Durant el període de formació del Sistema Nerviós Central (SNC) una multitud de factors participen en el desenvolupament de les diferents estructures cerebrals. Aquests factors controlen tant la migració cel·lular com el correcte posicionament de les diferents cèl·lules dins el SNC. La Reelina és un proteïna soluble de matriu extracel·lular expressada al llarg del desenvolupament i de l'edat adulta, encara que la seva funció principal s'hipotetitza durant el desenvolupment. La present tesi abarca tres funcions diferents de la Reelina en el control de la migració cel·lular durant el desenvolupament i l'edat adulta.En el primer apartat d'aquesta Tesi, hem demostrat que la Reelina pot controlar el nivell de fosforilació en mode I de la proteïna MAP1B durant la migració de les neurones que formen l'escorça cerebral. Aquesta fosforilació en mode I s'ha associat al control de l'estabilitat dels microtúbuls durant la migració cel·lular. L'estudi morfològic que hem desenvolupat en l'animal deficient per la proteïna MAP1B ens ha corraborat que existeix una relació entre la cascada de senyalització desencadenada per la Reelina i l'activitat de la proteïna MAP1B. Finalment també hem descrit que en resposta a la Reelina la quinasa GSK3-beta fosforila principalment MAP1B en mode I, encara que la participació, en menor grau, de la quinasa Cdk5/p35 no pot ser descartada.En el següent punt del nostre estudi, hem relacionat la via de senyalització MAPK/ERK amb la cascada activada per la Reelina. Hem comprovat que la Reelina pot induir la fosforilació d'mDab1 i la subseqüent activació de la proteïna PI3K, que a la seva vegada pot fosforilar a la proteïna Akt1/PKB. A partir d'aquest resultats, hem demostrat que l'activació de PI3K en reposta a la Reelina indueix l'activació de MEK1/2 i que aquesta activació desenvoca en la fosforilació de les proteïnes Erk1 i Erk2. També hem descrit que les formes fosforilades d'Erk1/2 en resposta a Reelina es transloquen a nucli en neurones corticals on indueixen l'expressió del factor de transcripció Egr-1. Un punt important d'aquest estudi es basa en el fet que hem pogut relacionar la cascada Reelin-MAPK/ERK en el procés de desadhesió de les cèl·lules de la zona subventricular (o SVZ) que participen en la via de la migració rostral (o RMS). A partir del fet que en presència de la Reelina, les cèl·lules que surten d'explants de SVZ no migren homofílicament sino que pateixen un proces de desadhesió migrant de forma individualitzada, hem descrit que si bloquegem farmacològicament o genèticament la via d'activació MAPK/ERK l'efecte de desadhesió induït per la Reelina queda inhibit. Amb aquest resultat podem concloure que en resposta a la Reelina les proteïnes Erk1/2 es fosforilen i que aquesta fosforilació és necessària per que la Reelina desenvolupi els seu paper en desadhesió dels neuroblasts que participen en la RMS.El tercer i darrer punt d'aquesta Tesi es basa en el control per part de la Reelina de la migració radial de les cèl·lules granulars del cerebel. En resposta a Reelina les cèl·lules granulars del cerebel inhibeixen la seva migració i aquesta resposta es induïda mitjançant l'activació de la via de les MAPK/ERK. El bloqueig farmacològic d'aquesta via inhibeix l'efecte de la Reelina. Amb aquestes dades podem concloure que l'activació, induïda per la Reelina, de la via de les MAPK/ERK no només és important en el control de la migració en el cerbell anterior sino que també és important en el cerebel, y que aquesta pot ser una cascada de senyalització que participa àmplimant en les funcions on s'hipotetitza la funcionalitat de la Reelina. / "Role of Reelin signalling during neuronal migration in the Central Nervous System"During the development of the Central Nervous System (CNS) a multitude of factors work together to generate the different brain structures. Some of these factors control both cellular migration and cellular positioning inside the CNS. Reelin is a soluble protein of the extracellular matrix expressed during both development and adulthood, however its principal function is hypothesized to occur during development. This current Thesis addresses three different functions of Reelin on neuronal migration during embryonic and postnatal development.In the first chapter, we have shown that Reelin controls mode I phosphorylation of MAP1B protein during neuronal migration in the neocortex. Mode I phosphorylation has been related to the microtubule stability during cell migration. We developed morphological studies on map1b-deficient mice that corroborated the relationship between Reelin signalling cascade and MAP1B activity. Furthermore, we also described that this relation is done through the Reelin-dependent GSK3 activation, which phosphorylates MAP1B in mode I.In the second chapter, we addressed the relationship of Reelin signalling and the MAPK/ERK pathway. We showed that Reelin induces the phosphorylation of Dab1 and subsequent PI3K/Akt1 activation. Based on these results, we first described that Reelin-dependent PI3K activation induces MEK activation, which triggers Erk1 and Erk2 (Erk1/2) phosphorylation. We also showed that these active phospho-Erk1/2 proteins translocate into the nucleus inducing the expression of the Egr-1 transcription factor. Furthermore, we have demonstrated that this Reelin-induced pathway is activated during rostral migratory stream migration when neuroblasts face Reelin expressed in the olfactory bulb. The activation of ERK pathway in response to Reelin is crucial to change neuroblast migration from tangential chain migration to radial individual migration into the olfactory bulb.In the last chapter, we studied the role of Reelin in the control of radial migration of granule cells during the postnatal development of the mouse cerebellum. We shared that cerebellar granule cell migration is blocked by Reelin stimulation through MAPK/ERK activation. Furthermore, when ERK activation was pharmacologically block the Reelin effect on granule cells migration was inhibit.

Dorsoventral patterning of the vertebrate nervous system is achieved by the combined activity of morphogenetic signals secreted from dorsal and ventral signalling centres. The Shh/Gli pathway plays a major role in patterning the ventral neural tube; however, the molecular mechanisms that limit target gene responses to specific progenitor domains remain unclear. Here, we show that Wnt1 and Wnt3a, by signalling through the canonical β-catenin/Tcf pathway, control expression of dorsal genes and suppression of the ventral programme, and thatthis role in DV patterning depends on Gli activity. Additionally, we show that Gli3 expression is controlled by Wnt activity. Identification and characterization of highly conserved non-coding DNA regions around the human Gli3 gene revealed the presence of transcriptionally active Tcf-binding sequences. These indicated that dorsal Gli3 expression might be directly regulated by canonical Wnt activity. In turn, Gli3, by acting as a transcriptional repressor, restricted graded Shh/Gli ventral activity to properly pattern the spinal cord.Additionally, the Wnt canonical pathway and Hedgehog signalling have been linked to cell proliferation in a variety of systems, however interaction of these pathways to control cell cycle progression have not been studied. In the developing vertebrate nervous system, although Shh and Wnt ligands are expressed at the opposite ventral and dorsal signalling centres, reports demonstrate that proliferation of neural progenitors require both activities throughout the dorsoventral axis. Here we demonstrate the integration of both pathways to control the length of G1 phase, and the absolute requirement of an upstream Hedgehog activity for the Wnt-mediated regulation of the key cell cycle activator CyclinD1 expression and for G1 progression. Although Wnt canonical activity appeared restricted to the control of G1 phase, Hedgehog activity additionally regulates the length of G2 phase through the regulation of ate cell cycle activators such as CyclinA2 and CyclinB2/3. These findings support a key role for Hedgehog in growth control, as a regulator of G1 and G2 phases of cell cycle and importantly as an upstream regulator of the canonical Wnt activity.KEY WORDS: SHH, WNT, Neural Tube, Patterning, CNS, Cell Cycle. / "La integración de las vías de señalización de Shh y Wnt controla la morfogénesis del SNC"TEXTO: La formación del patrón dorsoventral del sistema nervioso central en vertebrados está controlada por la acción de señales morfogenéticas. Estasseñales son secretadas por centros de señalización situados en el extremo dorsal, ectodermo y placa del techo, y ventral, notocorda y placa del suelo, del tubo neural. La vía de señalización de Shh/Gli juega un papel principal en el establecimiento temprano de la región ventral del tubo neural. Sin embargo, losmecanismos moleculares que restringen la expresión de los genes responsables de establecer este patrón a un dominio concreto no son del todo conocidos. En este trabajo mostramos que las señales morphogenéticas Wnt1y Wnt3a, activando la vía de señalización canónica mediada por β-catenina/Tcf, regulan la expresión de genes dorsales y reprimen el programa ventral, mediante un mecanismo que depende de la actividad Gli. Además, mostramosque la expresión de Gli3 está controlada por la vía de Wnt. La identificación y caracterización de regiones no codificantes altamente conservadas alrededor del locus de Gli3 humano revela que contienen sitios de unión consenso para los factores Tcf/Lef-1 activos. Esto indica que la expresión dorsal de Gli3 está controlada directamente por la actividad de la vía canónica de Wnt. A su vez, Gli3, actuando como un represor transcripcional, restringe la actividad del gradiente ventral Shh/Gli para establecer el patrón dorsoventral del tubo neural correctamente.Por otro lado, las vías canónicas de señalización celular de Wnt y Hedgehog regulan la proliferación celular en varios contextos de forma conjunta, Sin embargo, posiblesm interacciones de estas vías de señalización en el control del ciclo celular no han siso estudiadas. Durante el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados, aunque las proteínas Shh y Wnts se expresan en extremos dorso-ventralmente opuestos del tubo neural, varios trabajos demuestran que la proliferación de los progenitores neuronales requiere ambas actividades a lo largo de todo el eje dorsoventral. En este trabajo, demostramos que esnecesaria la integración de ambas vías de señalización para controlar la duración de la fase G1 del ciclo celular. Además, mostramos el requerimiento de la actividad Hedgehog para la regulación mediada por Wnt de la expresión del activador de ciclo celular ciclina D1, componente clave para la progresión através de G1. Aunque la actividad de la vía canónica de Wnt se limita al control de la transición G1/S, adicionalmente, la actividad Hedgehog regula la duración de la fase G2 mediante la regulación de las ciclinas de fase G2 ciclina A2 y Ciclinas B2/B3. En conjunto, estos resultados proponen un papel fundamentalen el control del crecimiento para la actividad Shh/Gli como reguladora de las fases G1 y G2 del ciclo celular y además como reguladora por encima de la actividad canónica de Wnt.

El linfoma de células del manto (LCM) es una entidad heterogénea tanto en sus aspectos biológicos como en su comportamiento clínico. La existencia de pacientes con mala respuesta al tratamiento sugiere que, de manera análoga a otros síndromes linfoproliferativos crónicos, existen alteraciones en los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos. La heterogeneidad clínica del LCM queda reflejada, entre otros, por la variabilidad en la presentación de expresión hemoperiférica e infiltración del sistema nervioso central (SNC), dos complicaciones controvertidas y no suficientemente estudiadas. La hipótesis planteada en la presente tesis fue que la heterogeneidad observada en el LCM podría ser debida a la existencia de alteraciones en los mecanismos de apoptosis en un subgrupo de pacientes y se relacionaría con el pronóstico de éstos. Por otro lado, el análisis exhaustivo de los pacientes con expresión hemoperiférica o infiltración del SNC permitiría establecer cuáles son las características clínicas y biológicas que determinan la aparición de estas complicaciones en determinados enfermos. Para confirmar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos: 1) estudiar las bases moleculares de la regulación de la apoptosis en el LCM, tanto en líneas celulares como en células primarias de pacientes afectos; 2) analizar la incidencia y el impacto pronóstico de la expresión hemoperiférica en los enfermos con LCM mediante citología y citometría de flujo y 3) estudiar la incidencia y los factores determinantes de la infiltración del SNC en pacientes afectos de esta hemopatía.Para el estudio de las bases moleculares de la apoptosis en el LCM se analizaron cuatro líneas celulares portadoras de la t(11;14)(q13;q32), característica de esta entidad, y células primarias de 10 pacientes con LCM. El análisis de la viabilidad celular mediante marcaje con anexina V y yoduro de propidio, la detección de la pérdida de potencial de membrana y la producción de ROS, la determinación de caspasa 3 activa y de los cambios de conformación de BAX y BAK se llevaron a cabo mediante citometría de flujo (CMF). El análisis de diversas proteínas de la familia de BCL-2 se realizó mediante "Western blot". El estudio del ciclo celular se efectuó asimismo mediante CMF. El análisis de las alteraciones cromosómicas existentes en los LCM leucemizados se realizó mediante hibridación genómica comparada (CGH). Las diferencias entre subgrupos de pacientes se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher y la t de Student. El análisis de supervivencia se llevó a cabo mediante el método de Kaplan y Meier y las diferencias observadas en términos de supervivencia se analizaron con el "log-rank test". El análisis de variables dependientes del tiempo se efectuó mediante el método de Mantel y Byar. Los resultados obtenidos en el primer trabajo demuestran que la citotoxicidad inducida por mitoxantrona en las células del LCM fue debida a la activación de la vía mitocondrial de apoptosis, y tiene lugar, probablemente, de manera dependiente de la integridad de los sensores de daño al ADN. Los resultados del segundo trabajo permiten concluir que la expresión hemoperiférica detectada mediante CMF se observa en la mayoría de los pacientes con LCM, incluso en aquellos con recuentos linfocitarios normales. Aunque la leucemización morfológica no se asoció en nuestro estudio con ninguna alteración citogenética específica detectable mediante CGH, los casos con linfocitosis >/5 x 10(9)/L presentaron anomalías citogenéticas diferenciales y un peor pronóstico. Los resultados del tercer trabajo demuestran que la infiltración del SNC se presenta fundamentalmente en pacientes con LCM blastoide, índice proliferativo elevado, niveles de LDH sérica elevados e IPI de riesgo intermedio/alto o alto, en general en el contexto de recidivas o progresiones sistémicas. / "BIOLOGICAL AND CLINICAL PROGNOSTIC FACTORS IN MANTLE CELL LYMPHOMA"TEXT:Mantle cell lymphoma (MCL) is characterized by the presence of translocation t(11;14)(q13;q32), an aggressive clinical course and poor response to chemotherapy. Few data concerning drug-induced apoptosis in MCL have been reported. The aim of the first study that constitutes the present thesis was to analyze the mechanisms of drug-induced apoptosis in MCL. Four cell lines carrying the t(11;14) and primary cells of 10 patients with MCL were incubated in vitro with several drugs currently used in the treatment of lymphoproliferative disorders and drug-induced cell death was characterized. Our results support that MCL cells have functional apoptotic machinery but require the integrity of functional DNA-damage response genes for its activation. From a clinical standpoint, extranodal involvement is a well-known feature in patients with MCL. Relatively few studies to date have focused on the peripheral blood (PB) involvement and the incidence of leukemic expression in MCL varies highly in different studies. The objective of our second study was to analyze the incidence, and the biological and clinical significance of leukemic involvement in patients with MCL. We investigated the incidence of PB involvement by both morphologic and flow cytometry (FC) analyses. Clinical features, genetic abnormalities detected by comparative genomic hybridization (CGH) and patient outcome were also determined. Leukemic expression at diagnosis detected by FC was a highly common feature, even in patients with a normal lymphocyte count. Although morphologically apparent leukemic expression was not associated with specific chromosomal alterations detected by CGH, a lymphocyte count >/ 5 x 10(9)/L was correlated with particular genetic abnormalities and a poor outcome.The incidence of central nervous system (CNS) involvement in patients with MCL is also highly variable in different studies, and predicting factors and outcome of CNS infiltration in these patients have not been thoroughly investigated. The aim of our study was to assess the incidence and factors for CNS involvement in MCL. In addition, we analyzed the clinical features, therapy and outcome of patients with MCL once CNS infiltration was detected. Our results suggest that, in most cases, CNS involvement occur late in the course of the disease, as part of a generalized relapse or progression. Blastoid histology, high proliferative index, high serum LDH and high-risk IPI are the variables associated with a higher risk to develop this complication.