La transmisión de patógenos zoonósicos desde la fauna salvaje al ganado doméstico, y vice-versa, es una problemática global ya que los ungulados salvajes aumentan en número y distribución en toda Europa, incluso en áreas urbanas. Al mismo tiempo, en la Unión Europea la frecuencia de ciertas zoonosis de transmisión alimentaria aumenta cada año. Además, la resistencia antimicrobiana es una amenaza mundial que urge ser monitorizada para evitar su diseminación. El propósito de esta Tesis es investigar si ciertos patógenos zoonósicos se comparten entre el ganado doméstico en extensivo y los ungulados salvajes (el jabalí – Sus scrofa - y la cabra montés – Capra pyrenaica) de un entorno natural del noreste español. Adicionalmente, hemos analizado la presencia de resistencia antimicrobiana tanto en patógenos como en bacterias comensales de estos hospedadores. Por último, se exploró lo mismo en jabalíes urbanos de Barcelona (España). La prevalencia de Salmonella fue mayor en jabalíes que co-habitaban con ganado vacuno (35.67%, CI 95% 28.19 - 43.70) que en aquellos que no (17.54 %, CI 95% 8.74 - 29.91), de manera similar, la riqueza de serotipos fue mayor en el primer grupo. Además, la probabilidad de que un jabalí sea portador de Salmonella aumenta cuanto mayor es el rebaño de vacas con el que comparte el hábitat. El hallazgo una cepa de S. Enteritidis resistente a ciprofloxacina y ácido nalidíxico en jabalí es una causa de preocupación para la salud pública. La diferente prevalencia de Salmonella en ganado vacuno (21.92%, 95% CI 13.10-33.14) y cabra montés (0.96%, 95% CI 0.2-2.8) y la ausencia de serotipos compartidos sugieren la ausencia de nexo (más información en el Estudio I y II). La prevalencia de E. coli O157:H7 fue baja: 3.41% en jabalí (IC 95% 0.94 - 8.52) y 1.88% en cabra montés (IC 95% 0.39 - 5.38), mientras que este patógeno no fue aislado del ganado doméstico (Estudio III). Respecto a Campylobacter, las muestras de cabra montés fueron negativas. C. jejuni se aisló de un jabalí (0.67%, IC 95% 0.02 – 3.66), sin embargo, C. jejuni fue la especie predominante en el ganado vacuno: 9.09% (IC 95% 3.02 – 19.95). C. lanienae fue la especie más frecuente en jabalí (12%, IC 95% 7.27 – 18.3) y se encontró simultáneamente en una vaca. Este estudio (IV) indica que, de nuevo, la cabra montés parece no desempeñar un papel importante en la epidemiología de Campylobacter. Además, aunque el jabalí y el ganado vacuno tienen su propia especie predominante de Campylobacter, existe una potencial transmisión de C. lanienae y C. jejuni entre ambos hospedadores. Tanto los animales salvajes como domésticos parecen poco importantes como reservorio de resistencia antimicrobiana (Estudio III). La frecuencia de resistencia en E. coli indicador fue reducida (0 a 7.9%). Sin embargo, se detectó resistencia a una cefalosporina de tercera generación en jabalí, y a fluoroquinolonas tanto en éste como en ganado vacuno. Esto sugiere el potencial del jabalí como centinela de resistencia antimicrobiana en una gran variedad de ambientes. En jabalíes urbanos, Salmonella se encontró en un 5% (IC 5% 0.61-16.91) y Campylobacter coli en un 4.88% (IC 95% 0.6-16.53). Otros Campylobacter termófilos fueron moderadamente prevalentes (19.51%, 95% CI 8.82-34.87), mientras que C. jejuni y E. coli O157:H7 no fueron aislados. La frecuencia de resistencia antimicrobiana fue mayor en Enterococcus faecium (95% de los aislados era resistente a uno o más agentes), seguido por Enterococcus faecalis (50%) y E. coli (10%). Además, describimos por primera vez resistencia a linezolid en un aislado procedente de fauna salvaje. Ya que estos resultados tienen implicaciones en la salud pública, es necesario llevar a cabo un seguimiento sanitario de la fauna en entornos urbanos.

Els virus de la influença tipus A (VIA) són patògens zoonòtics que poden infectar un ampli nombre d’hostes incloent-hi les aus, els porcs i els homes, entre altres. Anualment es documenten milions d’infeccions en humans causades per virus de la influença estacionals. Les pandemies causades pel virus influença també tenen una elevada repercussió pel que fa a la sanitat i l’economia. Tot i que determinats subtipus de VIA s’adapten millor en espècies d’aus que en humans, hi ha hagut casos d’infeccions en humans per virus de la influença de tipus aviars. La susceptibilitat dels porcs per infectar-se amb virus de la influença tant d’origen aviar com humà és també important pel que fa a la salut pública. El genoma del virus influença és segmentat in consta de vuit molècules de ARN de cadena senzilla i sentit negatiu que codifiquen per 11 o 12 proteïnes. Per tant, si una cèl·lula s’infecta simultàniament per dos VIA diferents, pot succeir un reagrupament amb la conseqüent generació d’una nova soca de virus. A més, mutacions a les glicoproteïnes de superfícies (sobretot a l’hemaglutinina, HA) són les responsables de l’elevada variabilitat de VIA. Tot i que les vacunes front a les epidèmies estacionals són eficaces, no produeixen resposta immunològica front una amplia varietat de VIA. És a dir, les vacunes estacionals només protegeixen front a les soques virals circulants durant una determinada estació. Aquest fet, junt amb el risc de possibles pandèmies, han fet encara més important i urgent el desenvolupament d’una vacuna universal capaç de produir immunitat front a múltiples subtipus virals. En la present tesis s’ha estudiat la resposta immunitària front a la infecció i vacunació del VIA en el context de VIA d’alta patogenicitat (vIAAP) A/H5N1 i A/H7N1 i el virus pandèmic A/H1N1 (pH1N1). El treball s’ha dividit en tres parts i cada part s’ha subdividit en capítols. Part I (capítols 1 i 2), conté la introducció general i els objectius de la tesi doctoral. L’objectiu d’aquesta primera part és donar una visió global i introduir informació per entendre (i) la infecció pel virus de la influença, (ii) la resposta immunològica provocada després de la infecció per VIA i (iii) un breu resum de les vacunes actuals front a influença. A continuació, s’exposen els objectius a aconseguir. Part II, és el cos de la tesis i conté els quatre treballs (del capítol 3 al 6) duts a terme durant els quatre anys que ha durat el programa de doctorat. Tots els capítols presentats han estat publicats o sotmesos a publicació en revistes indexades internacionals. Per tant, cada estudi manté l’estructura estàndard de: resum, introducció específica, materials i mètodes, resultats i breu discussió. Estudiar el paper dels determinants virals i caracteritzar la infecció pel VIA en diversos hostes pot ser de gran interès a l’hora de dissenyar vacunes òptimes. S’ha descrit la proteïna NS1 com a un dels principals determinants de virulència en mamífers, però no s’ha estudiat gaire el paper d’aquesta en aus. En el capítol 3 es va avaluar la implicació de la proteïna NS1 en la patogenicitat viral en pollets. Es van infectar pollets amb vIAAP H7N1 que contenien el segment NS de vIAAP H5N1. Les manifestacions patològiques i la resposta immunològica conseqüència de la infecció amb cada un dels virus van ser avaluades. També és molt important el paper de la immunitat prèvia durant un brot perquè pot ser determinant de la mort o supervivència de l’animal. En el capítol 4 es van exposar pollets a un virus H7N2 de baixa patogenicitat (vIABP) i a continuació es van infectar amb un vIAAP H7N1. Posteriorment es van infectar amb un vIAAP H5N1. Els animals que havien estat infectats prèviament amb vIABP quedaven protegits a la posterior infecció letal amb el vIAAP H7N1. No obstant, la resposta immunitària produïda no era suficient per a protegir els pollets front a la infecció amb un virus heterosubtípic (vIAAP H5N1). La presència o absència d’anticossos inhibitoris front a H7- i H5- correlacionaven amb la presència o absència de protecció, respectivament. Conèixer els programes de vacunació actuals i la seva eficàcia és útil per a planificar i dissenyar futures estratègies de vacunació. Les aus aquàtiques són el reservori dels VIA; per tant, són extremadament importants pel que fa a l’ecologia del virus. Aprofitant els programes de vacunació es va testar el sèrum de diverses espècies d’aus de zoològics i centres de recuperació d’Espanya (capítol 5). Els sèrums es van utilitzar per a l’avaluació de la resposta humoral deguda a la vacuna. El principal objectiu del treball era determinar l’eficàcia de vacunes disponibles (inactivades en suspensió oliosa) en diverses espècies d’aus i comparar la variabilitat inter- i intra-espècie. Finalment, i tenint en compte el potencial risc del VIA, els esforços es van focalitzar en desenvolupar una vacuna capaç de protegir a un ampli nombre de subtipus de VIA. La pandèmia de 2009 amb el virus H1N1 (pH1N1) és un clar exemple que els porcs poden actuar com a “coctelera” i generar nous virus. En el capítol 6 es van immunitzar porcs amb pèptids derivats de l’HA i a continuació es van infectar amb el virus pH1N1. Tot i que els pèptids-HA produïen una molt bona resposta humoral i cel·lular, no es va detectar activitat neutralitzant i només es va obtenir un efecte parcial en l’eliminació del virus. Part III (Capítols 7 i 8), és la secció on es discuteixen les implicacions dels resultats obtinguts en els diferents estudis i on s’enumeren les conclusions principals. En una secció a part, s’han inclòs totes les referències bibliogràfiques utilitzades per a l’elaboració de la tesi. S’ha inclòs també un apèndix per afegir informació addicional. / Influenza A viruses (IAV) are zoonotic pathogens that can replicate in a wide range of hosts, including birds, pigs and humans, among others. Millions of human infections caused by seasonal influenza virus are reported annually. Influenza pandemics have also a significant health and economic repercussions. Although certain subtypes of IAV are better selected in avian species than in humans, there are reports that evidence cases of human infections with avian influenza viruses (AIV). The susceptibility of pigs to infection with influenza viruses of both avian and human origins is also important for public health. The genome of influenza virus is segmented and consists of eight single-stranded negative-sense ribonucleic acid (RNA) molecules encoding 11 or 12 proteins. Thus, if a single cell is simultaneously infected by two distinct influenza viruses, a reassortment can occur resulting in the generation of a novel virus strain. Moreover, mutations in the surface glycoproteins (mainly in the hemagglutinin, HA) are the responsible of the high variability of IAV. Influenza vaccines against seasonal epidemics, although have good efficacy do not elicit immune response against a wide variety of IAV. Thus, seasonal vaccines only confer protection against the circulating viral strains. This, together with the risk of potential pandemics, has highlighted the importance of developing a universal vaccine able to elicit heterosubtypic immunity against multiple viral subtypes. In this thesis the immune response to IAV infection and vaccination was evaluated in the light of the risk of highly pathogenic AIV (HPAIV) A/H5N1 and A/H7N1, and the pandemic IAV A/H1N1. The work is divided into three parts and each one is further divided into chapters. Part I (chapters 1 and 2) contains the general introduction and the objectives of the thesis. The aim of this first part is to give a global overview and to introduce information to understand (i) the influenza infection, (ii) the immune responses elicited after IAV infection and (iii) a brief summary of current vaccines against influenza. Afterwards, the initial objectives to be achieved are exposed. Part II is the body of the thesis and it contains four studies (from chapter 3 to 6) developed during the four-year period comprising the PhD program. All the chapters are published or submitted to publish in international peer-reviewed journals. Thus, each study contains an abstract, a specific introduction, the materials and methods section, the obtained results and a discussion. To study the role of IAV determinants and to characterize the influenza infection in different hosts could be of great importance to direct the efforts to the formulation of more efficient vaccines. The non structural 1 (NS1) protein is known to be a major determinant of virulence in mammals but little is known about its role in avian species. In chapter 3, the involvement of NS1 in viral pathogenicity was evaluated in chickens. Birds were challenged with two reassortant AIV carrying the NS-segment of H5N1 HPAIV in the genetic background of an H7N1 HPAIV. The pathological manifestations, together with the immunological outcome were evaluated. The role of pre-existing immunity during an outbreak is also important and can determine whether the animals succumbed to infection or not. In chapter 4, chickens pre-exposed to H7N2 low pathogenic AIV (LPAIV) were challenged with H7N1 HPAIV and subsequently infected with H5N1 HPAIV. Pre-exposed animals were protected against the lethal H7N1-challenge whereas naïve animals succumbed. However, pre-existing immunity did not provide protection against HA-heterosubtypic virus (H5N1 HPAIV). The presence or absence of H7- and H5-inhibitory antibodies correlate with the protection (or lack of it) afforded. The control of current vaccination programs and their efficacy is useful to plan and design better vaccines. It is well known that wildfowl are the reservoirs of IAV; thus they are extremely important concerning the ecology of the virus. Sera from several avian species from Spanish zoos and wildlife centers were collected during two successive vaccination programs and were tested to evaluate the vaccine-elicited humoral response (chapter 5). The main objective of this work was to determine the efficacy of current vaccines (inactivated water-in-oil) in several avian species and to compare the differences inter- and intra-specie. Finally, and taking into account the potential risk that IAV represent to our society, the efforts were focused on developing a broadly protective influenza vaccine. The 2009 human H1N1 pandemic (pH1N1) is a clear example that pigs can act as a vehicle for mixing and generating new assortments of viruses. In chapter 6 pigs were immunized with HA-derived peptides and subsequently infected with pH1N1 virus. Although the HA-peptides induced broad humoral and cellular responses no neutralization activity was detected and only a partial effect on virus clearance was observed. Part III (chapters 7 and 8) is where the implications of all the findings from the studies are discussed and the major conclusions are listed. A list of all the references used to develop the thesis is listed after the three parts, in an independent section. An appendix section is also included to give further information.

El presente estudio se desarrolló bajo el marco del proyecto europeo PigQTech cuyoobjetivo es investigar si QTLs de importancia económica en la industria productoraporcina, previamente descritos en cruces de razas divergentes, se encuentransegregando en poblaciones comerciales. En el presente estudio se analizaron dospoblaciones porcinas de tipo comercial Pietrain y Large White, donde fue analizada lapresencia de QTLs, búsqueda y análisis de genes candidatos. La búsqueda de QTLs seefectuó mediante el análisis de la segregación alelica de microsatélites y su relación conlos caracteres productivos medidos. Se analizaron 10 regiones de los cromosomas 1, 2,3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, tres de las cuales fueron utilizadas como regiones control (1, 6, 9)por no haber QTLs descritos previamente en ellas. Los resultados muestran segregaciónde QTLs para los cromosomas 2, 3, 4, 7 y para las regiones control 1 y 9 en la poblaciónLarge White, mientras en la población Pietrain se detectaron QTL en los cromosomas 7y 8. En resumen, se observó que los QTLs descritos en cruces de razas divergentes estánpresentes en poblaciones comerciales, sin embargo no segregan por igual entre lasdistintas poblaciones.Adicionalmente se realizó un estudio de asociación de los genes candidatos H-FABP,receptor de leptina (LEPR) y la piruvato carboxilasa (PC). El gen H-FABP reveló laexistencia de asociación entre los distintos genotipos para los caracteres de grasa dorsal,longitud de canal y pH, sin embargo estas asociaciones no se presentan por igual en lasdistintas poblaciones. El análisis de asociación del gen receptor de leptina reveló laexistencia de asociación entre sus distintos genotipos con un menor pH a las 24 horaspostmortem, sin embargo esta asociación se presentó solo en la población Large White.La secuenciación del cDNA del gen de la piruvato carboxilasa reveló una alta similitudnucleotídica con la de otras especies de mamíferos, y que además es polimórfica. Asímismo el mapeo mediante el panel de células somáticas híbridas irradiadas reveló que elgen de la PC está localizado en el cromosoma 2 en el brazo p entre los microsatélites SW2623 (9.8 cM) y el SW256 (19 cM). / The present study was developped under the framework of the European PigQTechproject, whose objective was to investigate the segregation of economically importantQTLs previously described in divergent pig crosses in commercial populations. In thepresent study, we analysed the segregation of QTL and candidate genes in Pietrain andLarge White. The search of QTLs was made by the analysis of the microsatellite allelicsegregation and its influence on the recorded commercial traits. Ten regions onchromosomes 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 and 13 were analysed. As not QTL had beenpreviously described in the regions located in chromosomes 1, 6 and 9, we used thesesegments as control regions. In Large White, results showed segregation of QTLs inchromosomes 2, 3, 4 and 7 as well as in the Ssc1 and Ssc9 control regions. The analysisin Pietrain indicated the presence of QTL in chromosomes 7 and 8. In summary, weobserved that QTLs described in experimental pig crosses are also present incommercial breeds. However these QTLs do not show the same segregation patternamong different populations.Additionally, we carried out an association analysis of the heart fatty acid bindingprotein (H-FABP), leptin receptor (LEPR) and pyruvate carboxylase (PC) candidategenes. The association analysis between H-FABP and the recorded traits, revealed theinfluence of this gene on back fat thickness, carcass length and pH in some of ourpopulations. Influence of LEPR on the pH at 24 hours postmortem was detected inLarge White. The analysis of the nucleotidic sequence of the PC cDNA, revealed both ahigh similarity between other mammal species, and the existence of sequencepolymorphism in our populations. Furthermore, we allocated PC in the short arm ofchromosome 2 (2p), between the markers SW2623 (9.8 cM) and SW256 (19 cM) in anRH panel.

El objetivo de esta tesis es estudiar la relación entre los problemas de comportamiento del perro y el gato doméstico y su estado de salud. Consta de dos grandes partes. La primera estudia el papel de los problemas médicos sobre el comportamiento del animal. En la segunda se analiza la relación inversa. El comportamiento de cualquier animal depende directamente del funcionamiento de sus órganos y sistemas. Muchos problemas médicos pueden modificar su funcionamiento. Por lo tanto, los problemas médicos pueden alterar el comportamiento del animal. El dolor puede potenciar la aparición, por diferentes mecanismos, de miedo, agresividad, conductas compulsivas y afectar al sueño. Además, se observó que existen dos formas clínicas diferentes de expresar la agresividad por dolor en el perro. Los perros que no son agresivos e inician un proceso doloroso, suelen ser agresivos cuando van a ser manipulados. Además estos son impulsivos, es decir, no muestran señales previas antes de morder. En el caso de aquellos perros que ya son agresivos cuando se inicia el proceso doloroso, suelen empeorar la agresividad pre-­‐existente. Muchos de los problemas médicos se expresan únicamente con cambios de comportamiento, incluso, sin alterar las pruebas de laboratorio o de imagen. Este hecho es especialmente importante en algunos problemas neurológicos que cambian el comportamiento. Existen zonas del sistema nervioso central (SNC) que tienen un control sobre el comportamiento pero que, sin embargo, no se reflejan en el examen neurológico. Además, algunas lesiones del SNC pueden ser únicamente funcionales, por lo que no se detectan ni en el examen neurológico, ni en las pruebas de imagen usadas convencionalmente. Finalmente, también existen problemas neurológicos que dan alteraciones en el examen neurológico y problemas de comportamiento pero que, sin embargo, no modifican las pruebas complementarias. La tesis recoge uno de estos casos, un gato con una polioencefalomielopatía espongiforme congénita, que es una enfermedad muy rara en el gato y en el ser humano. Es el primer caso descrito en el que el motivo de consulta principal fueron los cambios de comportamiento (falta de aprendizaje de los hábitos de eliminación y de la conducta de juego). Por otro lado, se ha visto que los problemas de comportamiento más frecuentes del perro (miedo, ansiedad por separación y agresividad) pueden alterar el perfil bioquímico y hematológico. La mayoría de los cambios no parecen inducir enfermedad de forma directa. Sin embargo, se ha observado que los perros agresivos tienen un ratio neutrófilos/linfocitos más elevado. El ratio neutrófilos/linfocitos se ha relacionado con un mayor riesgo de afectación cardiovascular en humanos, así como con un peor pronóstico de varios problemas médicos. Finalmente, se ha visto que la fluoxetina, uno de los fármacos más utilizados en medicina del comportamiento, también puede alterar el perfil bioquímico y hematológico del perro. Sin embargo, estos cambios no parecen ser patológicos. Toda esta evidencia sugiere que los problemas de comportamiento y el estado de salud están íntimamente relacionados. Además, evidencia la necesidad de colaboración entre las diferentes especialidades veterinarias para mejorar en el conocimiento científico de todas ellas. / The aim of this thesis is to study the relationship between medical and behavioral problems in domestic dogs and cats. It has been divided into two main parts. The role of medical conditions on behavioral problems has been studied in the first part. The inverse relationship has been analyzed in the second part. Animal behavior depends directly on the functioning of organs and systems. Medical conditions can modify the proper functioning of organs and systems. Thus, these medical problems can change behavior. Through different mechanisms, pain can lead to fear, aggressive behaviors, compulsive disorders and sleep alterations. Additionally, it has been observed that there are two different patterns of expression of pain-­‐related aggression. Dogs that were aggressive before the onset of pain may be more aggressive (more frequent and more intense) in the same context of their previous aggression and tend to be less impulsive. Otherwise, dogs that were not aggressive before the onset of pain may be more impulsive and the aggression may happen in a context of manipulation. Behavioral changes could be the only clinical signs of many medical conditions, even without changing laboratory or imaging tests. This fact is especially important in some neurological problems that lead to behavioral changes. There are zones in the central nervous system (CNS) that have a role in the control of behavior; however, they cannot be checked by a neurological examination. Additionally, some neurological lesions of those areas may only be functional. These lesions cannot be detected in the neurological examination nor in the laboratory or imaging tests. Finally, neurological problems that lead to changes in the neurological examination and behavioral problems, but without having changes in the work-­‐up can exist. This thesis shows one of these cases, a congenital spongiform polioencephalomyolopathy in a cat. This is a very strange disease in cats and human beings, and it is the first case where the main complaint of the owners were the behavioral changes (learning impairment regarding elimination habits and play behavior). On the other hand, it has been observed that most common behavioral problems (fear, separation anxiety and aggressive behaviors) can lead to changes in the biochemical and hematological panel. Most of these changes do not directly lead to medical problems. Nevertheless, it has been demonstrated that aggressive dogs show a higher neutrophils/lymphocytes ratio. The neutrophils/lymphocytes ratio has been related to a higher risk of developing cardiovascular problems, and to a poor prognosis of several medical conditions. Finally, it has also been observed that fluoxetine, one of the most common drugs used in behavioral medicine, can modify the biochemical and hematological panel of dogs. However, these changes do not seem to be pathological. All of this evidence suggests that behavioral and health problems are intimately related. Additionally, they highlight the importance to collaborate among the different veterinary specialities in order to improve the scientific knowledge of all disciplines.

La leishmaniosis canina (LC) es una zoonosis endémica en el Mediterráneo, está causada por Leishmania infantum y se transmite por Phlebotomus. En áreas endémicas, la prevalencia de la infección es muy superior a la prevalencia de la enfermedad. La LC es una enfermedad sistémica y los perros se pueden presentar con gran variedad de signos clínicos. Los signos clínicos oculares aparecen en el 16% al 80% de los perros con leishmaniosis y queratoconjuntivitis seca (KCS) se diagnostica en 2 - 17% de ellos. Pocos estudios han investigado los mecanismos patogénicos que causan los signos clínicos oculares. El principal objetivo de este proyecto fue adquirir un mayor conocimiento de las alteraciones que ocurren en los ojos y anejos oculares de los perros con leishmaniosis. En el primer estudio se caracterizó el tipo de infiltrado inflamatorio presente en los ojos de perros con leishmaniosis, en qué estructuras oculares estaba localizado y se evaluó la presencia de amastigotes de Leishmania mediante inmunohistoquímica. El 30% de los globos oculares presentaban inflamación granulomatosa a piogranulomatoso con linfocitos y células plasmáticas. El parásito se detectó en el 26,6% de los ojos. El infiltrado granulomatoso y el parásito estaban asociados significativamente. Las estructuras afectadas fueron, por orden: conjuntiva y limbo, cuerpo ciliar, iris, córnea, esclera y ángulo iridocorneal, coroides y nervio óptico. El infiltrado inflamatorio y la detección del parásito estaban asociados significativamente con los signos clínicos oculares. Se evaluaron los músculos lisos y estriados intraoculares, extraoculares y de los anejos donde se observó infiltrado granulomatoso con parásitos de Leishmania. El infiltrado se detectó alrededor de las fibras musculares, en el endomisio. No se detectaron necrosis, degeneración o regeneración de las fibras musculares, aunque esporádicamente había atrofia de las fibras. Ocasionalmente, los parásitos estaban dentro de las fibras. La inflamación se detectó en al menos uno de los músculos examinados en 24,03% de los ojos y anejos evaluados. La implicación de estos músculos en la LC no se había descrito previamente, y puede contribuir a los signos clínicos descritos. Se procedió a la investigación de las glándulas encargadas de la síntesis del componente acuoso (glándula lacrimal principal (MLG) y glándula de la membrana nictitante (NMG)) y lipídico (glándulas de Meibomio (MG)) de la película lacrimal. Se encontró un infiltrado granulomatoso similar al descrito en los ojos, que rodeaba los conductos de dichas glándulas, y ocasionalmente rodeando los acinos. La MG y la NMG estaban más frecuentemente afectadas que la MLG. No hubo diferencias significativas en la detección de parásitos entre las distintas glándulas. Las muestras de ojos con signos clínicos compatibles con KCS mostraban el infiltrado granulomatoso y la presencia del parásito más frecuentemente que las muestras de ojos sin signos clínicos. Un posible mecanismo por el que los perros con leishmaniosis desarrollan KCS es la infiltración granulomatosa alrededor de los conductos de las glándulas lacrimales, lo que causaría retención de la secreción. Finalmente, se investigó la cantidad de parásitos en las MG, MLG y NMG mediante PCR cuantitativa. Parásitos de Leishmania se detectaron en todas las muestras analizadas en cantidades variables. En las tres glándulas, las muestras obtenidas de perros con signos clínicos tenían más parásitos que las muestras de perros sin signos clínicos. Se establecieron puntos de corte óptimos para las tres glándulas, de manera que las muestras con resultados por debajo del punto de corte tenían más probabilidad de pertenecer a perros con signos clínicos asociados a KCS que las muestras con resultados por encima del punto de corte. Establecer puntos de corte puede ayudar al clínico a determinar si los signos oculares se deben a leishmaniosis o a otras causas de KCS. / Canine leishmaniosis (CL) is an endemic zoonosis highly prevalent in the Mediterranean shore, where it is caused by Leishmania infantum and transmitted by Phlebotomus sand flies. In these areas, the prevalence of infection is much higher than the prevalence of disease. CL is a systemic disease and hence dogs can present with a wide variety of clinical signs. Ocular disease occurs in 16% to 80% of dogs with leishmaniosis and keratoconjunctivitis sicca (KCS) in 2% to 27% of dogs with leishmaniosis. Studies investigating the pathogenic mechanisms underlying ocular disease are sparse. The main objective of this project was to gain further knowledge about the events occurring in the eyes and adnexal structures from dogs affected by leishmaniosis. First, we characterized the inflammatory infiltrate present in the eyes, where this inflammation was located within the globe and evaluated the presence of Leishmania amastigotes by immunohistochemistry. Thirty percent of globes had some degree of granulomatous to pyogranulomatous infiltrate with variable lymphocytes and plasma cells. The parasite was detected in 26.6% of globes. There was a significant association between the granulomatous infiltrate and the parasite. Affected structures were, in order of involvement: conjunctiva and limbus, ciliary body, iris, cornea, sclera and iridocorneal angle, choroid and optic nerve sheath. Both the granulomatous infiltrate and the parasite were significantly associated with clinically diagnosed ocular disease. Intraocular, extraocular and adnexal smooth and striated muscles were evaluated, and granulomatous infiltrate with associated Leishmania parasites were noted. Inflammatory infiltrate was noted around muscle fibers, in the endomysium. Myofiber necrosis, degeneration or regeneration was not noted, although myofiber atrophy was rarely seen. Occasionally, parasites were noted within myofibers. Inflammation was noted in at least one of the muscles in 24.03% of the evaluated eyes and adnexa. Involvement of these muscles had not been previously reported in CL and may contribute to some of the reported clinical signs. Adnexal glands that synthesize the aqueous (main lacrimal gland (MLG) and nictitating membrane gland (NMG)) and lipid (Meibomian glands (MG)) components of the tear film were investigated next. A similar granulomatous infiltrate was noted surrounding the ducts and occasionally surrounding acini. MG and NMG were more commonly affected by theinfiltrate than MLG. No significant differences in detection of Leishmania parasites were noted between glands. Samples from eyes with clinical signs compatible with KCS were more commonly affected by the granulomatous infiltrate than those from eyes without clinical signs. A possible pathogenic mechanism of KCS in CL is that granulomatous infiltration around ducts of lacrimal glands, induced by the parasite, causes subsequent retention of secretion. Finally, the project focused on investigating the amount of parasites in MG, MLG and NMG by real-time PCR, in order to elucidate if the number of parasites was related to development of KCS associated to CL. Leishmania parasites were found in various amounts in all samples analyzed. For all three glands, samples from dogs with clinical signs contained significantly more parasites (lower ΔCt (Cycle threshold)) than samples from dogs without clinical signs. Optimal cut-off values of ΔCt were established for all three glands, so that samples with ΔCt below these cut-offs were more likely to be from dogs that displayed clinical signs related to KCS than samples with ΔCt above the cut-off. These findings indicate that cut-off values could aid the clinician in determining, in a dog infected with Leishmania spp., if compatible ocular clinical signs are due to leishmaniosis or to other causes of KCS.

Acid-base disturbances have been reported in the veterinary literature concerning the field of the small animal intensive care. Such disorders have diagnostic, therapeutic, and prognostic implications in terms of morbidity and mortality in such population. Besides albumin is a weak acid that can affect pH and plays a key role in the metabolic component of the acid-base balance often is not taken into account during the acid-base assessment. The main goal of the first study was to compare the traditional and the quantitative approaches for the assessment of acid-base imbalances in hypoalbuminemic dogs. This study was designed as a prospective observational clinical study and included the evaluation of 105 critically ill patients and 135 healthy patients as controls. Jugular venous-blood samples were collected from each patient on admission to determine: TP, Alb , BUN, Glu , hematocrit, , Na+ , Cl- , K +, Pi , pH , pCO2 , HCO3 - , AG, AGalb and /or AGalb-phos, SBE, SID, Atot , and SIG. Patients were divided into two groups according to the severity of hypoalbuminemia: mild hypoalbuminemia (Alb = 2.1 to 2.5 g /dL) and severe hypoalbuminemia (Alb ≤ 2.0 g/dL). According to the HH approach most frequent imbalances were simple disorders (51.4 %) mainly metabolic acidosis (84.7%), in most cases associated to a high AG acidosis. However, when using the quantitative method 58.1% were complex disorders, and SIG acidosis (74.3 %) and Atot alkalosis (33.3 %) were the most frequent acid -base imbalances. The second study allowed us to conclude that the agreement between the traditional and quantitative methods of interpretation of acid-base balance was poor, and many imbalances were detected using the quantitative approach but would remain undetected using the traditional approach to acid-base status. Moreover, these alterations were different according to the severity of hypoalbuminemia and characteristics of the disease in each hypoalbuminemic patient, especially in SIRS/septic patients. In humans, SIRS is relatively frequent condition and is associated with high mortality rates. However, data on the incidence of SIRS and the usefulness of biomarkers in veterinary medicine is scarce. The main goal of the second study was to determine the diagnostic and prognostic value of plasma iron vs the inflammatory markers albumin, CRP and fibrinogen on admission and over the ICU stay of dogs with SIRS. This study was designed as prospective observational study and included 116 client-owned dogs: 54 dogs with SIRS/sepsis, 42 with local inflammation and 20 clinically healthy dogs as a control group. Blood samples were taken on admission in all study groups, and then on alternate days until discharge or death in both inflammation groups. On admission, dogs with SIRS had significantly lower plasma iron (65 ± 5.8 µg/dL, p=0.001) concentrations than dogs with local inflammation (89.5 ± 6.2 µg/dL, p=0.001). Plasma iron, albumin, and CRP were able to separate dogs in the SIRS/sepsis group from those presenting local inflammation with AUCs for the ROCs curves of 0.679, 0.834, and 0.704 respectively. The admission values for these variables did not separate survivors and non survivors within the SIRS/sepsis group. However, the increase in iron and the decrease in CRP, from admission to discharge, was higher in survivors than in non-survivors within the SIRS/septic group (22.8 vs. 2.51 μg/dL respectively, p = 0.021 for iron; -67.1 vs. -4.1 mg/L respectively, p = 0.002 for CRP), resulting in discharge iron and CRP concentrations for survivors similar to those in the local inflammation group. The second study allowed us to conclude that hypoferremia is a sensitive marker of systemic inflammation in dogs. In this study, the increase in iron concentrations during the hospitalization period of SIRS/septic dogs was associated to a better prognosis, suggesting that plasma iron in combination with other biomarkers of inflammation such as CRP and albumin might be used to monitor the inflammatory process.

El presente estudio tiene como objetivo determinar la prevalencia e identificar las especies implicadas en los procesos parasitarios del ganado ovino en la Región de Murcia. Para ello, se han examinado 181 ovejas adultas de raza Segureña procedentes de las seis comarcas en que se divide la Región. De cada animal se recogió la cabeza, el sistema digestivo y el cardio-respiratorio para su examen. Asimismo, se tomó una muestra de heces del recto que fue analizada mediante las técnicas de concentración por flotación, concentración por sedimentación y migración larvaria. Todos los animales albergaban una o más especies parásitas, siendo los ovinos del Altiplano y el Noroeste, los de prevalencias más elevadas. Los parásitos encontrados, fueron: Oestrus ovis (38,1%), nematodos broncopulmonares (72,4%), metacestodos (9,9%), nematodos gastrointestinales (91,7%) y trematodos hepáticos (32%). Entre los nematodos broncopulmonares, la especie más prevalente fue Cystocaulus ocreatus (67,7% ) y entre los gastrointestinales destacó Teladorsagia circumcincta (81%). / The aim of this study is to determine the prevalence and to identify the parasitic species affecting sheep in Murcia Region. We examined 181 adult Segureña sheep coming from different areas of Murcia. The head, digestive tract and cardio-respiratory system were removed from every animal for their exam. Also, a faecal sample collected from the rectum of each animal was analysed using the three main coprological techniques (floatation, sedimentation and larval migration). The whole sheep population analysed was parasited by one or more species, being the most affected ones those coming from the Altiplano and Noroeste regions. The found parasites were: Oestrus ovis (38,1%), (72,4%), larval cestodes (9,9%), gastrointestinal nematodes (91,7%) and hepatic trematodes (32%). Within lungworm, the most prevalent species was Cystocaulus ocreatus (67,7%), whereas Teladorsagia circumcincta (81%) highlighted within gastrointestinal nematodes.

El buen funcionamiento de una explotación porcina depende, en parte, de un buen control reproductivo dentro de la misma. Para ello es fundamental disponer de un semen de buena calidad. Sin embargo, esta calidad no se mantiene siempre constante. Existen numerosos factores que pueden influenciar la calidad de un eyaculado. Estos factores pueden clasificarse en factores intrínsecos al animal y factores extrínsecos. Uno de los factores extrínsecos más característicos es el fotoperíodo. El fotoperíodo es un factor muy controvertido en la especie porcina. El estudio de su efecto sobre la reproducción se ha centrado, en gran parte, en la valoración de los cambios producidos en los niveles séricos de diversas hormonas sexuales, como FSH, LH y testosterona. Sin embargo, estos resultados difieren mucho entre autores. Los objetivos de este estudio fueron evaluar el efecto de la luz natural y de dos regímenes lumínicos artificiales sobre la calidad seminal del verraco. Las muestras de semen se obtuvieron de un total de 30 verracos. De éstos, 14 estaban sometidos a un régimen de luz natural y 16 a un régimen de luz artificial. Los verracos del grupo de luz natural fueron sometidos, durante la primera mitad del estudio, a un fotoperíodo creciente y a un fotoperíodo decreciente durante la segunda. Los verracos del grupo de luz fueron sometidos, durante la primera mitad del estudio, a un total de 9 horas de luz diarias y en la segunda mitad a un total de 16 horas de luz diarias. El resto de condiciones de estabulación se mantuvieron constantes durante todo el estudio para todos los animales.La calidad seminal se evaluó mediante determinación de los porcentajes de viabilidad, estado de los acrosomas y anomalías morfológicas, test de resistencia osmótica, ritmo de producción de L-lactato y motilidad. La calidad seminal se determinó con el semen fresco diluido y con el mismo semen conservado durante 72 horas a 16 ºC.En el análisis de resultados se observaron pocas diferencias significativas entre los diferentes tratamientos lumínicos. Las diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) se observaron, casi exclusivamente, en los porcentajes de distribución de las subpoblaciones espermáticas. La mayoría de parámetros analizados no presentaron diferencias significativas. Tampoco se observaron diferencias significativas entre semen fresco diluido y semen conservado, excepto en los porcentajes de distribución de las subpoblaciones.Históricamente, el fotoperíodo se ha considerado un factor modulador de la función reproductora. Sin embargo, nuestros resultados indican que éste no es el caso en la especie porcina. El parámetro que más se vio afectado fue el porcentaje de distribución subpoblacional. Estas variaciones observadas en los porcentajes de distribución subpoblacional podrían deberse, por un lado, a un efecto de la luz sobre el epidídimo y, por otro, a un efecto de la luz sobre el testículo. Las variaciones lumínicas producirían alteraciones en la secreción de testosterona que provocarían cambios en el proceso de maduración y/o espermatogénesis. Sin embargo, es importante recordar que los cambios observados son pocos y de aparente poca relevancia. Así, podríamos afirmar que nuestros resultados no justifican, de ningún modo, cambios en el sistema de iluminación de las naves, dado que la luz no parece ejercer un efecto relevante sobre la calidad seminal del verraco. / The smooth running of a pig keeping depends, partly, on a good reproductive control. Thus, a good seminal quality is essential. However, this quality doesn't remain constant all the time. There are several factors which can influence the quality of ejaculate, and which can be classified in intrinsic and extrinsic to animal. One of the most characteristic extrinsic factors is photoperiod. Photoperiod is a very controversial factor in porcine species. The effect of photoperiod on porcine reproduction has resulted, mainly, in serum level changes on hormones like FSH, LH and testosterone. However, these results differ among authors.The aims of this study were to evaluate the effect of natural light and two artificial light patterns on boar semen quality. The samples were obtained from 30 boars. Fourteen of them were exposed to natural light, and the other sixteen to artificial light. The natural light group was exposed to an increasing light pattern during the first 6 months of the study, and to a decreasing light pattern during the last 6 months. The artificial light group was exposed to 9 hours of light daily during the first 6 months of the study, and to 16 hours during the last 6 months. Experimental conditions other than photoperiod were the same for all the animals during the whole of the study.Seminal quality was evaluated by determining viability, acrosome status and morphologic abnormalities percentages, osmotic resistance test, L-lactate rate rhythm and motility. Seminal quality was determined with both fresh diluted semen and the same samples refrigerated during 72 hours at 16ºC.Not many differences were observed among light patterns when analysing the results. Statistical differences (P<0.05) were observed, almost exclusively, in subpopulations distribution percentages. Most of the analysed parameters did not present statistical differences. No statistical differences between fresh diluted and refrigerated semen were observed either.Historically, photoperiod has been considered a modulator factor of reproductive function. However, our results indicate this is not the case in porcine species. The most affected parameter was the percentage of subpopulations distribution. The changes observed in subpopulations distribution percentages can be due, on the one hand, to an effect of the light on the epididymis and, on the other hand, to an effect of the light on the testis. Variations in light would produce changes in testosterone secretion which would produce changes in the maturation and/or spermatogenesis process. However, it is important to remember that the observed changes are not outstanding. So, we could affirm that our results do not justify changes in the lightning system in the farms, because light does not affect seminal quality in boars.

Tesis por compendio de publicaciones / La industria porcina tiene un considerable interés en el uso de la transferencia de embriones, incluyendo la criopreservación de los mismos. Sin embargo, la utilización comercial de la transferencia de embriones en esta especie ha sido muy limitada debido principalmente a la necesidad de utilizar procedimientos quirúrgicos para la obtención y transferencia de los embriones, y a las dificultades encontradas para la criopreservación de dichos embriones mediante los protocolos tradicionales. Últimamente, se han abierto nuevas expectativas para la utilización comercial de esta tecnología gracias al desarrollo de un procedimiento para transferir embriones por vía no quirúrgica y al desarrollo de la vitrificación como método alternativo a los procedimientos tradicionales de criopreservación. El objetivo de esta tesis es mejorar la transferencia vía no quirúrgica de embriones vitrificados-calentados y, desarrollar un protocolo de vitrificación eficiente para los estadios tempranos de desarrollo de embriones porcinos obtenidos, pudiendo aumentar su viabilidad post-calentamiento. / The swine industry has a considerable interest for the use of embryo transfer and cryopreservation since these technologies may allow the transport and storage of valuable genetic material with minimal health risks and cost. However, the commercial application of embryo transfer in pig has been traditionally limited due to the need of surgical transfer procedures and the difficulties for long-term storage of pig embryos by using traditional cryopreservation methods. However, new perspectives for embryo transfer and embryo cryopreservation have occurred with the development of a new device, for non-surgical embryo transfer and with the development of vitrification as an alternative to traditional cryopreservation methods. This thesis was designed to improve the non-surgical deep intrauterine embryo transfer procedure with vitrified embryos and develop an efficient and practical vitrification protocol for porcine embryos at very early developmental stages.

La inmunomodulación se define como la modificación de la respuesta inmune por medio de la administración de sustancias que poseen la capacidad de regular el sistema inmunitario. INMD es un inmunomodulador compuesto por una combinación de LPS detoxificado de E. coli y células inactivadas de Propionibacterium granulosum, que ha demostrado tener un efecto modulador sobre el sistema inmune del cerdo. En el presente trabajo hemos realizado diversos ensayos in vitro e in vivo con el objetivo de evaluar los efectos que produce este compuesto sobre el sistema inmune del porcino.Se realizaron ensayos in vitro para determinar la acción de INMD o sus componentes por separado sobre la producción o expresión de citoquinas en macrófagos alveolares y células mononucleares de sangre periférica, la activación de la fagocitosis en neutrófilos polimorfonucleares, la activación de linfocitos a través del estudio del receptor para IL-2 (CD25) y la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad tipo-II (MHC-II) en macrófagos alveolares. Observamos que los macrófagos alveolares expresaron IL-1, IL6, IL-12 y produjeron TNF-a, pero no se detectó IL-10, mientras las células mononucleares de sangre periférica expresaron IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 y produjeron INF-g. En la fagocitosis, observamos incremento del número de células que se activaron y fagocitaron. Este efecto estuvo correlacionado con P. granulosum. Observamos que INMD y sus componentes por separado indujeron la expresión de MHC-II en macrófagos alveolares, tanto en aquellos infectados con el virus de la enfermedad de Aujeszky como en las células que no infectadas. Para CD25, observamos que INMD y sus componentes por separado fueron capaces de inducir la expresión de esta molécula que nos indica que se produjo la activación de las células mononucleares de sangre periférica. En este caso, la máxima expresión de CD25 se observó con INMD tanto en células infectadas con el virus de la enfermedad de Aujeszky como en aquellas no infectadas.Se realizaron dos pruebas in vivo. En la primera de ellas se evaluó el efecto de la administración de INMD utilizado como coadyuvante a la vacunación contra el virus de la enfermedad de Aujeszky. Se utilizaron 85 cerdos convencionales divididos en dos grupos (grupo A= 43 y grupo B= 42), que fueron vacunados dos veces contra el virus de la enfermedad de Aujeszky. El grupo B recibió simultáneamente con la primera dosis vacunal, una dosis intramuscular de INMD (20 mg/ml de LPS y 250 mg/ml de P. granulosum). Se realizaron tres sangrados, antes de la primera vacunación y la revacunación, y cinco semanas posteriores a esta. Los sueros se analizaron para anticuerpos frente a gE y gB del virus de la enfermedad de Aujeszky, inmunoglobulinas totales (IgG1, IgG2), inmunoglobulinas especificas (IgA, IgG1, IgG2) para el virus de la enfermedad de Aujeszky, linfoproliferación y títulos neutralizantes frente al virus de la enfermedad de Aujeszky. Al inicio del estudio, el 97,6% de los animales del grupo A y 100% del grupo B, presentaban anticuerpos frente gB, mientras que el 11,6% y 19% de los animales de los grupo A y B, respectivamente, presentaban anticuerpos frente a gE, todos de origen maternal. Al final del ensayo, el 96,4% de los cerdos del grupo A y el 87,1% del grupo B eran gB+ y ninguno presentó anticuerpos frente a gE. Tras la primera vacunación y la aplicación de INMD, los animales del grupo B presentaron niveles totales de IgG1 e IgG2 superiores que los animales del grupo A (p<0,01), diferencias que desaparecieron tras la revacunación. Si bien entre estos isotipos se observó la misma tendencia en los anticuerpos específicos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky, esta diferencia no fue significativa. Con relación a las IgA, se observó que tras la revacunación el 38,48% de los animales del grupo B presentaban títulos £1:40, mientras que en el grupo A se observaron estos títulos en el 14,81% de los cerdos (p<0,01). En los ensayos de linfoproliferación no se observaron diferencias significativas entre grupos. En cuanto a los títulos de anticuerpos neutralizantes, se observó una respuesta humoral primaria superior en el grupo B con respecto al grupo A (p<0,005), diferencia que desapareció tras la revacunación. Así mismo, en la respuesta primaria el 56,7% de los cerdos del grupo A presentaban títulos £1:4, mientras que entre el grupo B el 25,6% de los animales presentaban este comportamiento (p<0,05). En un segundo ensayo realizado in vivo, se evaluaron los efectos adversos que pudieran ocasionar la aplicación de INMD a una dosis superior a la recomendada. Se utilizaron ocho cerdos de alta sanidad que se dividieron en tres grupos: Grupo A: INMD (1,2 mg/kg P.V. de LPS y 16 mg/kg P.V. de P. granulosum), Grupo B: INMD (2,6 mg/kg P.V. de LPS y 33 mg/kg P.V. de P. granulosum), Grupo C: solución salina estéril. A los tiempos 0, 1, 2, 4, 6 y 24 horas se realizó el sangrado, para determinar los niveles de TNF-a, la medición de la temperatura corporal y evaluación clínica Ninguno de los animales presentó signos clínicos relacionados con la aplicación de LPS y la liberación de niveles altos de citoquinas.De estos resultados podemos concluir que INMD ejerce su acción sobre el sistema inmunitario induciendo la expresión de citoquinas, incrementando la capacidad fagocítica de los PMN y estimulando la expresión de MHC-II y CD25. Estos efectos pueden contribuir sustancialmente al mejoramiento del proceso de respuesta inmune del cerdo en enfermedades y vacunaciones. / Immunomodulation is defined as the modification of the immune response by means of the administration of substances that possess the ability to regulate the immune system. INMD is an immunomodulator composed by a combination of a detoxified LPS of E. coli and inactivated cells of Propionibacterium granulosum that has demonstrated to have a modulatory effect on the immune system of the pig. In the present study we have done several in vitro and in vivo assays with the objective of evaluate the effects that this compound produces in some components of the immune system in pigs. In vitro assays were made to determine the action of INMD and their components on the cytokine production or expression in alveolar macrophages and peripheral blood mononuclear cells, the activation of phagocytosis in polymorphonuclear neutrophiles, the activation of lymphocytes through the study of the IL- 2 receptor (CD25) and the expression of the major histocompatibility complex class-II (MHC-II) in alveolar macrophages. Regarding the cytokine expression, it could be observed that alveolar macrophages expressed IL-1, IL-6, IL-12 and produced TNF-a, but not IL-10, while the peripheral blood mononuclear cells expressed IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 and produced INF-g in response to INMD stimulation.When the effect of INMD on the phagocytosis exerted by PMN was studied, we observed that the phagocytosis capability of these cells increased. This phenomenon was attributable more to an increase in the number of activated cells than to an increase of individual phagocytic ability. This effect was correlated with P. granulosum. Likewise, we observed that INMD and its separated components induced the expression of MHC-II in alveolar macrophages. Thus as well in cells infected with Aujeszky's disease virus as in those that were not. Regarding CD25, we observed that INMD and its components by themselves alone were able to induce the expression of this molecule, a fact indicates the activation of the peripheral blood mononuclear cells. In this case, the maximum expression of CD25 was observed with INMD both in Aujeszky's disease virus infected cells as well as in uninfected ones.Two in vivo experiments were made. The first one of them the effect of the administration of INMD was evaluated using this product as a coadjuvant to the vaccination against the Aujeszky's disease virus. With this purpose, eighty-five 8-10-weeks-old crossbred conventional pigs were randomly distributed in two groups (group A = 43 and group B = 42), that were vaccinated two times against the Aujeszky's disease virus. Group B animals received simultaneously with the first vaccine dose, an intramuscular dose of INMD equal to 20 mg/ml of LPS and 250 mg/ml of P. granulosum. Blood was collected from all 85 animals before the first vaccination, before the booster and five weeks after the booster. Sera were analysed to determine the presence of Aujeszky's disease virus anti-gE and anti-gB antibodies, total immunoglobulin load (IgG1, IgG2) and Aujeszky's disease virus specific immunoglobulins (IgA, IgG1, IgG2). Lymphoproliferation assays and virus seroneutralization test for Aujeszky's disease virus were also done. Before the first vaccination, 97.6% of pigs in group A and 100% in group B presented anti-gB antibodies, while 11.6% and 19% were seropositive against gE respectively. At the end of the trial, 96.4 % of group A pigs and 87.1% of the animal in group B were gB+ and none of them had anti-gE antibodies. Regarding levels of total immnunoglobulins, after the first vaccination group B pigs had higher levels of IgG1 and IgG2 (p<0,01) but these differences disappeared after the second vaccination. When evaluated Aujeszky's disease virus specific antibodies, were not different between groups, except for IgA. In this case, we observed that after the revaccination, 38.48% of animals in group B presented titres £1:40, while in group A this was observed in the 14.81% of the pigs (p<0.01). In lymphoproliferation assays, significant differences between groups were not observed. Regarding the virus-neutralizing antibodies, we observed higher titres in the group B animals after de first vaccination (p<0.005), differences that disappeared after the booster. Thus after the first vaccination, 56.7% of pigs in group A had titres £1:4, while thus was observed only in 25.6% of the animals in group B (p<0.05). In a second in vivo assay, the adverse effects that could cause the application of INMD were evaluated. With this aim, eight pigs were distributed in three groups. Animals of group A were injected intramuscularly with a dose of INMD corresponding to 1.2 mg/kg of body weight of LPS and 16 mg/ml of body weight of P. granulosum, while those in group B received 2.6 mg/kg of body weight of LPS and 33 mg/kg of body weight of P. granulosum. Animals in group C received similar volume of sterile saline solution. All the animals were bled to determine the levels of TNF-a to the 0, 1, 2, 4, 6 and 24 hours, taking in each one of these times the body temperature. None of the animals had evident adverse effects for LPS or produced by high levels of cytokine. From those results it could conclude that INMD exerts its action on the immune system at least indicating cytokine expression, enhancing phagocytosis capabilities of PMNS and enhancing also the expression on MHC-II and CD25. These effects can contribute substantially improvement of the immune response of pigs in disease state or in vaccination.