INTRODUCTION. L'objectif de ce travail est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'adhésion leucocytaire au cours de la filtration sanguine. Les filtres sont conçus pour associer des phénomènes de tamisage et d'interaction avec des fibres synthétiques pour retenir les leucocytes et laisser passer les érythrocytes. MATERIEL ET METHODES. Afin de mieux étudier les mécanismes, nous avons réalisé deux modèles expérimentaux : le minifiltre et la chambre de perfusion. Les propriétés des leucocytes normaux et de lignée de cellules leucémiques ont été comparées en déterminant pour ces types cellulaires leur adhérence et le niveau d'expression des molécules d'adhérence par cytométrie en flux. Dans la chambre de perfusion, différents types de fibres ont été testés et l'adhésion des cellules analysée par vidéomicroscopie et analyse d'images. RESULTATS. Dans le minifiltre, nous avons pu démontrer que les leucocytes et les cellules leucémiques HL60 étaient retenues dans le filtre secondairement à une interaction entre les intégrines (CD11/CD18) et les fibres contenues dans le filtre. Le système de chambre à perfusion a permis l'étude de l'adhésion de différents types cellulaires à des fibres synthétiques chimiquement différentes. Les lignées HL60 en particulier induites par la vitamine D3 et les THP1 qui expriment le CD11/CD18 adhèrent significativement plus à deux types de fibres (PET, PI). CONCLUSION. La leucoréduction dans le filtre est en partie dépendante de l'adhérence aux fibres. L'adhérence est la conséquence d'une interaction entre les molécules d'adhésion leucocytaires et des molécules chimiques présentes sur les fibres. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour améliorer la performance et la sélectivité des filtres pour les produits sanguins.

Les organismes vivants sont en intime relation avec leur environnement et sont constamment influencés par de nombreux facteurs chimiques et physiques. Parmi les facteurs physiques présents dans notre environnement, les forces mécaniques, y compris la gravité, les radiations, dont les ultraviolets, et les champs électromagnétiques constituent les trois pôles principaux de nos travaux de doctorat. Des outils biologiques, cellulaires et moléculaires ont été développés afin dévaluer le rôle des RhoGTPases dans les altérations morphologiques, prolifératives et phénotypiques induites par la perte du vecteur gravité au cours de vols spatiaux. Au cours du vol de la capsule spatiale inhabitée FOTON-M3, nous avons pu mettre en évidence que la suppression de Rac1 par ARN interférentiel permettait de contrecarrer les effets délétères de la microgravité sur larchitecture du cytosquelette suggérant que cette molécule de signalisation participe à la réception et à la réactivité à la gravité. RhoA et Cdc42 ne semblent pas impliqués. Nous avons également développé un modèle expérimental dinduction de flux calcique par des peptides mimétiques de la matrice extracellulaire activant les intégrines destiné à être expérimenté au cours de vols paraboliques. Au cours de nos travaux visant à évaluer les effets biologiques des champs électromagnétiques, nous avons observé que les EMF de très basse fréquence (450µT-50Hz) naffectent ni les signaux calciques induits par des concentrations élevées de sérum ou des peptides mimétiques de la matrice extracellulaire, ni lexpression des gènes régulés par les UV-B. Ils sont cependant capables de soutenir les oscillations calciques induites par une concentration sub-optimale de sérum, sans toutefois réguler de manière évidente les voies de signalisation contrôlant la prolifération. Lirradiation par les UV-B dun grand nombre de cellules, primaires, immortalisées et tumorales induit, par épissage alternatif du préARNm du VEGF-A, lexpression dun nouveau variant, le VEGF111. Celui-ci est constitué de la combinaison des exons 1-4 et de lexon 8. Cette nouvelle forme de VEGF-A contient donc les sites de fixation aux VEGF-R1 et R-2 et est pro-angiogène in vitro sur les cellules endothéliales et les cellules souche embryonnaires et in vivo chez la souris. Labsence des exons 6 et 7 codant pour la liaison aux protéines de la matrice extracellulaire lui confère une diffusibilité tissulaire. Une de ses caractéristiques remarquable est sa résistance à la dégradation en raison de labsence du site de clivage par la plasmine et les MMPs. Ce nouveau variant est également induit par diverses substances génotoxiques dont les agents chimiothérapeutiques. Les mécanismes régulant lexpression du VEGF111 dépendent des voies de signalisation ATM/ATR, p53 et MAPKinases. La double personnalité de ce nouveau facteur pro-angiogène, néfaste par son induction potentielle au cours de traitements anti-cancéreux mais bénéfique par son utilisation dans le traitement de pathologies ischémiques particulièrement pertinente en cas dactivités protéolytiques élevées, ouvre un champ considérable dinvestigations. ----------------------------------------------------------------------------------------------------- Living organisms interact with their environment and are constantly influenced by various chemical and physical factors. Among the physical factors present in our environment, mechanical forces, including gravity, radiations, among which ultraviolet radiations, and electromagnetic fields constitute the three main poles of our research. Biological, cellular and molecular tools have been developed with the aim to evaluate the role of RhoGTPases in the morphological, proliferative and phenotypic alterations induced by the loss of gravitational field experienced during space flight. During the flight of the unmanned FOTON-M3 capsule, we have demonstrated that the suppression of Rac1 by small interference RNA was able to counteract the deleterious effects of microgravity on the cytoskeleton architecture. This suggests that this signaling molecule participates to the reception and reaction to gravity. RhoA and Cdc42 do not seem to be implicated. We have also developed an experimental model of induction of intracellular calcium ions fluxes by mimetic peptides of the extracellular matrix activating integrins to be used in parabolic flights. During our investigations aimed at evaluating the biological effects of electromagnetic fields, we observed that EMF of very low-frequency (450µT-50Hz) do not affect neither the calcium signals induced by high concentrations of serum or extracellular matrix mimetic peptides, nor the expression of genes regulated by UV-B. They are however able to sustain calcium oscillations induced by a sub-optimal concentration of serum but without disturbing the cellular proliferation rate. Irradiation by UV-B of a large number of cells, primary, immortalized and tumoral, induces, by alternative splicing of the VEGF-A pre-mRNA, the expression of a new variant, the VEGF111. This isoform is made of a combination of exons 1-4 and exon 8. This new VEGF-A variant contains therefore the binding sites to VEGF-R1 and R-2 and proved to be proangiogenic in vitro for endothelial and ES cells and in vivo in mice. The absence of exons 6 and 7 coding for the heparin binding sites confers it with tissue diffusibility. One of its striking characteristics is its resistance to degradation due to the absence of the cleavage site by plasmin and MMPs. This new variant is also induced by a series of genotoxic agents, including chemotherapeutic drugs. The mechanisms controlling the VEGF111 expression depend on the ATM/ATR, p53 and MAPKinases signaling pathways. The dual faces of VEGF111, detrimental by its potential induction during anti-cancer therapy but beneficial by its use for managing ischemic pathologies, mostly relevant when associated with high proteolytic activities, opens a considerable field of investigations.

DE LA TESI:La metàstasi és un procés histopatològic especialment complex per al seu estudi. Aquesta complexitat es deriva tant de la implicación de tots els nivells d'organització de l'organisme afectat (molecular, cel.lular, tisular, orgànic i sistèmic) com de l'alta diversitat inherent a cadascun d'ells. Una eina essencial de treball és la disposició de models cel.lulars que permetin tant l'estudi específic i puntual d'alguns aspectes del desenvolupament de la patologia com la seva integración en el conjunt del procés. A partir d'aquests principis estratègics hem disposat, pel desenvolupament d'aquest estudi, de dues línies cel.lulars d'adenocarcinoma de pulmó humà derivades d'una mateixa població parental (Inufusa et al., 1991). Aquestes línies, caracteritzades per una alta (HAL-8) i nul.la (HAL-24) capacitat metastàsica, proporcionen un model molt sòlid per a la validació dels resultats diferencials. És així que ens varem plantejar com a objectiu general la caracterització d'expressions diferencials que, de manera constitutiva o regulada, presentessin ambdós tipus cel.lulars. Donat que les cèl.lules HAL-8 sobreexposen l'antigen sialil-Lewis(x) dimèric en relació a les cèl.lules HAL-24, ens varem proposar com a primer objectiu caracteritzar l'expressió d'altres oligossacàrids fucosilats més relacionats amb la metàstasi i determinar el seu paper a l'adhesió d'aquestes cèl.lules tumorals a l'endoteli. Donades les diferències d'expressió que varem observar en algunes d'aquestes mol.lècules, ens varem plantejar l'estudi de l'expressió dels gens de les Fucosiltransferases del tipus alfa(1,3), enzims responsables de la seva síntesi. (Capítol I: "Enhaced expresión of alpha(1-3)-Fucosyltransferase genes correlates with E-selectin-mediated adhesion and metastasic potencial of human lung adenocarcinoma cells"). Un cop demostrat el paper clau del sialil-Lewis(x) a l'adhesió de les cel.lules HAL-8 així com la relació entre l'expressió dels gens de les Fucosiltransferases del tipus alfa(1,3) i la capacitat metastàsica d'aquestes cèl.lules, el següent objectiu plantejat va ser determinat si la sobreexpressió de determinades Fucosiltransferases alfa(1,2) modifica les propietats adhesives i el potencial colonitzador de pulmó de les cèl.lules no metastàtiques HAL-24 (Capítol II: "Overexpression of alpha(1,3)-fucosyltransferase VII is sufficient for the acquisition of lung colonization phenotype in human lung adenocarcinoma HAL-24Luc cells)".Caracteritzat el model d'adhesió a l'endoteli de les cèl.lules HAL-8 i HAL-24, i demostrat el paper de l'alfa(1,3)-Fucosiltransferasa VII en aquesta etapa de la metàstcasi, ens varem proposar estudiar la implicación de les metal.loproteases en la migración transendotelial de les cèl.lules metastàsiques d'adenocarcinoma de pulmó així com la regulació de la seva expressió tant per integrines com per la matriu extracel.lular (Capítol III: "Expressió de les metal.loprotesases de matriu i la regulació de la seva activitat a cèl.lules d'adenocarcinoma de pulmó humà)".Donat el caracter multiènic del desenvolupament de les metàstasis i l'interès en trobar gens responsables d'aquest procés, com a objectiu final ens varem plantejar l'anàlisi de l'expressió gènica diferencial de les cèl.lules HAL-8 i HAL-24 (Capítol IV: "Identification of semaphorin E gene expresión in metastasic human lung adenocarcinoma cells by mRNA differential display").

Bien que la description qualitative et phénoménologique de la migration cellulaire soient décrites de façon minutieuse dans son approche holistique, des mécanismes de base et connus depuis longtemps n’ont pas encore été explorés quantitativement avec une approche "bottom-up". Un de ces exemples est le comportement migratoire en deux dimensions des lym- phocytes T effecteurs humains. Alors que leur comportement in vivo est déjà connu depuis longtemps et décrit qualitativement, une approche quantitative in vitro offre de nombreuses perspectives. Les interactions des intégrines LFA-1 et VLA-4 avec leurs ligands respectifs ICAM-1 et VCAM-1 ont déjà été étudiées et sont les principales molécules impliquées dans la migration des lymphocytes T effecteurs. Du fait de leur importance dans l’organisation de la mobilité, ces deux protéines sont les principaux objets d’étude de cette thèse. La majorité des travaux précédents ont été réalisés en observant les lymphocytes T dans des tissus vi- vants dont la composition et la densité des molécules d’adhésion ne peuvent ni être déterminées ni contrôlées de façon précise. Nous avons developpés des substrats artifi- ciels permettant d’imiter et de contrôler ces caractéristiques adhésives afin d’examiner et de relier les propriétés physiques des cellules tels que la vitesse ou l’index de mi- gration orientée, avec une réponse cellulaire donnée ainsi que d’associer un type de mouvement avec des interactions intégrines-ligands spécifiques. Pour aller plus loin, nous avons à nouveau analysé la conformation des intégrines puis l’avons modulé pour altérer leur affinité et changer les propriétés précédemment décrites. / The ability of T-lymphocytes to migrate to sites of inflammation towards all different types of tissues based on the interplay between biochemical and mechanical signaling is unique among human cells and underlines the importance of their complex motility apparatus relying on multiple stimuli. A crucial part within the leukocyte adhesion cascade is the firm attachment of the immune cell to the inner wall of the blood vessel and the subsequent migration along its surface until crossing the endothelial cell barrier. These migrational steps are guided not only by the shear stress to which the cell is exposed to by the flow of blood, but also by expression of adhesion molecules, the most important among them are ICAM-1 and VCAM-1 and their integrin counterparts LFA-1 and VLA-4, expressed by the immune cell. These proteins are crucial not only in a mechanically anchoring sense, but they also play a part in an intracellular signaling process leading to a change in migrational direction, overall cell affinity and phenotype. Few is known about how all components shape the movement behaviour on a quantitative level, raising questions about hierarchy, affinity and density of the involved proteins. Besides enhancing the general knowledge of the mechanisms of T-cell migration, the role of ICAM-1 and VCAM-1 in various diseases makes this study a promising endeavour. The approach taken in this thesis is to dissect and recompose the important adhesion molecules on a laminal flow chamber to link the cell’s response to them to specific movement properties and answer the questions addressed above.

L'ICAP-1 est impliqué dans la dynamique de l'intégrine et la génération de force en contrôlant l'endocytose de l'intégrine grâce à la scission dépendant de nm23 des puits endocycliques recouverts de chlatrine.L'ICAP-1 a été identifié comme un partenaire spécifique de l'intégrine b1 (Degani et al., 2002, Zhang et Hemler, 1999). Nous avons déjà montré que l'ICAP-1 est impliqué dans la réponse mécanisée aux cellules et la différenciation cellulaire d'une manière dépendante de l'intégrine b1 (Bouvard et al., 2007; Brunner et al., 2011; Faurobert et al., 2013; Millon-Frémillon et al. , 2008; Renz et al., 2015). Cependant, comme ICAP-1 est également capable d'adapter la migration cellulaire en réponse à la rigidité du substrat d'une manière indépendante de la β1-intégrine (Bouin et al., 2017), nous avons spéculé sur un rôle plus général de l'ICAP-1 dans l'adhésion cellulaire et dynamique d'adhérence focale. Pour cela, nous avons créé un environnement cellulaire où l'intégrine b1 et / ou l'ICAP-1 étaient absentes en utilisant quatre lignées cellulaires: les ostéoblastes WT, les cellules ostéoblastes KO de l'intégrine b1, les cellules ostéoblastes KAP ICAP-1 et les cellules ostéoblastes double KO b1 / ICAP-1 afin de surveiller le comportement de l'intégrine b3. Comme prévu, l'épuisement de l'intégrine b1 est associé à la perte d'étalement cellulaire et à la génération de force selon la mesure de la microscopie par force de traction. De manière surprenante, la suppression supplémentaire de ICAP-1 (b1 intégrine et ICAP-1 KO) conduit à la restauration de l'étalement cellulaire et de la génération de force qui dépend de l'intégrine b3. Ces forces médiées par l'intégrine b3 sont corrélées avec la diffusion lente de l'intégrine b3 dans les sites d'adhésion et le renouvellement lent de l'adhésion focale contenant l'intégrine b3 (FRAP / TIRF / vidéomicroscopie). Nous avons abordé la question de savoir si ICAP-1 pourrait réguler l'endocytose de l'intégrine b3 puisque ICAP-1 interagit avec nm23-H2 (Fournier et al., 2002), un nucléoside diphosphate kinases (NDPK) impliqué dans l'endocytose à médiation par dynamine en produisant du GTP à travers l'adénosine triphosphate (ATP) de conversion du diphosphate de guanosine (PIB) (Boissan et al., 2014). Nous montrons que la suppression de nm23 ou de dynamine ou de chlatrine dans les cellules épuisées dans l'intégrine b1 est capable d'imiter la perte combinée de l'intégrine b1 et de l'ICAP-1 en rétablissant l'étalement cellulaire, la génération de force et la dynamique de l'intégrine b3. Pour confirmer l'implication de l'ICAP-1 dans l'endocytose de l'intégrine b3, nous montrons que l'absorption de l'anticorps de l'intégrine b3 est efficacement bloquée dans les cellules épuisées dans ICAP-1. Nos résultats suggèrent que ICAP-1 pourrait être impliqué dans la dynamique de l'intégrine et la génération de force en contrôlant l'endocytose de l'intégrine grâce à la scission dépendant de nm23 des puits endocytaires de la couche de chlatrine. / ICAP-1 is involved in integrin dynamics and force generation by controlling integrin endocytosis through nm23-dependent scission of endocytic chlatrin coated pits.ICAP-1 has been identified as a specific partner of b1 integrin (Degani et al., 2002; Zhang and Hemler, 1999). We have previously shown that ICAP-1 is involved in cell mechanoresponse and cell differentiation in a b1 integrin dependent manner (Bouvard et al., 2007; Brunner et al., 2011; Faurobert et al., 2013; Millon-Frémillon et al., 2008; Renz et al., 2015). However, as ICAP-1 is also able to adapt cell migration in response to substrate stiffness in a β1-integrin-independent manner (Bouin et al., 2017), we speculated on a more general role of ICAP-1 in cell adhesion and focal adhesion dynamics. For this purpose we have created cellular environment where b1 integrin and/or ICAP-1 were absent by using four cell lines: WT osteoblast, b1 integrin KO osteoblast cells, ICAP-1 KO osteoblast cells and double KO b1/ICAP-1 osteoblast cells in order to monitor b3 integrin behavior. As expected, depletion of b1 integrin is associated with the loss of cell spreading and force generation according traction force microscopy measurement. Surprisingly, the supplementary deletion of ICAP-1 (b1 integrin and ICAP-1 KO) leads to restoration of cell spreading and force generation which are dependent on b3 integrin. These b3 integrin-mediated forces are correlated with slow diffusion of b3 integrin within adhesion sites and slow turnover of b3 integrin containing focal adhesion (FRAP/TIRF/videomicroscopy). We addressed the question whether ICAP-1 might regulate b3 integrin endocytosis since ICAP-1 interacts with nm23-H2 (Fournier et al., 2002), a nucleoside diphosphate kinases (NDPKs) involved in dynamin-mediated endocytosis by producing GTP through adenosine triphosphate (ATP)–driven conversion of guanosine diphosphate (GDP) (Boissan et al., 2014). We show that the deletion of either nm23 or dynamin or chlatrin in cells depleted in b1 integrin is able to mimic the combined loss of b1 integrin and ICAP-1 by restoring cell spreading, force generation and b3 integrin dynamics. To confirm the involvement of ICAP-1 in b3 integrin endocytosis, we show that the b3 integrin antibody uptake is efficiently blocked in cells depleted in ICAP-1. Our results suggest that ICAP-1 might be involved in integrin dynamics and force generation by controlling integrin endocytosis through nm23-dependent scission of endocytic chlatrin coated pits.

Les microglies sont des cellules hématogène mais prennent place dans le système nerveux central (SNC) au cours du développement embryonnaire pour constituer la population résidente des cellules immunitaires. Elles sont les médiateurs crucials du bon développement et de l'entretien des réseaux de neurones dans le SNC. De nombreux aspects de la physiologie microgliale et les mécanismes qui sous-tendent leurs fonctions au cours du développement embryonnaire du cerveau sont encore largement méconnues. Cette thèse de doctorat porte sur la migration des cellules microgliales au cours du développement embryonnaire du cortex et elle débouche sur trois grandes conclusions. (1) Les cellules microgliales embryonnaires in situ sont très dynamiques et adaptent leur phénotype à leur environnement local. (2) La vitesse de migration des microglies ex vivo dépend des intégrines beta1 qui exercent des fonctions à la fois inhibitrices et promotrices sur la migration selon l'âge embryonnaire. (3) Les microglies jouent probablement un rôle dans l'étiologie des troubles du développement neurologique, mais il faudrait que les futures recherches se concentrent sur le dysfonctionnement des microglies plutôt que sur leur activation immunitaire classique. / Microglia are blood-borne cells but take up residence in the central nervous system (CNS) during embryonic development to constitute the resident pool of immune cells. They are crucial mediators of the healthy development and maintenance of neural networks in the CNS. Many aspects of the physiology of microglia and the mechanisms underpinning their tasks during embryonic brain development are still unresolved. This doctoral dissertation focuses on migration of microglial cells during embryonic cortical development. All together, this dissertation brings forwards three major conclusions. (1) In situ embryonic microglia are highly dynamic cells that adapt their phenotype to their local environment. (2) Microglial migration speed ex vivo is dependent on β1 integrins that exert both migration promoting and inhibiting functions which are age-specifically regulated. (3) Microglia likely play a role in the etiology of neurodevelopmental disorders, but further research should focus on microglia dysfunction rather than classical microglial immune activation.

L’originalité du sujet de thèse, initié lors du stage de M2R consiste à mesurer les propriétés de mobilité des molécules d’adhérence de cellules mécaniquement contrôlées. Le contrôle des propriétés géométriques et mécaniques du substrat seront fixées grace a l'utilisation d'une lamelle de verre comprenant des motifs de matrice extracellulaire. Nous utiliserons plusieurs techniques de mesures de mobilités, permettant d'accèder à des échelles temporelles d'étude différentes ; La FCS permettant d'accèder au dynamique rapide ; Le FRAP pour accèder au dynamique lente. / The originality of the project, initiated during the M2 internship, consist to measure the mobility of adhesive molecules of cells mechanically controlled.This control will be fixed thanks to a coverslip with adhesive protein pattern. We will next use different technics of mobility measurement to have information about different time scale : FCS for fast dynamics, FRAP for slow dynamics.