo de la homología entre el virus vacunal y la cepa del desafío, sino que también debe considerarse el tiempo transcurrido tras la vacunación y las propiedades inmunológicas inherentes de cada cepa.En definitiva, nuestros estudios demuestran que la RI de los lechones tras la infección con una cepa virulenta del PRRSV es prácticamente igual a la que se desarrolla tras la vacunación con cepas atenuadas, ya sean éstas del genotipo europeo o del americano. Además, nuestro segundo estudio demuestra que las CP-IFN-gamma específicas de PRRSV desempeñan un papel importante en la protección frente a la infección. / Since it was described in 1987, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) has become one of the most important diseases in the swine worldwide. A recent study estimates that the economic losses caused by PRRS in the US amount to more than US$ 560 millions annually.Regarding the commercialized vaccines, as of today, there is no convincing evidence indicating that they confer an acceptable and universal protection against the infection. One of the reasons for the lack of development of newer and more efficacious vaccines is the scarce knowledge on the immune response (IR) of pigs after infection by field strains.The etiologic agent for this disease is known as PRRS virus (PRRSV) or Porcine Arterivirus. Two genotypes are recognized (American and European). In addition, genetic diversity of strains within a given genotype is high. To date, the majority of the studies regarding the IR of pigs after the PRRSV infection or vaccination have been done using the American strains. The aim of this thesis is to characterize the IR against the European genotype. Firstly, during the infection of piglets with a wild-type Spanish strain and secondly after the vaccination with two attenuated virus (commercialized vaccines), evaluating their efficacy after a challenge with a homologous or a heterologous strain.First study: The most significant results in the IR of the piglets experimental infected with a Spanish strain are: lack of IL-2 and IL-4 production, early production of non-neutralizing antibodies, inconstant and late humoral neutralizing response and slow and irregular development of PRRSV-specific IFN-gamma-secreting cells (IFN-gamma-SC) measured by ELISPOT. Nevertheless, this last parameter would be associated with the disappearance of the virus from the blood. The IL-10 and haptoglobin production in the first phases of the infection could explain the anomalous cell response observed. We postulate that the IR maybe plays a secondary role in the resolution of the infection, as it has already been demonstrated with other Arterivirus as lactate dehydrogenase-elevating virus of the mice.Second study: After vaccination, some pigs remain viremic as late as 42 days post-vaccination. This extended period of viremia could significantly contribute to the spread of vaccine virus and, potentially, this phenomenon could facilitate the reversion to virulence. Surprisingly, after the challenge, only pigs vaccinated with the homologous strain (V1) become viremic (4/5). Vaccinated pigs do not develop neutralizing antibodies before the challenge. Therefore, this parameter cannot be related to the protection conferred by the vaccines. Our results suggest that IFN-gamma-SC play an important role in protection against the PRRSV infection in piglets. Regardless of the vaccine used, the pigs are protected if IFN-gamma-SC reach a minimum frequency at time of the infection. In fact, heterologous vaccine (V3) confers the best protection because it induces the highest IFN-gamma-SC frequency. The lowest protection conferred by the homologous vaccine (V1) could be explained by its intrinsic ability to induce a high IL-10 production even in naïve cells. Our results suggest that the protection afforded by a vaccine against PRRSV cannot be forecasted only by a global view of the genetic similarity between the strains but, maybe, can be forecasted by the time passed after the vaccination and the inherent immune properties of each strain.In summary, our studies show that the IR of the piglets after the infection with a wild-type strain is similar to the IR developed after the immunization with attenuated strains, both in European and American genotypes, in spite of the genetic diversity. The second study proves that the frequency of PRRSV-specific IFN-gamma-SC plays a significant role in the protection of vaccinated pigs against a PRRSV infection.

El objetivo general de este trabajo fue estudiar la calidad de espermatozoides procedentes de epidídimo de caballo refrigerado (4ºC) durante varios días (hasta 96 horas) antes y después de la crioconservación. En la primera experiencia se estudió el efecto del tiempo de conservación del epidídimo, refrigerado a 4ºC hasta 96 horas, sobre la cantidad y calidad de los espermatozoides antes y después de la congelación. Para ello analizamos el volumen, la concentración, la viabilidad y la condensación de la cromatina en espermatozoides procedentes de epidídimo conservados a 4ºC durante 0, 24, 48, 72 y 96 horas. Además, se analizó la viabilidad y condensación de la cromatina de los espermatozoides a los 30 minutos de haber sido diluidos en el medio de congelación. Por último, de los espermatozoides congelados-descongeladas se evaluó: la viabilidad, la condensación de la cromatina, la integridad acrosomal, los ROS, la fosforilación de tirosina bajo condiciones capacitantes y la formación de pronúcleos tras la fecundación in vitro (FIV) y tras la inyección intracitoplasmática (ICSI) en un sistema heterólogo con ovocitos bovinos. Los resultados mostraron que el volumen medio (720±159 µl) y la concentración espermática (6’5±0’4 x 109 espermatozoides/ml) no se vieron modificadas a lo largo del tiempo. La viabilidad espermática no mostró descenso hasta transcurrido 72 h. En relación a la condensación de la cromatina no hubo diferencias entre los grupos experimentales. Al diluir los espermatozoides en el medio de congelación observamos un descenso en la viabilidad a partir de las 48 horas, una hipercondensación de cromatina en todos los grupos. Por último, al analizar los espermatozoides descongelados, observamos que la viabilidad, condensación de la cromatina, integridad acrosomal, la viabilidad y la generación de ROS tampoco se vio afectada por el tiempo de conservación. Además, se estudio la fosforilación de tirosina de proteínas de los espermatozoides descongelados tras ser incubados en un medio capacitante y en todos los tiempos de conservación estudiados se produjo fosforilación de tirosina pero no hubo diferencias entre ellos. En cuanto a la capacidad fecundante observamos que los espermatozoides procedentes de todos los grupos experimentales eran capaces de activar a los ovocitos y formar pronúcleos (masculino y femenino). La segunda experiencia se planteó para realizar un estudio sobre la incubación de los espermatozoides de epidídimo durante 30 minutos en plasma seminal como fase previa a la criopreservación. Los resultados obtenidos en cuanto a viabilidad posdescongelación fueron muy variables ya que ésta se incrementaba o disminuía dependiendo del macho del que procedía el plasma seminal. En cuanto a los parámetros condensación de la cromatina, integridad del acrosmal y generación de ROS, no se vieron afectados ni por la incubación con el plasma seminal ni por el animal del que procedía dicho plasma. En la tercera experiencia analizamos la composición del plasma seminal de los tres machos utilizados: los niveles de antioxidantes, concentración lipídica y concentración proteica. Los resultados mostraron que el plasma que mejoraba la viabilidad espermática tras la descongelación era el que presentaba mayor concentración de antioxidantes, mayor cantidad de ácidos grasos polinsaturados y mayor cantidad de proteína. Además se analizó la composición proteica del plasma seminal, mediante la técnica de 2D-DIGE, de los tres machos. Fueron identificados 34 spots en total y se identificaron aquellas proteínas que diferían entre ellos (dependiendo de su punto isoeléctrico y peso molecular). Se observó una gran variabilidad entre los tres animales. Podemos concluir que se mantiene la calidad de los espermatozoides procedentes de epidídimo conservados a 4ºC hasta 96 horas tras la descongelación y, dependiendo del animal, la incubación de los espermatozoides en el plasma seminal puede ser beneficioso durante el proceso de la crioconservación. / The main goal of this work was to study the effect of sperm storage, at 4ºC up to 96 h, in the epididymides obtained from castrated horses and its effect on different functional sperm parameters. Our first experiment were designed to study the effect of (1) sperm storage on viability and chromatin condensation; (2) pre-incubation of recovered epididymal sperm in the freezing extender, prior cryopreservation, on viability and chromatin condensation; (3) freezing–thawing on viability, chromatin condensation, ROS generation, protein tyrosine phosphorylation and heterologous fertilization rate (ICSI and IVF using bovine oocytes) of sperm recovered from the epididymis up to 96 h post castration. The average volume (720±159 µl and the concentration (6’5±0’4× 109 spermatozoa/ml) of sperm recovered from the epididymis were not affected by storage. Sperm viability after refrigeration at 4ºC for up to 72 h was similar. The effect of sperm dilution in the freezing media showed similar values up to 48 h, while viability was preserved up to 72 h. Cryopreserved spermatozoa show similar viability between different storage times. Chromatin condensation was not affected by storage time; however, incubation for 30 min in freezing medium and freezing–thawing process induced an increase in the chromatin condensation. ROS generation was not affected by storage up to 96 h. Epididymal storage did not affect sperm protein tyrosine phosphorylation patterns; although the pattern of phosphorylation changed to strong staining of the equatorial segment when the sperm where capacitated in sperm–TALP. Finally, successful and similar pronuclear formation (analyzed by ICSI) and in vitro penetration (evaluated with bovine zone free oocyte) was observed using cryopreserved sperm obtained from prolong epididymal storage at 4ºC. In conclusion, cryopreservation of epididymal stallion sperm stored for up to 72 h in the epididymis at 4ºC, maintain both viability and ability to fertilize in vitro. In the second experiment we studied the effect of sperm incubation with seminal plasma before cryopreservation on sperm viability, chromatin condensation, acrosomal integrity and ROS. Results showed that these parameters were not affected by sperm incubation with seminal plasma. However, we observed that viability was affected by male because it increased or decreased depending on plasma donor. The parameters chromatin condensation, acrosomal integrity and ROS generation, were not affected by either seminal plasma or by the animal. The third experiment was designed to evaluate seminal plasma composition, particularly antioxidant level, lipid and protein concentration. The seminal plasma which had the largest quantity antioxidant level, lipid and protein was the one which improved sperm viability after thawing. The seminal plasma composition was different depending on the animal. In addition, using the technique of 2D-DIGE, protein composition from the seminal plasma was analyzed. We identified which proteins were different between them (depending on their isoelectric point and their molecular weight). A total of 34 spot were identified and were different between animal. In conclusion, equine spermatozoa stored in the epididymis for up to 96 h at 4ºC can be successfully cryopreserved and maintain their fertilization capacity after thawing. Also, sperm incubation in seminal plasma would improve sperm quality depending on animal.

Tesis por compendio de publicaciones / BJETIVOS 1. Evaluar de forma detallada la morfología del intestino delgado en el perro y su relación con las condiciones de seguridad necesarias para la aplicación de la EDB (artículo 1). 2. Contribuir a la caracterización de la histología normal del intestino del perro mediante la cuantificación sistemática del grosor de sus túnicas (artículo 2). 3. Evaluar la eficacia y seguridad de la técnica de EDB en el perro tanto vía oral (artículo 3) como vía anal (artículo 4). METODOLOGÍA El diseño de la tesis se fundamenta en 2 fases experimentales, la primera en cadáveres de perro, y la segunda in vivo. Un total de 55 cadáveres de perro fueron empleados para el estudio anatómico/morfométrico del intestino delgado (objetivo 1, artículo 1). De esos 55 animales, 41 también fueron utilizados para el estudio histológico/morfométrico del intestino delgado (objetivo 2, artículo 2). Para la fase experimental in vivo, se emplearon un total de 21 perros sin historial de enfermedad digestiva. Las exploraciones enteroscópicas se realizaron con un enteroscopio terapéutico de doble balón (EN-450T5, Fujinón®) tanto por vía oral (objetivo 3, artículo 3), como anal (objetivo 4, artículo 4). Los dos balones del equipo son inflados y desinflados alternativamente para permitir el progreso del endoscopio (maniobra de empuje) o plegamiento del intestino detrás de los balones (maniobra de rectificación). CONCLUSIONES 1. El estudio anatómico del intestino delgado ha permitido validar la especie canina como adecuada para la EDB siempre que se respeten las posibles limitaciones impuestas por el diámetro del lumen intestinal en animales de pequeño tamaño. La longitud del antebrazo fue el parámetro corporal con mayor asociación con el diámetro del intestino, y por ende el mejor estimador del tamaño mínimo requerido para la EDB en el perro. 2. Los resultados obtenidos sobre el rango de grosor normal de las diferentes túnicas a lo largo de todo el intestino delgado del perro constituyen la primera referencia publicada de estas características, con lo que ello puede suponer para el diagnóstico de patologías del intestino delgado a partir de de biopsias endoscópicas, ultrasonidos, muestras obtenidas por laparoscopia o postmortem. El sexo debe ser tenido en cuenta como fuente de variación del grosor de las túnicas intestinales. 3. Se ha demostrado que la EDB tanto por vía oral como anal es factible y segura en la especie canina. Los resultados aportados sobre la dinámica de exploración son importantes pues aportan valores de referencia para el empleo futuro de la EDB con fines diagnósticos o de tratamiento de enfermedades en porciones profundas del intestino delgado. 4. La exploración completa del intestino delgado del perro mediante EDB no ha sido posible ni por vía oral ni anal. Sin embargo, dado el interés que ello puede tener en el diagnóstico de algunas enfermedades del intestino delgado, serían necesarios nuevos estudios en los que se plantee la combinación de ambas vías. / OBJETIVES 1. To study in detail the morphology of the small intestine in the dog so as to evaluate whether it accomplishes the security conditions required for the double balloon enteroscopy. 2. To contribute to characterize the normal histology of the dog´s small intestine by quantifying the thickness of its layers. 3. To characterize the efficiency and safety of the double balloon enteroscopy in the dog by both the oral and anal approaches. METHODS This work was carried out in two experimental phases. The first one in cadavers and the second in vivo. 55 dog cadavers were used for anatomical (morphometric) study (objective 1, article 1), while 41 of them were used for histological (morphometric) study of the small intestine (objective 2, article 2). For the in vivo experimental phase (DBE), 21 dogs without history of digestive diseases were used. DBE were carried out with a therapeutic enteroscope (EN-450T5, Fujinon®) either by the oral (objective 3, article 3) and the anal approaches (objective 4, article 4). Two balloons are inflated and deflated in an alternating sequence to allow the endoscope to progress (pushing phase) or fold the explored intestine behind the balloons (pulling phase). CONCLUSIONS 1. Validation of the dog as a candidate for DBE has been obtained after a thorough anatomical study of the small intestine. However, when planning DBE caution should be taken in small dogs due to potential limitations imposed by the width of the intestine. The length of the forearm showed the highest association with the diameter of the intestine so that it is the best body parameter to define the minimum body size necessary for a secure DBE in the dog. 2. The results for the thicknesses of the different layers of the small intestine given in this study are a novelty and might serve to assist the diagnosis of enteropathies by endoscopic biopsies, ultrasounds, laparoscopy and postmortem sampling. The sex should be considered as a major source of variation in intestinal thickness in the dog. 3. It has been demonstrated that both the oral and anal DBE is feasible and safe in the dog. The results for the exploration dynamics of the procedure might serve as reference values for future diagnosis and treatment of diseases in deep portions of the small intestine. 4. The complete exploration of the small intestine by DBE has not been achieved yet in the dog. Further studies with a combination of the oral and anal approaches might facilitate this goal, which could be useful for a accurate diagnosis of some enteropathies.

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Amb la fi de comprendre la dinàmica de la infecció pel VIA en aquestes tres espècies aviàries no convencionals, així com la funció epidemiològica que exercirien en un brot interespècie d’IA per tal de definir millors estratègies de vigilància, es van realitzar tres infeccions experimentals, les quals s’han descrit en aquesta tesi. La patogènia de la infecció tant pel VIAAP com pel VIABP es va determinar per a la perdiu roja (Estudi I), la guatlla europea (Estudi II) i el falcó híbrid sacre‐grifó (Estudi III), posant especial èmfasi en la descripció de la malaltia clínica, les lesions macroscòpiques i microscòpiques, i la presència de l’antigen víric als teixits. A més, en aquest treball s’ha descrit el patró d’excreció vírica de cada espècie aviària i cada VIA, i s’ha avaluat la probabilitat d’una eficaç transmissió vírica entre animals. L’Estudi II també representa un estudi comparatiu de la dinàmica d’infecció en dos subtipus diferents de VIABP (H7 i H5). En el cas dels Estudis I i II, es va prestar especial atenció en les plomes com a possible origen de propagació del VIA. A més, a l’Estudi II es va investigar l’aigua com a possible ruta de transmissió. Finalment, a l’Estudi III es va reproduir amb eficiència la infecció natural pel VIA en falcons (és a dir, mitjançant la ingestió de preses infectades) i es va dilucidar per primera vegada en aquesta espècie el patró dels receptors del virus de la grip. A l’Estudi I, les perdius roges infectades pel VIAAP van presentar els primers signes clínics a 3 dies post‐inoculació (dpi); a partir de 4 dpi van començar a morir i a 8 dpi ja no restava cap espècimen viu. Per mitjà d’immunohistoquímica (IHQ) i de PCR quantitativa a temps real (PCRq‐TR), es va confirmar la presència de l’antigen víric en teixits i l’excreció del virus, respectivament, tant en perdius inoculades amb el VIAAP com contactes. No es van observar ni signes clínics ni troballes histopatològiques a les perdius infectades pel VIABP. A més, a algunes perdius inoculades amb el VIABP, només es va detectar l’excreció del virus a curt termini, juntament amb seroconversió. L’Estudi I va posar de manifest que la perdiu roja presenta una elevada susceptibilitat a la soca del VIAAP H7N1 que es va utilitzar, la qual va causar greu malaltia clínica, alta mortalitat i excreció vírica abundant. Per consegüent, aquesta au podria contribuir a la propagació d’un possible brot local del virus. En canvi, els resultats que es van observar pel VIABP H7N9 indicarien que la perdiu roja no és un reservori d’aquest virus. A l’Estudi II, es van observar greus signes neurològics i una taxa de mortalitat del 67 % (H7N1/AP) i del 92 % (H5N1/AP) a les guatlles europees infectades pel VIAAP. Tot i que van aparèixer troballes histopatològiques en ambdós grups infectats pel VIAAP, les guatlles infectades amb VIAAP H5N1 van mostrar una distribució d’antigen víric més àmplia i lesions microscòpiques més intenses. No es va observar afectació clínica o patològica a les guatlles infectades pel VIABP. Pels tres VIA investigats es va demostrar una excreció vírica consistent i de llarg termini i una transmissió efectiva a les guatlles susceptibles. L’aigua va sorgir com a possible ruta de transmissió, i les plomes com a possible font de propagació de VIAAP. L’Estudi II posa en relleu que la guatlla europea pot tenir una funció important en l’epidemiologia de la IA, la qual cosa fa ressaltar la necessitat de conèixer amb més profunditat la seva possible funció com a hoste intermediari en el cas dels virus recombinants d’aus/mamífers. A l’Estudi III, els falcons van mostrar una dinàmica d’infecció similar tot i les diferents rutes d’exposició (és a dir, ruta nasocoanal o a partir de la ingestió de preses infectades), fet que va demostrar l’efectivitat de la ruta d’alimentació in vivo. Els falcons infectats pel VIAAP H5N1 mostraven greus signes neurològics aguts i van morir, o van ser sacrificats, entre 5 i 7 dpi. Mitjançant IHQ i RRT‐PCR es va confirmar la presència de l’antigen víric a diferents teixits. Aquest antigen s’associava normalment a lesions microscòpiques, sobretot a l’encèfal. No es van observar ni signes clínics ni lesions histopatològiques a cap dels falcons infectats pel VIABP H7N2, encara que tots els espècimens havien seroconvertit a 11 dpi. Es va detectar forta presència de receptors aviaris al tracte respiratori superior dels falcons, en concordança amb l’excreció vírica detectada per RRT‐PCR tant als falcons infectats per VIABP com per VIABP. L’Estudi III mostra que falcó híbrid sacre‐grifó presenta elevada susceptibilitat a la infecció pel VIAAP H5N1, tal com s’havia observat prèviament, i que podria jugar un paper rellevant en la propagació tant de VIAAP com de VIABP. Per primera vegada en el cas dels rapinyaries, es va reproduir amb èxit la infecció natural a partir de la ingestió de preses infectades. L’ús d’aus de presa a la falconeria i a centres de recuperació de fauna podria posar en risc rapinyaires de gran valor i humans i, per tant, seria convenient realitzar un seguiment intensiu d’aquesta pràctica. La present tesi posa en relleu la importància d’estudiar la susceptibilitat, la dinàmica d’infecció i la probabilitat de transmissió del VIA en hostes aviaris de la interfície domèstic‐salvatge. Adquirir aquest coneixement és vital per realitzar tasques de vigilància eficaces, desenvolupar mesures preventives adequades i gestionar amb èxit els brots d’IA quan es veuen afectades diferents espècies aviàries. / Avian influenza (AI) has become one of the most important challenges that ever emerged from animal reservoirs. The constant outbreaks detected worldwide in domestic and wild bird species are of concern to the economics of the poultry industry, wildlife conservation, and animal and public health. Susceptibility to AI viruses (AIVs) varies deeply among avian species, as well as their possible role as sentinels, intermediate hosts or reservoirs. To date, several experimental studies and natural infections have assessed the susceptibility of numerous major and minor avian species to diverse highly (HPAIV) and low (LPAIV) pathogenic AIVs. Gallinaceous poultry are considered to be highly susceptible, whereas waterfowl have long been recognized as natural reservoirs. However, scarce information concerning the infection dynamics of AIV in the red‐legged partridge (Alectoris rufa), European quail (Coturnix c. coturnix), and gyr‐saker hybrid falcon (Falco rusticolus x F. cherrug) exist so far. Such non‐conventional avian species may be of great interest in particular geographical regions, including the Iberian Peninsula. These species not only belong to the autochthonous wildlife, but they are also raised (normally within extensive farming systems) for various human benefits, which leads to close contact with both humans and local wildlife. With the aim to understand the dynamics of AIV infection in these three non‐conventional avian species, and their epidemiological role in an interspecies AI outbreak to better define surveillance strategies, three experimental infections were undertaken which have been presented in this dissertation. The pathogenesis of the infection with both LPAIV and HPAIV was determined in the red‐legged partridge (Study I), European quail (Study II), and gyr‐saker hybrid falcon (Study III), with special emphasis on describing the clinical disease, gross and microscopic lesions, together with the presence of viral antigen in tissues. In addition, viral shedding pattern for each avian species and each AIV was defined, and the likelihood of effective viral transmission among birds was assessed. Study II also represents a comparative study of infection dynamics of two different HPAIV subtypes (H7 and H5). In Studies I and II, special attention was paid on feathers as a potential origin of AIV dissemination. Besides, in Study II drinking water was investigated as for being a possible transmission route. Finally, in Study III, the natural AIV infection route in falcons (i.e., by ingestion of infected prey) was efficiently reproduced, and the influenza virus receptors’ pattern in this species was elucidated for the first time. In Study I, HPAIV‐infected red‐legged partridges displayed the first clinical signs at 3 days post‐inoculation (dpi), and mortality started at 4 dpi, reaching 100% at 8 dpi. The presence of viral antigen in tissues and viral shedding were confirmed by immunohistochemistry (IHC) and quantitative real time RT‐PCR (qRRT‐PCR), respectively, in both HPAIV‐inoculated and ‐contact partridges. Neither clinical signs nor histopathological findings were observed in LPAIV‐infected partridges. In addition, only short‐term viral shedding together with seroconversion was detected in some LPAIV‐inoculated partridges. Study I demonstrates that the red‐legged partridge is highly susceptible to the H7N1 HPAIV strain used, causing severe disease, mortality, and abundant viral shedding, and thus, contributing to the spread of a potential local outbreak of this virus. In contrast, our results concerning H7N9 LPAIV suggest that the red‐legged partridge is not a reservoir species for this virus. In Study II, severe neurological signs and mortality rates of 67% (H7N1/HP) and 92% (H5N1/HP) were observed in HPAIV‐infected European quail. Although histopathological findings were present in both HPAIV‐infected groups, H5N1/HP‐quail displayed a broader viral antigen distribution and extent of microscopic lesions. Neither clinical nor pathological involvement was observed in LPAIV‐infected quail. Consistent long‐term viral shedding and effective transmission to naïve quail was demonstrated for the three studied AIVs. Drinking water arose as a possible transmission route and feathers as a potential origin of HPAIV dissemination. Study II demonstrates that European quail may play a major role in AI epidemiology, highlighting the need to further understand its putative role as an intermediate host for avian/mammalian reassortant viruses. In Study III, falcons exhibited similar infection dynamics regardless the different routes of exposure (i.e., nasochoanal route or by ingestion of infected prey), demonstrating the effectiveness of in vivo feeding route. H5N1/HP‐infected falcons died, or were euthanized, between 5–7 dpi after showing acute severe neurological signs. Presence of viral antigen in several tissues was confirmed by IHC and RRT‐PCR, which was generally associated with significant microscopical lesions, mostly in the brain. Neither clinical signs, nor histopathological findings were observed in any of the H7N2/LP­infected falcons, although all of them had seroconverted by 11 dpi. Avian receptors were strongly present in the upper respiratory tract of the falcons, in accordance with the consistent oral viral shedding detected by RRT‐PCR in both H5N1/HP‐and H7N2/LP‐infected falcons. Study III demonstrates that gyr‐saker hybrid falcons are highly susceptible to H5N1/HP virus infection, as previously observed, and that they may play a major role in the spreading of both HPAIV and LPAIV. For the first time in raptors, natural infection by feeding on infected prey was successfully reproduced. The use of avian prey species in falconry husbandry and wildlife rehabilitation facilities could put valuable birds of prey and humans at risk and, therefore, this practice should be closely monitored. The present dissertation highlights the importance of studying the susceptibility, infection dynamics, and transmission likelihood of AIVs in host avian species at the domestic‐wild interface. Such knowledge is crucial to effectively perform surveillance efforts, develop appropriate preventive measures, and successfully manage AI outbreaks when different avian species are involved. La influença aviària (IA) s’ha convertit en un dels reptes més importants que mai hagi sorgit del reservori animal. Els constants brots que s’han detectat arreu del món en aus domèstiques i aus salvatges afecten en gran mesura a l’economia de la indústria avícola, a la conservació de les aus salvatges i a la sanitat animal i pública. El grau de susceptibilitat als virus d’IA (VIA) és extremadament diferent entre les espècies aviàries, igual que succeeix amb la seva possible funció com a sentinelles, hostes intermediaris o reservoris. Fins ara, diversos estudis experimentals i infeccions naturals han avaluat la susceptibilitat de nombroses espècies aviàries menors i majors a diferents VIA d’alta patogenicitat (VIAAP) o de baixa patogenicitat (VIABP). Es considera que els gal∙liformes són altament susceptibles, mentre que les aus aquàtiques es consideren reservoris naturals. Tanmateix, existeix molt poca informació sobre la dinàmica d’infecció de la IA en la perdiu roja (Alectoris rufa), en la guatlla europea (Coturnix c. coturnix) i en el falcó híbrid sacre‐grifó (Falco rusticolus x F. cherrug). Aquestes espècies aviàries no convencionals poden suscitar un gran interès a regions geogràfiques determinades, com ara la península Ibèrica. Les espècies esmentades no només pertanyen a la fauna autòctona, sinó que també es crien (normalment en sistemes agrícoles extensius) en benefici dels humans, la qual cosa comporta un estret contacte tant amb humans com amb la fauna local.

EN EL PRESENTE TRABAJO SE DESCRIBEN LOS EXPERIMENTOS REALIZADOS CON EL OBJETO DE DEMOSTRAR LA EXISTENCIA O NO DE UNA ASOCIACION ENTRE EL PRRSV Y H. PARASUIS. PARA ELLO SE HAN REALIZADO ESTUDIOS TANTO IN VIVO COMO IN VITRO, HACIENDO HINCAPIE EN LOS ESTUDIOS PATOLOGICOS Y DE PATOGENIA EN LOS PRIMEROS, Y ULTRAESTRUCTURALES Y FUNCIONALES EN LOS SEGUNDOS. SE REALIZARON 3 EXPERIMENTOS CON ANIMALES CON EL OBJETO DE DILUCIDAR SI LA PRESENCIA PEVIA DE PRRSV PROVOCABA UN AUMENTO EN LA PREVALENCIA DE POLISEROSITIS FIBRINOSA EN LOS ANIMALES INOCULADOS POSTERIORMENTE CON H. PARASUIS (EXPERIMENTOS 1 Y 3), Y OBTENER UN MODELO ADECUADO DE REPRODUCCION DE ENFERMEDAD DE GLASSER (EXPERIMENTO 2). EN LOS 2 PRIMEROS EXPERIMENTOS SE OBSERVO QUE LA UTILIZACION DE ANIMALES LIBRES DE PRRSV DIFICILMENTE PERMITE LA REPRODUCCION DE LA ENFERMEDAD DE GLASSER, LO CUAL SUGIRIO QUE EL COMPONENTE DE INMUNIDAD SISTEMICA PUEDE SER DETERMINANTE DE CARA A DESARROLLAR O NO LA INFECCION POR H. PARASUIS. EN EL TERCER EXPERIMENTO, REALIZADO CON ANIMALES LIBRES DE LOS DOS AGENTES PATOGENOS, SE LOGRO REPRODUCIR POLISEROSITIS FIBRINOSA EN 7 DE 10 CERDOS INOCULADOS EXCLUSIVAMENTE CON LA BACTERIA, PERO LA INOCULACION DE PRRSV PRIMERO Y H. PARASUIS (SEROVAR 5) 5 DIAS DESPUES NO RESULTO EN UN AUMENTO DE ENFERMEDAD DE GLASSER SINO EN UNA DISMINUCION DE ESTA PERO UN AUMENTO EN LOS NIVELES DE MORTALIDAD SUBITA RESPECTO AL GRUPO INOCULADO SOLO CON LA BACTERIA. ESTOS RESULTADOS SUGIEREN QUE EL EFECTO INMUNOMODULADOR DEL PRRSV, EN LOS CUALES SE PRODUCE UNA DISMINUCION DE LAS DEFENSAS A NIVEL PULMONAR PERO UNA MEJORA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA SISTEMICOS, PODRIA SER LA RAZON DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS. EN LOS EXPERIMENTOS ULTRAESTRUCTURALES IN VITRO SE PRETENDIO ESTUDIAR LOS CAMBIOS SUFRIDOS POR LOS MAP INOCULADOS CON PRRSV Y DUALMENTE CON PRRSV Y H. PARASUIS, UTILIZANDO UNA DOSIS VIRICA DE 1 MOI. LA INFECCION DE MAP POR PRRSV DENOTO CAMBIOS MINIMOS EN LA ULTRAESTRUCTURA DE ESTOS, PRODUCIENDOSE BASICAMENTE UN AUMENTO DEL NUMERO DE LISOSOMAS. LA PRESENCIA DE LA BACTERIA PRODUJO UN CAMBIO DE ULTRAESTRUCTURA MUY EVIDENTE EN MAP, CON UNA MASIVA FORMACION DE FAGOSOMAS Y FAGOLISOSOMAS. LOS MAP SE MOSTRARON, ADEMAS, COMO CELULAS DE EFICACIA RELATIVA EN FAGOCITOSIS DE H. PARASUIS OPSONIZADA. EN LOS EXPERIMENTOS IN VITRO DE FUNCIONALIDAD SE PRETENDIO VALORAR LAS CAPACIDADES DE FAGOCITOSIS Y MUERTE INTRACELULAR DE H. PARASUIS POR PARTE DE MAP INFECTADOS O NO CON PRRSV. LOS RESULTADOS DE ESTAS PRUEBAS REVELARON QUE LA BACTERIA OPSONIZADA ERA FAGOCITADA POR MAP A UNOS NIVELES RELATIVAMENTE BAJOS (PORCENTAJES DE FAGOCITOSIS INFERIORES AL 25%), PERO QUE LA BACTERIA NO OPSONIZADA NO ES PRACTICAMENTE FAGOCITADA. POR OTRO LADO, SE PRESENTO UNA TENDENCIA DE MENOR CAPACIDAD DE MUERTE INTRACELULAR A MEDIDA QUE AUMENTAVA EL TIEMPO PI VIRICO.

TESIS DOCTORAL:Reducción de la deposición de grasa abdominal en el pollo de carne mediante la modificación del perfil de ácidos grasos de la dieta.Nieves Crespo AlcarriaTanto la selección genética y la utilización de dietas cada vez más energéticas han permitido un aceleramiento de la velocidad de crecimiento del pollo. Así, mientras que en los años 50 eran necesarios unos 85 días para que un pollo de carne alcanzara un peso de 1.800 gramos, actualmente este periodo se reduce a 36 días, y además se acompaña de una mejora en el índice de conversión de más de un 50%. Sin embargo, paralelamente a esta mayor velocidad de crecimiento se ha producido un mayor engrasamiento de la canal.En el procesado industrial, la grasa de la carcasa constituye una pérdida económica importante. Si además consideramos la mayor aceptación de los productos con bajo contenido en grasa, por parte de los consumidores se justifica el interés por conseguir una reducción en la deposición de grasa corporal en el pollo de carne.Numerosos trabajos realizados en mamíferos y algunos realizados en pollos sugieren que la sustitución de grasa saturada por poliinsaturada en la dieta del pollo podría producir un menor engrasamiento de la canal. En la presente tesis se estudió el efecto de dietas con diferentes perfiles de ácidos grasos sobre la deposición de grasa y el metabolismo lipídico del pollo de carne o Broiler. Se utilizaron 4 tipos de grasa con diferente grado de insaturación a un nivel de inclusión en el pienso del 10%: sebo (rico en ácidos grasos saturados), aceite de oliva (rico en ácidos grasos monoinsaturados), aceite de girasol (rico en ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-6) y aceite de linaza (rico en ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3). Los objetivos principales fueron determinar el efecto de los diferentes tipos de grasa en la dieta sobre:  Los parámetros productivos del pollo La deposición de grasa corporal, abdominal y en otros depósitos lipídicos definidos La retención de energía, proteína, grasa y ácidos grasos La síntesis hepática de ácidos grasos Determinados parámetros bioquímicos relacionados con la deposición de grasa en el pollo (VLDL, glucosa e insulina). Los resultados obtenidos demostraron que las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados mejoran el índice de conversión en el pollo Broiler hasta un 10%. El porcentaje de grasa abdominal y de otros depósitos lipídicos definidos disminuyó de forma significativa (aproximadamente 30g) con las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados. Por otro lado se observó una mayor beta-oxidación de ácidos grasos en los pollos alimentados con las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados dando lugar a una menor eficiencia energética de estas raciones. Sin embargo, al determinar la síntesis de ácidos grasos hepáticos, se observó que la dieta con linaza producía un mayor grado de lipogénesis que el resto de dietas estudiadas. Por tanto, se concluye que las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados reducen la deposición de grasa en el pollo de carne. Sin embargo, los resultados indican que no es la modificación de la actividad lipogénica la principal causa de la reducción de la deposición de grasa por los AGPI de la dieta, sino que sería la mayor actividad oxidativa de ácidos grasos y por tanto, la menor eficiencia energética de las dietas suplementadas con dichos ácidos grasos para la deposición de energía. Teniendo en cuenta la escasa contribución de la síntesis endógena de ácidos grasos a la deposición de grasa en pollos alimentados con dietas con un alto porcentaje de inclusión de grasa cualquier modificación en dicha actividad no habría de suponer una modificación detectable en la deposición de grasa corporal ya que podría ser totalmente compensada por la deposición directa de grasa dietética que se produce con estas raciones. / Reduction of abdominal fat deposition in Broiler chicken by dietary fatty acid profile modification.Nieves Crespo AlcarriaGenetic selection and use of energetic rations has led to an increase in broiler growth. Fifty years ago chickens spend 85 days to reach 1.800g of body weight. Nowadays this period has been reduced to 36 days and moreover feed conversion ratio has been improved in more than 50%. However, as a consequence of this higher growth it has been produced higher carcass fat deposition.In the processing plant, carcass fat constitute important economic loses. If we also take into account the higher acceptance of low fat content products by consumer, this justifies interest to obtain a reduction in body fat deposition of chickens.Several works performed in mammals and some in chickens suggest that substitution of saturated fat by polyunsaturated fat in feed could reduce carcass fat deposition.In the present work the effect of feed with different fatty acid profile on fat deposition and lipid metabolism in the chicken was studied. Four types of fat with different saturation level were used at 10% inclusion level. Tallow was added as a source of saturated fatty acid, olive oil as a source of monounsaturated fatty acids, sunflower oil as a source of polyunsaturated fatty acids of n-6 series and linseed oil as a source of polyunsaturated fatty acids of n-3 series.Main objectives were to determine the effect of different dietary fats on: Performance parameters of broiler chickens. Body and abdominal fat deposition and fat deposition in other separable fat depots. Energy, protein, fat and fatty acid deposition. Hepatic lipid synthesis. Biochemical parameters related with fat deposition in broiler chicken (VLDL, glucose and insulin).Obtained results show that diets rich in polyunsaturated fatty acids improve feed conversion ratio in about 10%.Percentage of abdominal fat and other separable fat depots was significantly reduced with diets rich in polyunsaturated fatty acids. This reduction reached values of about 30g of adipose tissue.On the other hand, higher fatty acid beta-oxidation was obtained in broilers fed diets rich in polyunsaturated fatty acids which could lead to lower energetic efficiency of feed. Results of hepatic fatty acid synthesis showed higher levels in broilers fed diet with added linseed oil, respect to the rest of the diets.It was concluded that diets rich in polyunsaturated fatty acids reduce fat deposition in broiler chicken. Results suggest that the main cause of fat reduction by polyunsaturated fatty acids is not a modification in lipogenesis level but also the higher fatty acid beta-oxidation observed with these diets, that would lead to lower energetic efficiency of the diet to fat deposition. Taking into account the low contribution of endogenous fatty acid synthesis to fat deposition in broilers fed high fat diets, any modification in this endogenous activity would not lead to a modification in body fat deposition as it would be compensate by direct dietary fat deposition.

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En el gat, encara que amb freqüència es parla dels desordres associats a eosinòfils, inclòs el EGC, són poc coneguts i en general s'associen a causes immuno-mediades o parasitàries, anàlegs als seus equivalents humans. Tot i així, el contingut i les funcions dels eosinòfils dels gats, encara que es consideren similars als eosinòfils humans, no es coneixen. Per tot això, els objectius d'aquesta tesi varen ser estudiar el EGC felí i obtenir informació específica de la biologia dels eosinòfils del gat.En aquesta tesi, es varen estudiar els signes histopatològics de les diferents lesions clíniques del EGC amb seccions de H & E i tinció tricròmica. A H & E, totes les lesiones del EGC examinades es varen caracteritzar per un infiltrat dèrmic eosinofílic, de intensitat variable, i per la presència de petits a grans focus de material eosinofìlic que amb la tinció tricròmica, semblaren estar constituïts per fibres de col·lagen normals rodejades per restes de material amb el mateix aspecte tintorial dels grànuls dels eosinòfils. Aquests resultats indiquen que les lesiones del EGC amb diferent aspecte clínic histopatològicament són indistingibles i que els focus dèrmics de material eosinofílic, petits i grans, tenen una histogènesi similar. A més, les figures amb flama, utilitzades per definir petits focus de material eosinofílic amb analogia amb les figures amb flama de la síndrome de Wells, es poden utilitzar també per parlar de dipòsits de material eosinofílic de gran tamany. A més, es va investigar la ultraestructura de les figures en flama, petites i grans, de les lesions del EGC. Estan formades per fibrilles de col·lagen morfològicament inalterades, fibres de col·lagen parcialment separades per edema i restes cel·lulars i eosinòfils desgranulats via ECL i PMD. La ultraestructura de les figures en flama al EGC va ser similar al que es descriu a les figures en flama de la síndrome de Wells humana. Això suggereix que en el gat els eosinòfils juguen un paper primari en la formació de les figures en flama, anàlogues a les descrites als humans. A més, aquest estudi demostra que al EGC felí, en els teixits, els eosinòfils alliberen el contingut dels seus grànuls per ECL i PMD, igual que els eosinòfils tisulars humans en inflamacions mediades per eosinòfils. El mecanisme de desgranulació predominant va ser ECL. Es va realitzar un estudi ultraestructural de eosinòfils circulants de gats amb diferents recomptes de eosinòfils i diferents malalties asociades a eosinofília. Als eosinòfils perifèrics es va observar morfologia de PMD, indicativa d'activació i desgranulació. No es va observar correlació directa entre en numero de eosinòfils que presentaven canvis de PMD i el nivell de eosinofília sanguínia. Aquesta última observació suggereix que el recompte del número total de eosinofils circulants no representa el millor criteri per avaluar la participació dels eosinòfils en una malaltia eosinofílica.Finalment, es va realitzar un estudi sobre les proteïnes dels grànuls dels eosinòfils del gat. Es varen estudiar les proteïnes dels grànuls extretes de eosinòfils obtinguts per inducció experimental de eosinofilia peritoneal. Les proteïnes es varen analitzar per cromatografia de gel-filtració i es varen estudiar les seves activitats biològiques. Les proteïnes dels grànuls dels eosinòfils del gat tenen activitats peroxidasa, RNasa i bactericida. La EAR felina presenta una homologia de la seqüència N-terminal amb les proteïnes de la superfamília de la RNasa A, incloses les RNases de eosinòfils i la seqüència N-terminal de la MBP felina va ser homòloga a la de la MBP-1 humana i murina. Aquest resultats indiquen que les proteïnes dels grànuls del eosinòfil felí tenen un paper biològic similar als descrits als humans i a altres espècies animals i evidencien que el gat pot ser una espècie adequada per l'estudi de les malalties eosinofíliques humanes. / Despite being commonly reported, feline eosinophil-associated disorders, including EGC, are poorly understood and generally associated to immune-mediated or parasitic causes, analogous to their human counterparts. Nevertheless, cat eosinophil functions and contents, although considered similar to those of human eosinophils, are currently unknown. Hence, the objectives of this thesis were to study feline EGC and to obtain specific information on the cat eosinophil biology. In this thesis, the histopathological features of clinically different EGC lesions were studied on H & E and trichrome stained sections. With H & E stain, all the EGC lesions examined were characterised by a dermal eosinophilic infiltration of variable intensity and the presence of small- to large-sized foci of eosinophilic debris that, with trichrome stain, appeared to consist of normally stained collagen fibres surrounded by a debris showing the same tinctorial properties as eosinophil granules. These results showed that EGC lesions with different clinical appearance are histopathologically indistinguishable and that small- and large-sized dermal foci of eosinophilic debris have similar histogenesis. Hence, the term flame figures, normally used to define small foci of eosinophilic debris by analogy with flame figures in Wells' syndrome, may be employed also to designate large-sized focal depositions of this debris. Furthermore, the ultrastructure of small- and large-sized flame figures in EGC lesions was investigated. They comprised morphologically unaltered collagen fibrils, collagen fibres partly disrupted by oedema and cellular debris, and degranulating eosinophils via ECL and PMD. The ultrastructure of flame figures in EGC was similar to that reported in flame figures of human Wells' syndrome. This suggested that eosinophils play a primary role in flame figures formation in cats, analogous to what reported in humans. In addition, this study demonstrated that tissue eosinophils in feline EGC release their granule contents by ECL and PMD, analogous to human tissue eosinophils at sites of eosinophil-mediated inflammation. ECL was the predominant mode of degranulation. An ultrastructural study of feline circulating eosinophils from cats with various blood eosinophil counts and different eosinophil-associated diseases was also performed. PMD morphology, indicative of eosinophil activation and degranulation, was recognised in peripheral eosinophils. No direct correlation was found between the number of eosinophils showing PMD changes and the level of blood eosinophilia. This latter finding suggested that total blood eosinophil count might not represent the best criterion to evaluate the contribution of eosinophils to the ongoing eosinophil-associated disease. Finally, a study on cat eosinophil granule proteins was conducted. Granule proteins, extracted from cat eosinophils obtained by experimentally induced peritoneal eosinophilia, were analysed by gel-filtration chromatography and their biological activities were studied. Cat eosinophil granule proteins possessed peroxidase, RNase and bactericidal activities. Feline EAR showed N-terminal sequence homology with proteins of the RNase A superfamily, including eosinophil RNases, and the N-terminal sequence of feline MBP was homologue to that of human and murine MBP-1. These findings indicated that feline eosinophil granule proteins have biological roles similar to those reported in humans and other animal species and highlighted that the cat might represent a suitable species for studying human eosinophil-mediated diseases.