Snail és un factor de transcripció del tipus dit de zinc essencial en la transició epiteli mesènquima (EMT), on la seva funció més ben caracteritzada és com a repressor de l'expressió de l'E-Cadherina. Aquesta tesi doctoral es centrà en l'estudi funcional d'Snail en aquelles línies cel·lulars on hi havia una coexpressió de totes dues proteïnes.En aquest treball es descriu com l'activitat transcripcional d'Snail és regulada per la fosforilació d'un domini ric en serines adjacent a una seqüència d'export nuclear. Aquesta fosforilació, regulada per les unions a la matriu extracel·lular, permet un canvi conformacional d'Snail que afavoreix el seu export nuclear i en conseqüència la pèrdua de la seva capacitat transcripcional. A més a més es mostra com Snail pot ser fosforilat in vitro per les quinases CK2 i GSK3?, on la fosforilació de la primera afavoreix la de la segona. D'altra banda es descriu com Snail pot ser degradat al nucli pel sistema del proteasoma, la regió responsable d'aquesta i com Akt és capaç de promoure-la. A més a més es mostra com Snail pot ser fosforilat in vitro per les quinases CK2 i GSK3?, on la fosforilació de la primera afavoreix la de la segona. D'altra banda es descriu com Snail pot ser degradat al nucli pel sistema del proteasoma, la regió responsable d'aquesta i com Akt és capaç de promoure-la. / Snail is a zinc finger transcription factor essential during the epithelyal-mesenchymal transition (EMT), where it acts as an E-Cadherin repressor, its best characterized function. This doctoral thesis is focused on the functional study of Snail on those cell lines co-expressing Snail and E-cadherin.In this work we describe how the transcriptional activity of Snail is regulated by phosphorylation on a serine rich domain adjacent to a nuclear export sequence (NES). This phosphorylation, regulated by the extracellular matrix unions, causes a conformational change of Snail, that allows its nuclear export and, in consequence, inhibits its transcriptional activity. Snail is phosphorylated in vitro by two kinases, CK2 and GSK3?.It is also shown how Snail can be degraded in the nucleus by the proteasome system, which region is implicated and how Akt can stimulate it.

El enzima hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa) es el principal enzima regulador de la vía de síntesis del colesterol. Al igual que otros muchos enzimas, éste intercambia sus estados inactivo o activo por fosforilación / desfosforilación reversible, dependiendo su nivel de actividad del grado de fosforilación. En estudios "in vitro" se ha demostrado que en el mecanismo de fosforilación reversible intervienen HMG-CoA reductasa quinasas y HMG-CoA reductasa fosfatasas, tanto de origen microsomal como citosólico.Nuestro objetivo ha sido profundizar en la caracterización y purificación de las protein fosfatasas localizadas en microsomas de hígado de rata, en especial la actividad fosfatasa, que a lo largo de este trabajo denominaremos HMG-CoA reductasa fosfatasa M, ya que presenta un comportamiento cromatográfico que la diferencia de otras protein fosfatasas descritas.Los resultados obtenidos en el subfraccionamiento celular, en el fraccionamiento cromatográfico y la caracterización enzimática de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa apoyan las siguientes conclusiones:1.- El estado nutricional de las ratas no modifica la actividad total HMG-CoA reductasa fosfatasa presente en el sobrenadante postrnitocondrial de hígado. La actividad no se ve modificada por ayuno prolongado ni por la administración de glucagon.2.- El tratamiento con glucagon determina la redistribución de la actividad, la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa asociada a microsomas disminuye significativamente.3.- El subfraccionamiento por centrifugación a 100.000 xg del sobrenadante postmitocondrial, obtenido de ratas alimentas, provoca la precipitación de una parte (aproximadamente el 15%) de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa inicial. Esta actividad se distribuye a partes iguales entre microsomas y precipitado de glucógeno.4.- La actividad presente en microsomas no se debe a contaminación por proteínas de origen citosólicas.5.- La actividad presente es microsomas no se debe a contaminación por proteínas procedentes del precipitado glucógeno-proteico ya que: a) tiene afinidad por el glucógeno; b) las pautas de solubilización son distintas para microsomas y glucógeno; c) cuando se intenta la purificación de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa a partir de glucógeno siguiendo la misma metodología que la empleada para la HMG-CoA reductasa fosfatasa M se pone de manifiesto un comportamiento cromatográfico diferenciador entre las muestras procedentes de glucógeno y las de microsomas.6.- La distribución de PrP sobre sustrato HMG-CoA reductasa, tras la centrifugación en un gradiente de sacarosa permite concluir que existe una actividad localizada en rnicrosomas.7.- La actividad presente en microsomas puede solubilizarse con tratamientos suaves (detergentes no aniónicos a baja concentración o tratamiento con sales a baja molaridad) sin que queden cantidades significativas en el precipitado final, lo que indica que la proteína responsable de la actividad fosfatasa no es una proteína intrínseca de membrana.8.- En microsomas están presentes tres actividades proteína fosfatasa sobre sustrato HMG-CoA reductasa: PrP 1, PrP 2A y PrP 2C. No se detecta actividad PrP 2B en microsomas.9.- Se purifica la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M a partir de microsomas solubilizados con detergente. La preparación final presenta un peso molecular aparente de 85 kDa en gel filtración.10.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M en presencia de 0.5 M KCl se disocia produciendo dos subunidades: una con actividad catalítica que presenta un peso molecular de aproximadamente 55 kDa, tanto en gel filtración como en geles de acrilamida/SDS y otra de menor peso molecular que es la subunidad de anclaje al retículo endoplasmático.11.- El enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M no es específico para el sustrato HMG-CoA reductasa. De forma inversa el sustrato HMG-CoA reductasa puede ser desfosforilado por las cuatro serin protein fosfatasas hasta ahora descritas: PrP 1, 2A, 28 y 2C.12.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M se clasifica como PrP 1, al ser inhibida por el inhibidor 2 y al mismo tiempo no ser activable por protamina. Son necesarias para su inhibición mayores concentraciones que las descritas para la PrP 1 citosólica.13.- La rotura del holoenzima de 85 kDa, o de la subunidad de 55 kDa, por precipitación con acetona o por proteolísis controlada con tripsina, provoca la aparición de una actividad protein fosfatasa de peso molecular en cromatografía de gel filtración de 35-37 kDa.14.- La obtención del fragmento de 35-37 kDa conlleva en todas las ocasiones pérdida de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa que no se recupera por tratamientos posteriores.15.- Vistas las conclusiones anteriores, el enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M, purificado y parcialmente caracterizado a partir de microsomas de hígado de rata, tiene un comportamiento que lo distingue de otras PrP descritas. Es de origen microsomal y no se debe a contaminación por glucógeno o citesol. Está constituido por una subunidad de anclaje y otra con actividad catalítica. En su constitución no interviene el modulador o inhibidor 2 si bien lo reconoce y es inhibida por él. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase (E.C. 1.1.1.34) the main rate limiting enzyme for synthesis of cholesterol and isoprenoids, has been shown to be regulated by covalent modification. AMP-activated reductase kinasa inactivates and phosporylates HMG-CoA reductase. Inactivated, homogeneous P-labelled HMG-CoA reductase is reactivated in vitro by rat liver protein phospatases with a concomitant release of P bound to serin residues. HMG-CoA reductase phosphatise activity present in the post-mithocondrial supernatant partially sedimented (13%) into the particulate fraction upon centrifugation at high speed. The sedimented activity was distributed in a similargrade level between the microsomal membranes (7%) and the gIycogen pellet (6%). The phosphatase activity associated to the endoplasmic reticulum was not due to glycogen contamination. The whole HMG-CoA reductase phospatase activity present in microsomal membranes can be isolated with either 0,1% Triton X-100 or 0.5 M KCI of which it is concluded that this activity is not associated to membrane as a integral protein. By using standard enzymatic methods can be characterized three protein phosphatase activities in the detergent solubilized microsomal membranes: type 1, 2A and 2C, but not type 2B. The purified protein HMG-CoA reductase phosphatase microsomal PrP-M characterized as type 1 requires higher concentrations of inhibitor-2 than the rabbit muscle cytosolic type 1 protein phosphatase. PrPn was not affected by the protein inhibitor that inhibits PrP type 2A activity when HMG-CoA reductase is the substrate. A model of the microsolnal PrP type-1 is presented, deduced by the molecular masses observed after solubilization either by Triton X-100 or 0.5 M KCI, and by the trypsin treatment.

La síntesi de colesterol es veu regulada principalment per l'enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzim A reductasa o HMG-CoA reductasa. L'HMG-CoA reductasa està sotmesa a nombrosos mecanismes que li'n regulen tant la quantitat com l'activitat. Aquests mecanismes es classifiquen en dos grups, els que actuen a llarg plaç regulant fonamentalment la quantitat de l'enzim i actuant a nivell de la síntesi i degradació d'aquest, i els que actuen a curt plaç controlant-ne l'activitat. El segon tipus de regulació a curt plaç es du a terme principalment a través d'un mecanisme de fosforilació i desfosforilació reversible.En l'esquema de regulació de l'HMG-CoA reductasa de molts altres sistemes interconvertibles per fosforilació, cada proteïna fosfatases en la regulació del sistema subjecte a vegada més, es dona una major importància al paper de les proteïna fosfatases en la regulación del sistema subjecte a interconversió. Aquest fet condueix al plantejament de l'existència d'altres proteïnes, com ho són les proteïnes inhibidores que regulen, a la vegada, l'actuació de les proteïna fosfatases.L'objectiu principal d'aquesta Memòria fou, per tant, aprofundir en el conêixement del control del procés d'activació per fosforilació covalent de l'HMG-CoA reductasa, mitjançant l'estudi dels Inhibidors de proteïna fosfatases.Des de l'any 1976, es coneix l'existència de dues proteïnes Inhibidores de fosfatasa tipus 1, l'inhibidor 1 i l'inhibidor 2. Tots aquests estudis han estat realitzats fonamentalment sobre el sistema fosforilasa fosfatasa, per tant ens plantejarem fer un estudi d'aquests inhibidors en el sistema reductasa fosfatasa ja que l'HMG-CoA reductasa és també un enzim regulable per un procés de fosforilació reversible.EIs resultats obtinguts d'aquest estudi demostren l'existència de dos inhibidors de proteïna fosfatases emprant HMG-CoA reductasa com a substrat. El primer d'ells, que inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 1, ha estat purificat a homogeneïtat a partir de citosol de fetge de rata. Aquest inhibidor te un pes molecular aparent d3 45 Kd determinat per filtració molecular en gel de 31 Kd determinat per electroforesi en gel d'acrilamida-SOS.L'estudl previ de la distrlbució subcel.lular d'aquest inhibidor de la fosfatasa tipus 1 i substrat HMG-CoA reductasa mostrà que el 90% de l'activitat inhibitòria total està localitzada en la fracció citosòlica. Aquest inhibidor presenta una gran reSsistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol. L'inhibidor de la fosfatasa 1 inhibeix a la fosfatasa de tipus 1 a concentracions nanomolars, mentre que inhibeix a la fosfatasa 2A a concentracions micromolars, tant si el substrat emprat és I'HMG-CoA reductasa com si es tracta de la glicogen fosforilasa. Aquest comportament cinètic és similar al que presenta l'inhibidor-2 de múscul esquelètic de conill.L'inhibidor de la fosfatasa 1 és capaç de formar complexes inactius d'alt pes molecular de fosfatasa tipus 1. Aquests complexes són reactivables quan se'ls incuba en presència de GSK-3 i ATP-Mg. Aquest inhibidor és fosforilable per acció de la proteïna quinasa dependent d'AMP cíclic i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+ i per l'acció de la GSK-3 i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+.L'anàlisi del conjunt de resultats indica l'existència d'una gran similitud en el comportament cromatogràfic, electroforètic, cinètic, etc. entre l'inhibidor de la fosfatasa 1 I l'inhibldor-2 ja descrit de múscul esquelètic de conill, i ens permet afirmar que ambdos inhibidors són similars.El segon inhibidor purificat a homogenertat a partir de fetge de rata inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 2A i presenta un pes molecular aparent de 30 Kd quan es determina per filtració en gel i de 20 Kd quan es determina per electroforesi en gel d'acrilamida-SDS.L'activitat inhibitòria sobre la fosfatasa tipus 2A està localitzada en la fracció citosòlica i presenta també una gran resistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol.Aquest inhibidor inhibeix la fosfatasa 2A a concentracions nanomolars, mentre que no inhibeix la fosfatasa de tipus 1, quan el substrat emprat és l'HMG-CoA reductasa. Si el substrat és la glicogen fosforilasa cap d'ambdues activitats fosfatàsiques es veuen inhibides.L'inhibidor da la fosfatasa tipus 2A no és fosforilable ní per GSK-3 ni per la quinasa dependent d'AMP cíclic. L'anàiisi del conjunt de resultats indica que l'inhibidor de la fosfatasa 2A és un inhibidor especlfic de l'activitat reductasa fosfatasa no descrit fins ara. / A protein inhibitor of HMG-CoA reductase phosphatise 1 activity was purified to homogeneity from rat liver. The purified protein has a molecular mass of 31 kDa. This spontaneously active protein is thermostable and acid resistant. The protein inhibitor is phosphorylated by glycogen synthase kinase-3 and cAMP-dependent protein kinase without change in its inhibitory activity. The inhibition caused by this inhibitor on phosphatase and 2A is similar to that of inhibitor-2 from rabbit skeletal muscle using hydroxymethylglutaryl-CoA reductase as substrate.Another heat-stable protein inhibitor of the hydroxymethylt-glutaryl CoA reductase phosphatase 2A activity has been identified and purified to homogeneity. The apparent molecular mass was 20,000 Da. The protein lost its inhibitory properties when incubated with trypsin or treated with ethanol. The inhibitor protein does not inhibit type 1 phosphatase when either phosphorylase or hydroxymethylglutaryl-CoA reductase is the substrate but not when phosphorylase A is the substrate. In contrast, this protein inhibitor inhibits the rat liver type 2A phosphatase activity when hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase activity but also by the absence of (32)p release from (32)p- labeled hydroxymethylglutaryl-CoA reductase. The inhibition on the phosphatase activity is shown not only by the modified hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase. The inhibitor protein is not activated by incubation with ATP and cAMP-dependent protein kinase and it is not phosphorylated by glycogen synthase kinase-3. These results, together with those of the kinetic experiments, suggest that the reductase phosphatise inhibitor is distinct from protein phosphatase inhibitor-1 and inhibitor-2.

El receptor linfocitario CD5 es una glicoproteína monomérica de membrana de 67KDa. Funcionalmente, es una molécula accesoria, implicada en la modulación de los procesos de activación y diferenciación mediados por el receptor antigénico en células T y B. Su región citoplasmática no contiene ninguna actividad catalítica intrínseca, pero en cambio presenta diversos motivos potenciales de fosforilación para serin/treonin y tirosincinasas, y otros motivos estructurales compatibles con una función señalizadora intracelular. Se ha demostrado que esta región se encuentra constitutivamente fosforilada por CKII en las serinas carboxiterminales S458, S459 y S461, y es rápidamente hiperfosforilada en residuos serina, treonina y/o tirosina tras la activación linfocitaria inducida por agentes tales como PMA, anti-CD3, o anti-CD5 mAbs. Creemos que los ciclos de fosforilación-defosforilación podrían estar implicados en la regulación de la actividad y la función de CD5. De acuerdo con esta hipótesis nos planteamos el estudio de los mecanismos de fosforilación implicados en la señalización intracelular de CD5:- Mediante la técnica del yeast two-hybrid y ensayos de co-precipitación, demostramos la existencia de una interacción específica entre la subunidad reguladora ? de CKII y la región C-terminal de CD5 donde se localizan las serinas antes mencionadas. - Utilizando PMA como estímulo, identificamos dos residuos treonina (T410 y T412) como responsables de la fosforilación in vivo de CD5 por la serin/treonincinasa PKC. Estudios funcionales posteriores demostraron que la integridad de T410 y T412 es crítica para la activación mediada por CD5 de la fosfolipasa C específica de fosfatidilcolina (PC-PLC) y para la inhibición por ésteres de forbol de la internalización de CD5 mediada por anticuerpo. - Tras la estimulación con mAb anti-CD3 o pervanadato, los residuos Y429 e Y463, y no Y378 e Y463, son dianas únicas para tirosinacinasas. Se obtuvieron los mismos resultados en ensayos de fosforilación in vitro utilizando productos recombinantes purificados de las tirosincinasas Lck y Fyn. El análisis de células Jurkat deficientes en Lck y CD3 demostró además que la tirosinfosforilación de CD5 requiere la actividad Lck. - Demostramos la fosforilación y posterior asociación de las proteínas adaptadoras c-Cbl y LAT a Grb2 vía CD5. Los niveles de fosforilación de c-Cbl vía CD5 son similares a los inducidos vía CD3 y no se afectan por la deleción de 2/3 C-terminales de la región citoplasmática de CD5. Por el contrario, la fosforilación de LAT (36-38 kDa) vía CD5 es muy débil comparada con la inducida vía CD3. - Demostramos que la asociación de una actividad serin/treonincinasa, anteriormente identificada en los inmunoprecipitados de CD5 es específica y se localiza en su región citoplasmática proximal a la membrana. Además, demostramos que los sitios diana para la cinasa se encuentran en esta región, así como a lo largo de toda la cola citoplasmática.En conclusión, CD5 tiene una región citoplasmática adaptada para transducir señales intracelulares y nuestros resultados demuestran que los procesos de fosforilación juegan un papel muy relevante en ello.1. La asociación de CKII? a CD5 apoya la fosforilación constitutiva de CD5 por esta cinasa, la cual es necesaria para la activación de la cascada enzimática PC-PLC/A-SMasa.2. La fosforilación inducible de CD5 por PKC sobre los residuos T410 y T412 es crítica para la regulación de aspectos funcionales de la molécula, como la activación de la cascada enzimática PC-PLC/A-SMasa y la internalización de la molécula. 3. La fosforilación inducible de CD5 por PTK únicamente sobre las tirosinas Y429 e Y463, invalida la funcionalidad de los motivos ITAM-like e ITIM-like presentes en CD5.4. CD5 activa una vía de señalización propia que incluye la tirosin-fosforilación de c-Cbl y LAT, la activación de una serin/treonincinasa todavía por identificar y su internalización mediada por clatrina.

Els complexes ciclina-CDK són elements clau perquè el cicle cel·lular es doni de manera ordenada. Estan regulats a diferents nivells ja que les seves funcions són essencials per a la correcta progressió del cicle. El primer nivell de regulació és la interacció entre la ciclina i la CDK. En segon lloc, aquestes proteïnes poden experimentar fosforilacions i defosforilacions activadores i inhibidores. En tercer lloc, aquests complexes poden ser inhibits per la interacció amb CKIs (CDK Inhibitors). Finalment, la localització subcel·lular també és una manera de regular l'activitat d'aquests complexes, ja que només són actius al nucli de la cèl·lula.En aquest treball presentem un nou mecanisme de regulació dels complexes ciclina-CDK. Concretament hem observat que els membres del complex ciclina A-CDK2 interaccionen amb l'acetilasa PCAF. Aquesta proteïna ha estat generalment considerada com a un co-activador transcripcional gràcies a la seva capacitat d'acetilar histones i activar la transcripció gènica. Tanmateix, també s'ha vist que és capaç d'acetilar proteïnes no-histones com ara p53 o MyoD, i com a conseqüència està implicada en altres funcions cel·lulars com la diferenciació o la resposta a dany al DNA. L'acetilasa PCAF s'uneix al complex ciclina A-CDK2 tot inhibint la seva activitat quinasa. A més, acetila la ciclina A, cosa que comporta la seva degradació pel sistema ubiquitina-proteasoma. PCAF també acetila CDK2 a la lisina 33, la qual es troba molt conservada a la família de les CDKs, ja que és un aminoàcid crucial per a la interacció amb l'ATP. L'acetilació de CDK2 a la lisina 33 comporta la inhibició de la seva activitat quinasa i la seva separació de la ciclina A.En conclusió, els resultats d'aquesta tesi aporten un nou nivell de regulació dels complexes ciclina-CDK desconegut fins ara, i que cal tenir en compte com a possible mecanisme d'acció dels fàrmacs basats en compostos inhibidors de deacetilases els quals, d'altra banda, estan donant bons resultats en el tractament de malalties hematològiques i tumors sòlids. / "REGULATION OF CYCLIN A-CDK2 COMPLEX BY ACETYLATION"TEXT:Cell cycle proteins are regulated in different ways, being phosphorylation one of the most important and more studied mechanisms of regulation. On the other hand, acetylation is another kind of post-translational modification that was discovered in histones and initially it was associated with transcriptionally active chromatin. However, different studies indicate that acetylation can also play a role in the regulation of non-histone proteins and it has been linked to oncogenesis and cardiovascular and neurodegenerative diseases.In this work we report that cyclin A/cdk2 complex, which is crucial for cell cycle progression during S phase, is acetylated by the acetyltransferase P/CAF. Cyclin A directly interacts with P/CAF and is acetylated at lysines 54, 68, 95 and 112. Maximal acetylation occurs simultaneously to ubiquitylation at mitosis, indicating a role of acetylation on cyclin A stability. A non-acetylatable mutant in which these lysines were substituted by arginines (cycA 4R) cannot be ubiquitylated, is more stable than cycA wild-type and arrests cell cycle at mitosis.Increased expression of cyclin A has been detected in many types of cancers and it has a prognostic value to predict survival or early relapse. Our results indicate that acetylation is able to cause a decrease in the levels of cyclin A, suggesting that treatment with HDAC inhibitors (which potentiate acetylation in the cell) could be considered to treat this kind of tumors.

En aquest estudi es mostra clarament que en hepatòcits la Glu 6-P produïda per la HK I no pot ser dirigida cap al glicogen ja que no pot activar la GS de fetge. Aquesta evidència sembla indicar que la GK és l'element que facilita que l'hexosa fosforilada activi la LGS i serveixi per a la síntesi de glicogen en hepatòcits. A més, l'activació de la GS per part de la Glu 6-P de la gluconeogènesi, tal i com s'ha demostrat en els estudis presentats, reforça la idea que la GK no és la única, ni imprescindible per a la funcionalitat de la GS hepàtica, sinó que la HK I n'és l'excepció.D'aquests estudis, també podem concloure que l'acumulació hepàtica de glicogen a partir de glucosa està sotmesa a un sistema de control en el qual el controlador, GS, és alhora controlat per la GK. Aquest sistema és diferent de les cascades de fosforilació, en el qual l'enzim controla directament l'activitat del que el succeeix en la sèrie. En el nostre sistema, el control de manera indirecta l'exerceixen els nivells de Glu 6-P, que engeguen la desfosforilació de la GS, i per tant l'activen. Per això considerem la Glu 6-P tant un precursor com una molècula de senyalització que dirigeix la incorporació de glucosa a glicogenPer aprofundir en l'estudi del mecanisme d'activació de la LGS per glucosa s'han utilitzat les cèl·lules FTO-2B aprofitant que no expressen la GK. Fins aquest moment, s'acceptava que la glucosa quan era fosforilada per la GK estimulava l'activació de la GS millor que si era fosforilada per la HK I. La LGS endògena s'activa en resposta a concentracions creixents de glucosa quan la GK hi ha estat expressada però no quan la font de Glu 6-P és la HK I endògena o HK I sobreexpressada. Això suggereix la presència de com a mínim dues poblacions de Glu 6-P en la cèl·lula. Una d'aquestes poblacions prové de l'acció de la GK i és accessible a la LGS, mentre que la població de molècules de Glu 6-P produïdes per la HK I es localitzen en un compartiment cel·lular del qual està exclosa la LGS. En aquestes s'ha observat que la LGS, però no la MGS, diferència entre la Glu 6-P produïda per la GK o per la HK I. La isoforma hepàtica presenta especificitat per l'origen d'aquest metabòlit a diferència de la isoforma muscular, cosa que reforça les diferencies en els mecanismes de la síntesi del glicogen en el fetge i el múscul.Tots aquests resultats i aquells descrits a la bibliografia amb anterioritat, ens permeten concloure: primer, que la síntesi de glicogen succeeix a la perifèria de l'hepatòcit, i és funció de l'activació de la GS via Glu 6-P. En la perifèria cel·lular és on, probablement, es donen les condicions òptimes, com l'accés a substrats, per a la síntesi de glicogen.Segon, que la font utilitzada per sintetitzar la Glu 6-P es determinant per activar la GS. En el cas que s'utilitzi un precursor gluconeogènic per sintetitzar glicogen, la G6Pasa juga un paper clau al decidir en quina direcció (producció de glucosa o síntesi de glicogen) s'utilitzarà la Glu 6-P. En aquest sentit, recentment s'ha descrit que in vivo la inhibició de la Glu 6-P translocasa porta a una utilització de la Glu 6-P produïda per gluconeogènesi cap a la síntesi de glicogen. Tercer, quan la Glu 6-P prové de la fosforilació de glucosa per part de la GK, la síntesi de glicogen incrementa en funció dels nivells de glucosa. El glicogen es produeix de manera més eficient gràcies a la inactivació de la GP per glucosa i la conseqüent disminució de la degradació del glicogen. El funcionament tan acurat d'aquesta maquinària esdevé essencial en el balanç entre la producció hepàtica de glucosa i la síntesi de glicogen.

Durant el període de formació del Sistema Nerviós Central (SNC) una multitud de factors participen en el desenvolupament de les diferents estructures cerebrals. Aquests factors controlen tant la migració cel·lular com el correcte posicionament de les diferents cèl·lules dins el SNC. La Reelina és un proteïna soluble de matriu extracel·lular expressada al llarg del desenvolupament i de l'edat adulta, encara que la seva funció principal s'hipotetitza durant el desenvolupment. La present tesi abarca tres funcions diferents de la Reelina en el control de la migració cel·lular durant el desenvolupament i l'edat adulta.En el primer apartat d'aquesta Tesi, hem demostrat que la Reelina pot controlar el nivell de fosforilació en mode I de la proteïna MAP1B durant la migració de les neurones que formen l'escorça cerebral. Aquesta fosforilació en mode I s'ha associat al control de l'estabilitat dels microtúbuls durant la migració cel·lular. L'estudi morfològic que hem desenvolupat en l'animal deficient per la proteïna MAP1B ens ha corraborat que existeix una relació entre la cascada de senyalització desencadenada per la Reelina i l'activitat de la proteïna MAP1B. Finalment també hem descrit que en resposta a la Reelina la quinasa GSK3-beta fosforila principalment MAP1B en mode I, encara que la participació, en menor grau, de la quinasa Cdk5/p35 no pot ser descartada.En el següent punt del nostre estudi, hem relacionat la via de senyalització MAPK/ERK amb la cascada activada per la Reelina. Hem comprovat que la Reelina pot induir la fosforilació d'mDab1 i la subseqüent activació de la proteïna PI3K, que a la seva vegada pot fosforilar a la proteïna Akt1/PKB. A partir d'aquest resultats, hem demostrat que l'activació de PI3K en reposta a la Reelina indueix l'activació de MEK1/2 i que aquesta activació desenvoca en la fosforilació de les proteïnes Erk1 i Erk2. També hem descrit que les formes fosforilades d'Erk1/2 en resposta a Reelina es transloquen a nucli en neurones corticals on indueixen l'expressió del factor de transcripció Egr-1. Un punt important d'aquest estudi es basa en el fet que hem pogut relacionar la cascada Reelin-MAPK/ERK en el procés de desadhesió de les cèl·lules de la zona subventricular (o SVZ) que participen en la via de la migració rostral (o RMS). A partir del fet que en presència de la Reelina, les cèl·lules que surten d'explants de SVZ no migren homofílicament sino que pateixen un proces de desadhesió migrant de forma individualitzada, hem descrit que si bloquegem farmacològicament o genèticament la via d'activació MAPK/ERK l'efecte de desadhesió induït per la Reelina queda inhibit. Amb aquest resultat podem concloure que en resposta a la Reelina les proteïnes Erk1/2 es fosforilen i que aquesta fosforilació és necessària per que la Reelina desenvolupi els seu paper en desadhesió dels neuroblasts que participen en la RMS.El tercer i darrer punt d'aquesta Tesi es basa en el control per part de la Reelina de la migració radial de les cèl·lules granulars del cerebel. En resposta a Reelina les cèl·lules granulars del cerebel inhibeixen la seva migració i aquesta resposta es induïda mitjançant l'activació de la via de les MAPK/ERK. El bloqueig farmacològic d'aquesta via inhibeix l'efecte de la Reelina. Amb aquestes dades podem concloure que l'activació, induïda per la Reelina, de la via de les MAPK/ERK no només és important en el control de la migració en el cerbell anterior sino que també és important en el cerebel, y que aquesta pot ser una cascada de senyalització que participa àmplimant en les funcions on s'hipotetitza la funcionalitat de la Reelina. / "Role of Reelin signalling during neuronal migration in the Central Nervous System"During the development of the Central Nervous System (CNS) a multitude of factors work together to generate the different brain structures. Some of these factors control both cellular migration and cellular positioning inside the CNS. Reelin is a soluble protein of the extracellular matrix expressed during both development and adulthood, however its principal function is hypothesized to occur during development. This current Thesis addresses three different functions of Reelin on neuronal migration during embryonic and postnatal development.In the first chapter, we have shown that Reelin controls mode I phosphorylation of MAP1B protein during neuronal migration in the neocortex. Mode I phosphorylation has been related to the microtubule stability during cell migration. We developed morphological studies on map1b-deficient mice that corroborated the relationship between Reelin signalling cascade and MAP1B activity. Furthermore, we also described that this relation is done through the Reelin-dependent GSK3 activation, which phosphorylates MAP1B in mode I.In the second chapter, we addressed the relationship of Reelin signalling and the MAPK/ERK pathway. We showed that Reelin induces the phosphorylation of Dab1 and subsequent PI3K/Akt1 activation. Based on these results, we first described that Reelin-dependent PI3K activation induces MEK activation, which triggers Erk1 and Erk2 (Erk1/2) phosphorylation. We also showed that these active phospho-Erk1/2 proteins translocate into the nucleus inducing the expression of the Egr-1 transcription factor. Furthermore, we have demonstrated that this Reelin-induced pathway is activated during rostral migratory stream migration when neuroblasts face Reelin expressed in the olfactory bulb. The activation of ERK pathway in response to Reelin is crucial to change neuroblast migration from tangential chain migration to radial individual migration into the olfactory bulb.In the last chapter, we studied the role of Reelin in the control of radial migration of granule cells during the postnatal development of the mouse cerebellum. We shared that cerebellar granule cell migration is blocked by Reelin stimulation through MAPK/ERK activation. Furthermore, when ERK activation was pharmacologically block the Reelin effect on granule cells migration was inhibit.

Existeixen moltes evidències que indiquen que les diferents funcions descrites de p21(Cip1) es deuen, en certa part, a la seva localització intracel·lular. Mentre que la p21(Cip1) nuclear inhibeix la proliferació cel·lular, la p21(Cip1) citoplasmàtica és capaç de regular la supervivència i la mobilitat cel·lular. El fet que les funcions de p21(Cip1) en cada un dels compartiments cel·lulars tinguin papers oposats fa que sigui d'un gran interès l'estudi dels canvis de localització de p21(Cip1) i els mecanismes que regulen aquesta translocació, així com les possibles vies que p21(Cip1) pugui fer servir per a localitzar-se en els diferents compartiments cel·lulars.En aquesta tesi s'han realitzat dos estudis diferenciats, però amb un objectiu comú ja que tots dos es centren en l'anàlisi dels mecanismes reguladors de la localització cel·lular de p21(Cip1). En la primera part d'aquesta tesi, observem la importància de la fosforilació de p21(Cip1) per part de la proteïna cinasa C (PKC). Aquesta fosforilació té lloc en el residu Ser153, molt proper a la senyal de localització nuclear (NLS) de la p21(Cip1) i es capaç de regular la localització cel·lular de p21(Cip1). Aquests resultats, juntament amb altres treballs, demostren que la fosforilació de p21(Cip1) afavoreix la seva localització en el citoplasma. Diferents aproximacions experimentals ens van permetre observar com aquesta fosforilació inhibeix la unió entre p21(Cip1) i CaM. D'aquest primer treball se'n deriva un model de regulació de la localització cel·lular de p21(Cip1) en el qual la unió a CaM i la fosforilació per PKC tenen papers oposats. D'una banda, la unió de p21(Cip1) a CaM inhibeix la seva fosforilació per part de PKC i afavoreix la localització de p21(Cip1) en el nucli. D'altra banda, la fosforilació de p21(Cip1) en el residu Ser153 indueix una localització citoplasmàtica de p21(Cip1). Treballs posteriors ens van permetre observar com la sortida de p21(Cip1) del nucli cap al citoplasma també està regulada. Després del dany al DNA, els nivells cel·lulars de p21(Cip1) incrementen, especialment en el nucli, per tal d'assegurar una aturada del cicle cel·lular. Observem com en resposta al dany al DNA, p21(Cip1) s'acumula no només en el nucleoplasma de les cèl·lules sinó que també s'acumula en el nuclèol. En les cèl·lules danyades els components nucleolars es troben desorganitzats i el nuclèol perd els contactes amb l'embolcall nuclear i presenta unes estructures esfèriques en el seu interior. La p21(Cip1) present en les estructures esfèriques del nuclèol està en un equilibri dinàmic amb la p21(Cip1) del nucleoplasma i la presència de p21(Cip1) en aquestes estructures correlaciona amb una inhibició de l'export p21(Cip1) cap al citoplasma. Aquests resultats donen suport a l'existència d'una via d'export de proteïnes nuclears a través del nuclèol, semblant a la que intervé en l'export de ribosomes, la qual es veuria afectada amb la desestructuració dels nuclèols en resposta al dany cel·lular. A més, amb els resultats obtinguts no descartem la possibilitat que p21(Cip1) pugui ser modificada en el nuclèol ja que en resposta al dany al DNA també s'hi localitzen altres proteïnes implicades en diferents vies de modificació post-traduccional. Així doncs, l'acumulació nuclear de p21(Cip1) en resposta al dany al DNA no es deu únicament a un increment de la seva transcripció sinó que aquesta acumulació també es deguda a la inhibició de la sortida de p21(Cip1) cap al citoplasma a través del nuclèol.En conclusió, tant l'entrada com la sortida de la p21(Cip1) del nucli és un mecanisme altament regulat que farà que la localització de p21(Cip1) pugui variar en diferents situacions fisiològiques de la cèl·lula. Aquest fet és de gran importància per al correcte funcionament cel·lular ja que com hem descrit anteriorment, p21(Cip1) és una proteïna amb funcions oposades depenent de la seva localització intracel·lular: oncogènica al citoplasma i supressora de tumors al nucli. / It is well known that p21(Cip1) is a protein with a dual function in oncogenesis depending mainly on its intracellular localization: tumor suppressor in the nucleus and oncogenic in the cytoplasm. The importance of p21(Cip1) cellular localization indicates that it has to be precisely regulated.On one side we observed the importance of p21(Cip1) phosphorylation by PKC inducing its cytoplasmic localization. PKC phosphorylates p21(Cip1) at Ser 153 and when phosphorylated, p21(Cip1) can not bind to CaM. From this study we conclude that CaM and PKC have an opposite role in the regulation of p21(Cip1) localization: CaM binding to p21(Cip1) prevents its phosphorylation by PKC at Ser153 and consequently allows its nuclear localization; while when phosphorylated at Ser153, p21(Cip1) is located at the cytoplasm.On the other side the export of p21(Cip1) from the nucleus to the cytoplasm is also regulated. After DNA damage, p21(Cip1) increases and accumulates in the nucleus to ensure cell cycle arrest. We observed that after DNA damage p21(Cip1) accumulates not only in the nucleoplasm but also in the disrupted nucleoli. In damaged cells the nucleolar components are disorganized and nucleoli have lost their contacts with the nuclear envelope and appear with spherical structures inside. The nucleolar p21(Cip1) forms a dynamic equilibrium between the nucleolus and the nucleoplasm and correlates with the inhibition of p21(Cip1) nuclear export. This result proves the existence of a nucleolar export route to the cytoplasm for p21(Cip1) similar to the one described for the ribosome export. Moreover, the results obtained suggested that p21(Cip1) could be modified in the nucleolus in response to DNA damage as different proteins involved in post-translation modifications also localize in the nucleoli after the damage. Thus, after DNA damage, p21(Cip1) accumulates in the nucleus due to an increase in its transcription and due to an inhibition of its export to the cytoplasm.All this results together indicate the importance of p21(Cip1) localization depending on the cellular context and that its localization is precisely regulated by different pathways.

L´apoptosi, o mort cel.lular programada, és un procés actiu que mobilitza els recursos cel.lulars amb l´objectiu de mantenir l´homeostasi de l´organisme a expenses del suïcidi de cèl.lules individuals. Diferents estudis han mostrat un increment de l´activiat d´algunes cdk, especialment Cdk1 i Cdk2, en correlació amb la progressió dels primers estadis apoptòtics. En el nostre laboratori l´estudi de l´apoptosi en timòcits, els quals no tenen una activitat cdk significativa degut a l´aturada del cicle cel.lular en G1, demostren que la inducció de l´activitat de Cdk2 després del tractament amb radiació gamma o amb glucocorticoides és necessària per l´inici de l´apoptosi. Mentre cap de les ciclines conegudes sembla ser la proteïna activadora de Cdk2 en apoptosi, en el nostre laboratori hem identificat un nou membre de la família de les ciclines, denominada Ciclina O, capaç d´activar aquesta kinasa in vivo en línies cel.lulars. L´expressió d´aquesta nova ciclina en el timus, i altres teixits, s´indueix ràpidament després del tractament amb radiació gamma i coincideix amb l´aparició de l´apoptosi. Aquests resultats posicionen la Ciclina O com a millor candidat a ser l´activador de Cdk2 necessari per induïr la mort cel.lular programada en el timus, i probablement també en altres òrgans. / The apoptosis, also called programmed cell death, is an active process able to use the cellular mechanisms to kill individual cells in order to keep the functional homeostasis of the whole organism. Different studies had shown a correlation between the first apoptotic events and the induction of some cdk proteins, particularly Cdk1 and Cdk2. The studies of thymocytes in our laboratory, wich lacks the most amount of cdk activity related to the cell cycle because of its arrest in G1, had shown that the induction of Cdk2 activity after the treatment with gamma radiation or glucocorticoids is a necessary step for the apoptosis induction. While any of the cyclins described at the moment seems to be the Cdk2 activator for apoptosis a new member of the cyclin family able to activate the kinase Cdk2 in vivo in cell lines has been identified in our laboratory. The expresion of this cyclin, known as Cyclin O, is quickly induced in the thymus after the treatment with gamma radiation and correlates with the induction of apoptosis. These results position Cyclin O as the best candidate to activate Cdk2 and inuce the programmed cell death in the thymus, and probably other tissues.

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.