Els mecanismes moleculars i cel·lulars responsables del fenotip metastàtic en el càncer de mama són poc coneguts. Tanmateix, l'habilitat de les cèl·lules tumorals per resistir els senyals de mort podria contribuir a crear les condicions favorables per al desenvolupament de les metàstasis. Bcl-2 i Bcl-xL són proteïnes de la família de Bcl-2 capaces d'inhibir l'apoptosi. L'objectiu d'aquest estudi fou obtenir un model experimental de carcinoma de mama ortotòpic amb el qual estudiar la contribució que la sobreexpressió de Bcl-2 i Bcl-xL, junt amb la inhibició de l'apoptosi que indueixen, pot tenir en diferents etapes de la progressió metastàtica del càncer de mama humà. Amb aquest objectiu es van transfectar amb l'ADN complementari del bcl-2 i bcl-xL línies cel·lulars derivades d'adenocarcinoma de mama humana amb diferent capacitat tumorígena, metastàtica i hormonodependent: MCF-7, MDA-MB-468 i MDA-MB-435P. Els nostres resultats mostren que Bcl-2 i Bcl-xL confereixen resistència a l'apoptosi induïda per factors de creixement (TGF-alfa i TNF-beta) i agents quimioterapèutics (paclitaxel i tamoxifen) en funció de la dotació oncogènica de les cèl·lules. La sobreexpressió de les proteïnes antiapoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL afavoreix l'activitat metastàtica de les cèl·lules 435 en diferents etapes del procés: disminució de l'adhesió cel·lular a proteïnes de la matriu extracel·lular (laminina, fibronectina i col·lagen IV), inhibició de la mort cel·lular per desadhesió de la matriu extracel·lular o anoikis i avantatge per sobreviure en el torrent sanguini i/o en l'òrgan diana facilitant el creixement metastàtic. La inhibició de l'apoptosi i de l'anoikis induïdes per la sobreexpressió de Bcl-2 i Bcl-xL requereix alhora altres alteracions genètiques necessàries perquè les cèl·lules de càncer de mama esdevinguin metastàtiques. Així, Bcl-2 i Bcl-xL no indueixen el fenotip metastàtic dels tumors obtinguts amb les cèl·lules no metastàtiques 468. Les cèl·lules derivades dels tumors organotòpics van ser exposades repetidament al microambient de la glàndula mamària per analitzar si la perllongada supervivència induïda per la sobreexpressió de Bcl-2 o Bcl-xL afavoria la selecció d'un fenotip metastàtic més agressiu en els tumors 435 o si induïa el fenotip metastàtic en els tumors 468 no metastàtics. La sobreexpressió de Bcl-xL en cèl·lules 435 afavoreix la ubiqüitat de les metàstasis, induint metàstasis ganglionars i pulmonars. Però, la perllongada supervivència induïda per Bcl-2 no indueix l'aparició d'altres localitzacions metastàtiques. Altrament, Bcl-2 no és capaç d'induir el fenotip metastàtic a les cèl·lules 468 després dels successius implants in vivo/in vitro. Les cèl·lules tumorals no metastàtiques 468 no posseeixen tots els canvis genètics necessaris o propietats cel·lulars requerides per a la metàstasi, i la perllongació de l'expressió de Bcl-2 no és suficient per induir-los. De fet, l'augment de l'activitat metastàtica pulmonar i ganglionar induïda per la sobreexpressió de Bcl-xL es neutralitza en els tumors induïts amb cèl·lules 435/Bcl-xL transfectades amb la construcció antisentit de bcl-xL, cosa que reafirma el paper decisiu d'aquest gen en l'evolució metastàtica dels tumors. D'altra banda, la inhibició de l'apoptosi induïda per la sobreexpressió de Bcl-2 o Bcl-xL en els tumors afavoreix la selecció de cèl·lules 435 amb major capacitat tumorígena. En contraposició, Bcl-2 i Bcl-xL contribueixen a disminuir la tumorigènesi de les cèl·lules no metastàtiques 468 amb les successives fases de selecció in vivo/in vitro, comprovant-se in vitro menor proliferació. Així, la disregulació de les proteïnes antiapoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL afavoreix la selecció de cèl·lules de càncer de mama amb un fenotip més agressiu. I, consegüentment, la capacitat per modular la funció i/o expressió de Bcl-2 o Bcl-xL en tumors de mama amb sobreexpressió d'aquestes proteïnes pot representar un esdeveniment crític per induir la reversió del fenotip metastàtic i regular la sensibilitat de les cèl·lules tumorals a drogues terapèutiques, millorant la resposta als mètodes tradicionals de tractament del càncer.

El gangli sentinella o ganglis sentinelles (GS) és el gangli que recull el drenatge limfàtic del tumor i són de localització axil·lars i extraaxil·lars, com a la cadena mamària interna (CMI). Hi ha evidència a la literatura del pronòstic negatiu de les metàstasis del càncer de mama en la CMI, però ha estat controvertit i abandonat el seu tractament quirúrgic, donada la morbiditat i la manca d'evidència d'impacta en la supervivència. Les pacients, però, seleccionades per rebre el buidament de la CMI presentaven tumors detectats clínicament. Des dels estudis publicats l'any 1997, on es demostrava que la radioteràpia (RT) postmastectomia en pacients de risc tant post com menopàusiques aporta un increment de la supervivència i que en la planificació de la irradiació sempre s'incloïa la CMI, hi ha un interès renovat en el coneixement i inclusió d'aquesta cadena ganglionar en la planificació de la RT. El tractament de RT incloent la CMI és complexa i incrementa el risc de toxicitat. A més, la complexitat augmenta quan s'ha realitzat una cirurgia conservadora de la mama que és la tècnica més àmpliament utilitzada en tumors en Estadi I-II. L'estudi del GS aplicat a tumors en Estadis I-II amb la comprovació de l'afectació de la CMI i les repercussions tant d'indicació com de la planificació de la RT és l'eix d'aquesta tesi. La hipòtesis d'aquest treball és que la tècnica de la biòpsia selectiva del GS aplicada a la CMI pot tenir implicacions terapèutiques en la RT.S'han analitzat diversos grups de pacients amb estudi del GS per càncer de mama. Subgrup a. (n=225) des del juny'98 fins desembre'02, d'elles 105 en la fase primera de validació (subgrup a.i) de la tècnica (fins desembre'00 (tumors fins 4 cm i sense biòpsia de la CMI) i 120 en fase d'aplicació (subgrup a.ii) (tumors fins 2,5 cm). Des de l'inici de la fase d'aplicació fins maig'04 s'inclouen 220 pacients (subgrup b.ii) on s'hi valora la taxa de recaigudes axil·lars i falsos negatius (FN) i el subgrup c.ii amb 278 pacients en la fase d'aplicació fins juliol'04. En total 383 pacients entre juny'98 i juliol'04. Des del gener'03 es va incloure tumors fins 3 cm. En el subgrup a.ii la taxa de pacients amb identificació del GS en l'acte quirúrgic va ser del 96,6%, amb un 17,2% a la CMI. Exèresis CMI exitosa 14/20 (69%) i en 2 casos (14%) es va demostrar infiltració per carcinoma. Del total de les pacients en què es va identificat el GS durant l'acte quirúrgic el percentatge de metàstasi a la CMI és baix, un 1,7% i en ambdós casos el GS axil·lar també va ser positiu. En el subgrup c.ii les dades són similars (1,8%). FN: 8,3% subgrup a.i; 2,7% subgrup a.ii i 3,45% subgrup b.ii, que es correlaciona amb la mida màxima tumoral definida en cada subgrup. El drenatge a la CMI va ser més freqüent en tumors de quadrants inferiors (24,5%) i medials (23%), essent la localització més freqüent el quadrant ínfero-medial (31,7%). Tot i que el valor real de la inclusió de la CMI en la planificació de RT en el càncer de mama en estadis inicials es desconeix i pel baix percentatge de metàstasis a la CMI en aquest estudi, no es podrà planificar un assaig aleatoritzat. No es recomana la inclusió de la CMI en el volum de tractament de RT a no ser que l'exèresi del GS a la CMI sigui positiu i sempre planificant la RT amb tècniques 3D per reduir al màxim els efectes adversos a nivell de la unió de camps i reduir la dosi als òrgans en risc. / "Incidence of Internal Mammary Node Metastases After a Sentinel Lymph Node Technique in Breast Cancer and its Implication in the Radiotherapy Plan"To analyze the frequency in determining pathologically-proven metastatic involvement of internal mammary nodes (IMN) after sentinel lymph node (SLN) technique in breast cancer and evaluate its implications for radiotherapy (RT) management of patients.METHODS AND MATERIALS: Three hundred and eighty three patients who underwent lymphatic mapping for early breast cancer from June 1998 to July 2004 were evaluated. There were different subgroups, subgroup a. 225 patients till December 2002 with two phases in that period: the validation phase till December 2000 (subgroup a.i) (105 patients, T1, T2 &#61603; 4 cm), and the application phase (subgroup a.ii) (120 patients, T1, T2 < 2.5cm). The application phase till May 2004 (220 patients) and till July 2004 (278 patients). Since January 2003 tumors were included till 3 cm. In the validation if a drainage pathway to the IMN was identified no biopsy was performed in this phase. In the application if the study showed metastases in the IMNs biopsy was performed. When histologically proven IMN metastases were detected, RT was included on the IMN chain planned with a 3D treatment system using conformal techniques. At the beginning of the study the injection site was subdermal and subsequently, the injection site was changed to peritumoral and intratumoral in order to search for IMN.RESULTS: In 31 patients of 225 (14%) hot spots were observed in the IMN (11.5% and 17.2% in the phases a.i and a.ii respectively). Sampling of IMN was successful in 69% of the cases (14/20) and revealed metastatic involvement in 14% (2/14). This represents incidence of only 1.7% (2/116) in early breast cancer patients. These results were similar in the subgroup c.ii (1.8%). False negative rate: 8.3% subgroup a.i; 2.7% subgroup a.ii and 3.45% subgroup b.ii. CONCLUSIONS: The percentage in pathologically-proven metastatic involvement of IMN after SLN technique in early breast cancer is low, but it is not negligible. Although the real value of IMN irradiation in early breast cancer is not known, including this chain in post conserving surgery is not recommended unless pathologically-proven IMNs have been produced by SLN technique. In order to avoid over dosage or under dosage in the joint between the medial tangential and IMN fields an individualized 3D dosimetry study is mandatory to enhance dose distribution and reduce the heart volume to lessen side-effects.

La metástasis ganglionar constituye el factor pronóstico más importante en el cáncer de mama. La técnica del ganglio centinela se ha convertido en la opción de elección para el exámen del estado axilar, permitiendo evitar las complicaciones que provoca la linfadenectomía en un gran número de pacientes.La posibilidad de centrar el estudio de la axila en uno o pocos ganglios, en vez de los 10-30 de la disección axilar, ha permitido el empleo de técnicas moleculares que de otro modo hubieran resultado poco costo-efectivas en la rutina diagnóstica.El objetivo de esta tesis es evaluar si la utilización de la técnica de la RT-PCR es un método más sensible y costo eficaz en la detección de células circulantes y micrometástasis que el exámen rutinario histopatológico del ganglio centinela en pacientes con cáncer de mama.El estudio se ha realizado sobre una muestra total de unos 795 ganglios centinela, de paciencia diagnosticadas y tratadas en el HUB. Todos los ganglios fueron analizados mediante: Hematoxilina-eosina, cortes seriados e inmunohistoquímica (Cam 5.2), y RT-PCR (Citoqueratina 19).En este estudio se han analizado las distintas técnicas de RT-PCR, clásica y cuantitativa (Real-Time), se han comparado distintas plataformas Real-time y distintos tipos de normalización de datos.También se ha comparado la incidencia de positividad de la RT-PCR en la detección de células epiteliales frente la inmunohistoquímia. Además, se ha relacionado los resultados de expresión de citoqueratina en cada uno de los grupos con las características biológicas de los tumores: Tamaño tumoral, tipo histológico, multicentricidad o bilateralidad, permeación vascular, grado tumoral, estado de los receptores hormonales, expresión de Ki67 y expresión/amplificación del HER2/neu en los casos que se dispone. Así mismo se ha comparado la afectación ganglionar con otras características como: la clasificación molecular de los tumores y clasificación de riesgo de St. Gallen y se ha realizado el estudio estadístico univariado y multivariado.Finalmente, se ha realizado una evaluación comparativa del coste-efectividad de los distintos métodos utilizados. / The axillary node metastases has become a key prognostic factor for breast cancer. It is a powerful predictor of recurrence and overall patient survival. It is also used to determine systemic adjuvant treatment. The technique of Sentinel Node Biopsy (SNB) has had a major impact in the field of the surgical and staging breast cancer. It is a sensitive and specific method for predicting the status of the regional lymph nodes, furthermore, decreased morbidity is seen in comparison to that of routine level I-II axillary lymph node dissection. The sentinel node biopsy offers the opportunity on focusing on the examination of just a few lymph nodes and making it possible to use molecular techniques like reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The objective of this thesis is to evaluate the use of molecular techniques and comparing the results with histopathological standard evaluation. In this thesis, results from the analysis of 795 patients from Hospital Universitari de Bellvitge with routine haematoxilin-eosin slide preparation, immunohistochemistry and RT-PCR were evaluated. Also, the correlation between molecular diagnostics and standard clinic-pathological prognostic factors like: tumour size, histological grade, vascular invasion, expression of hormonal receptors and KI67 and HER2/neu status and St. Gallen risk category were compared.

This Doctoral Thesis project is part of a broader research program whose global aim is to better understand key molecular and cellular events in tumor metastasis, in particular those associated with prostate cancer, in order to identify regulatory molecules, gene networks and biochemical pathways, to propose relevant biomarkers and, finally, to provide proof-of-concept validations for potential therapeutic targets. As a starting point, this particular project has relied on comparative analyses between isogenic tumor cells with high vs. low metastatic potentials. The results of this Thesis project are reflected in two different but closely related studies. Article 1, the main publication of this project, focuses on how phenotypic switches and interactions between distinct tumor cell subpopulations engage or suppress metastasis, and which are the genetic programs that may govern such transformations. Article 2 is more focused on specific molecular post-transcriptional regulatory mechanisms that influence the latter steps of metastatic colonization. 1) Malignant progression in cancer requires populations of tumor-initiating cells (TICs) endowed with unlimited self-renewal, survival under stress and establishment of distant metastases. Additionally, the acquisition of invasive properties driven by epithelial-mesenchymal transition (EMT) is critical for the evolution of neoplastic cells into fully metastatic populations. Here we characterize cellular models derived from prostate and bladder cancer cell lines in which tumor subpopulations expressing a strong epithelial gene program are enriched in highly metastatic TICs, while a second subpopulation with stable mesenchymal traits is impoverished in TICs. Constitutive overexpression of the transcription factor Snai1 in the epithelial/TIC-enriched populations engaged a mesenchymal gene program and suppressed their self-renewal and metastatic phenotypes. Conversely, knockdown of EMT factors in the mesenchymal-like prostate cancer cell subpopulation caused a gain in epithelial features and properties of TICs. Both tumor cell subpopulations cooperated among them, such that the non-metastatic mesenchymal-like prostate cancer subpopulation enhanced the in vitro invasiveness of the metastatic epithelial subpopulation and, in vivo, promoted the escape of the latter from primary implantation sites and accelerated their metastatic colonization. Our models provide new insights into how dynamic interactions between epithelial, self-renewal and mesenchymal gene programs determine the plasticity of epithelial tumor-initiating cells. 2) Although the role of miR-200s in regulating E-cadherin expression and epithelial-to-mesenchymal transition is well established, their influence on metastatic colonization remains controversial. Here we have used clinical and experimental models of breast cancer metastasis to discover a pro-metastatic role of miR-200s that goes beyond their regulation of E-cadherin and epithelial phenotype. Overexpression of miR-200s is associated with increased risk of metastasis in breast cancer and promotes metastatic colonization in mouse models, phenotypes that cannot be recapitulated by E-cadherin expression alone. Genomic and proteomic analyses revealed global shifts in gene expression upon miR-200 overexpression toward that of highly metastatic cells. miR-200s promote metastatic colonization partly through direct targeting of Sec23a, which mediates secretion of metastasis-suppressive proteins, including Igfbp4 and Tinagl1, as validated by functional and clinical correlation studies. Overall, these findings suggest a pleiotropic role of miR-200s in promoting metastatic colonization by influencing E-cadherin–dependent epithelial traits and Sec23a-mediated tumor cell secretome. Both studies, when considered together, share important and novel views of metastasis, mainly in relationship with the last steps of the metastatic cascade, strongly suggesting that prostate, bladder and breast tumor cells with an epithelial non-secretory phenotype are more prone to metastatize. We propose that mesenchymal-like tumor cells with a relatively stable EMT derive from epithelial-CSC cells at the primary tumor site, largely in response to microenvironmental influences. As we have shown in the first study, both tumor cell populations, epithelial-CSC or TIC and mesenchymal-like, interact with each other, one consequence being a transient EMT of the epithelial-CSC population that had retained their epithelial state. Thus, in a given tumor microenvironment, there is a strong pressure for epithelial-CSC to drift from epithelial to mesenchymal-like phenotypes. Together, these heterogeneous populations of tumor cells are effective at overcoming the initial barriers to metastasis where invasion is required. After completing these initial steps, mesenchymal-like tumor cell populations are less critically required, while epithelial-CSC are more important and critical to finally grow metastastatic secondary tumors. There are many reasons to support that epithelial-CSC-unsecretory cells are more capable of metastatic colonization, including the facts that they can form clusters in the bloodstream for better survival, are resistant to anoikis, they show anchorage-independent growth and strong self-renewal capacity that permit them to adapt to different environments and initiate and grow secondary tumors. Very interestingly, such cells have a reduced secretion of metastatic suppressor factors which may interact in autocrine and paracrine fashion with tumoral and stromal cells at metastatic sites. / La progressió maligna en càncer requereix de poblacions iniciadores de tumors (TICs) que tenen capacitat auto-renovadora il•limitada, supervivència baix estrès i d'establir metàstasis a distància. Addicionalment, l'adquisició de propietats invasives per transició epiteli-mesènquima (EMT) és crítica per l'evolució neoplàsica en la conversió a poblacions metastàtiques. Aquí caracteritzem models cel•lulars derivats de línies de càncer de pròstata i bufeta, en les quals unes subpoblacions expressen un programa epitelial enriquit en cèl•lules metastàtiques iniciadores de tumors (TICs), mentre que una segona població presenta característiques mesenquimals i és pobre en cèl•lules iniciadores de tumors (TICs). La sobreexpressió constitutiva del factor de transcripció Snai1 en les poblacions enriquides en cèl.lules epitelials-iniciadores de tumors, indueix el fenotip mesenquimal i suprimeix l'auto-renovador i metastàtic. D'altra banda, el knock-down de factors d'EMT en la subpoblació mesenquimal va provocar el guany de propietats epitelials i de cèl•lules iniciadores de tumors. Aquestes dues subpoblacions de càncer de pròstata poden cooperar entre elles. La subpoblació mesenquimal augmenta la seva invasió in vitro de les epitelials-TICs i in vivo promou la seva sortida del lloc de tumor primari accelerant així la colonització metastàtica. Els nostres models proveeixen nous coneixements en com la dinàmica entre programes epitelials auto-renovadors i mesenquimals, determinen la plasticitat de les cèl•lules epitelials iniciadores de tumors

No description available.

L’objectiu d’aquest treball és la identificació i caracterització de les principals alteracions en metàstasi hepàtica (MH) de càncer colorectal (CCR) tant a nivell d’expressió gènica com de metilació de l’ADN. Els resultats obtinguts han de servir per millorar la comprensió del procés metastàtic i aportar nous coneixements que puguin ser aplicats en el diagnòstic molecular i en la recerca de noves opcions terapèutiques. Els resultats de la tesi estan estructurats en 2 articles: “LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació de marcadors moleculars d’expressió gènica importants en el procés metastàtic. 19 mostres aparellades de tumor primari de còlon i MH han estat hibridades en un microarray de cDNA (Affymetrix). S’obté un llistat de 1374 sondes diferencialment expressades de forma significativa entre tumors i metàstasis. S’ha creat una signatura metastàtica (algoritme de Golub) que consta de 7 gens específics de MH: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. La capacitat de pronòstic de MH d’aquesta signatura en tumors i en mucosa normal de còlon també ha estat avaluada, mitjançant RT‐PCR quantitativa. Segons un anàlisi de regressió logística univariant, els gens MS4A12, CYP1B1 i CLCA4 estan significativament sobreexpressats en tumors metastàtics (n=61) en comparació amb els no metastàtics (n=40). L’anàlisi estadístic Random Forest, a partir dels nivells d’expressió de MS4A12 i CYP1B1 (en tumors i en còlon normal), permet pronosticar disseminació al fetge amb una probabilitat d’encerts del 80%. Ambdós gens mostren major expressió gènica en el component estromal que en el tumoral quan s’analitzen mostres de microdissecció per captura làser. D’altra banda, s’ha desenvolupat un model murí per injecció intraesplènica de línies cel∙lulars humanes de CCR (KM12C i HCT116) capaces de metastatitzar específicament a fetge reproduint així el procés de disseminació en pacients. “ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació d’alteracions en la metilació de l’ADN específiques de MH. S’han utilitzat dues metodologies: l’AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) i l’array de metilació. En cap cas s’han trobat diferències de metilació entre tumors primaris i MH aparellades. Tot i això, s’ha validat mitjançant seqüenciació per bisulfit i corbes de melting dues bandes d’AUMA amb canvis de metilació recurrents (28 i 33% dels casos) entre mucosa normal de còlon i tumors, anomenades banda B (19q13.32) i banda C (16p13.3). Per limitar l’àrea afectada per aquests canvis de metilació, s’ha fet seqüenciació per bisulfit de les illes CpG veïnes a les bandes B i C concloent que es tracta d’alteracions poc extenses dins el genoma. L’anàlisi transcripcional dels gens propers amb l’array d’expressió (Affymetrix) ens indica que no hi ha regulació de l’expressió gènica per metilació dins una regió de fins a 2Mb lluny de les bandes d’AUMA. Tot i la manca de significació, la línia cel∙lular HCT116 desmetilada (tractament amb AZA i TSA) ha servit per analitzar una possible correlació entre la metilació de les bandes B/C i l’expressió de gens propers. La majoria de gens analitzats estaven sobreexpressats en la línia tractada. Les conclusions principals d’aquesta tesi són dues: ‐ S’ha obtingut una signatura metastàtica de 7 gens específics de MH de CCR. Dos d’aquests gens, MS4A12 i CYP1B1, tenen capacitat per pronosticar MH, fet de gran importància clínica. ‐ No s’han trobat canvis de metilació específics de MH indicant que els canvis epigenètics succeeixen en estadis inicials de la tumorigènesis. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide being liver metastasis (LM) a significant prognostic factor and the main cause of cancer related deaths. Despite of its clinical relevance, metastatic spread process is poorly understood. The aim of this study is to clarify the mechanisms of colorectal cancer LM discovering new molecular markers (transcriptional and epigenetic ones) with significant role in the metastatic process to improve its diagnostics, treatment and prevention. The results can be classified in 2 manuscripts: 1) LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER 19 paired subjects (colorectal tumor/LM) have been used in cDNA microarrays (Affymetrix) in order to identify specific LM genes. A metastatic signature of 7 specific liver metastasis related genes has been built: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. Two of them, MS4A12 and CYP1B1, have an important liver metastasis prognosis capability which could be very useful in clinics for CRC prognosis. 2) ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER Specific liver metastasis (LM) epigenetic alterations would be interesting for better dissemination process understanding. Two different methodologies have been used: AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) and methylation microarray. However, specific LM methylation changes have not been identified being, therefore, early events in adenoma‐carcinoma sequence.

DE LA TESI:La metàstasi és un procés histopatològic especialment complex per al seu estudi. Aquesta complexitat es deriva tant de la implicación de tots els nivells d'organització de l'organisme afectat (molecular, cel.lular, tisular, orgànic i sistèmic) com de l'alta diversitat inherent a cadascun d'ells. Una eina essencial de treball és la disposició de models cel.lulars que permetin tant l'estudi específic i puntual d'alguns aspectes del desenvolupament de la patologia com la seva integración en el conjunt del procés. A partir d'aquests principis estratègics hem disposat, pel desenvolupament d'aquest estudi, de dues línies cel.lulars d'adenocarcinoma de pulmó humà derivades d'una mateixa població parental (Inufusa et al., 1991). Aquestes línies, caracteritzades per una alta (HAL-8) i nul.la (HAL-24) capacitat metastàsica, proporcionen un model molt sòlid per a la validació dels resultats diferencials. És així que ens varem plantejar com a objectiu general la caracterització d'expressions diferencials que, de manera constitutiva o regulada, presentessin ambdós tipus cel.lulars. Donat que les cèl.lules HAL-8 sobreexposen l'antigen sialil-Lewis(x) dimèric en relació a les cèl.lules HAL-24, ens varem proposar com a primer objectiu caracteritzar l'expressió d'altres oligossacàrids fucosilats més relacionats amb la metàstasi i determinar el seu paper a l'adhesió d'aquestes cèl.lules tumorals a l'endoteli. Donades les diferències d'expressió que varem observar en algunes d'aquestes mol.lècules, ens varem plantejar l'estudi de l'expressió dels gens de les Fucosiltransferases del tipus alfa(1,3), enzims responsables de la seva síntesi. (Capítol I: "Enhaced expresión of alpha(1-3)-Fucosyltransferase genes correlates with E-selectin-mediated adhesion and metastasic potencial of human lung adenocarcinoma cells"). Un cop demostrat el paper clau del sialil-Lewis(x) a l'adhesió de les cel.lules HAL-8 així com la relació entre l'expressió dels gens de les Fucosiltransferases del tipus alfa(1,3) i la capacitat metastàsica d'aquestes cèl.lules, el següent objectiu plantejat va ser determinat si la sobreexpressió de determinades Fucosiltransferases alfa(1,2) modifica les propietats adhesives i el potencial colonitzador de pulmó de les cèl.lules no metastàtiques HAL-24 (Capítol II: "Overexpression of alpha(1,3)-fucosyltransferase VII is sufficient for the acquisition of lung colonization phenotype in human lung adenocarcinoma HAL-24Luc cells)".Caracteritzat el model d'adhesió a l'endoteli de les cèl.lules HAL-8 i HAL-24, i demostrat el paper de l'alfa(1,3)-Fucosiltransferasa VII en aquesta etapa de la metàstcasi, ens varem proposar estudiar la implicación de les metal.loproteases en la migración transendotelial de les cèl.lules metastàsiques d'adenocarcinoma de pulmó així com la regulació de la seva expressió tant per integrines com per la matriu extracel.lular (Capítol III: "Expressió de les metal.loprotesases de matriu i la regulació de la seva activitat a cèl.lules d'adenocarcinoma de pulmó humà)".Donat el caracter multiènic del desenvolupament de les metàstasis i l'interès en trobar gens responsables d'aquest procés, com a objectiu final ens varem plantejar l'anàlisi de l'expressió gènica diferencial de les cèl.lules HAL-8 i HAL-24 (Capítol IV: "Identification of semaphorin E gene expresión in metastasic human lung adenocarcinoma cells by mRNA differential display").

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.