Influenza A virus (IAV) replication and transcription occur in the host cell nucleus; a feature which means both the viral genome (vRNA) and mRNA must be exported from the nucleus to the cytoplasm. The mechanism by which vRNA nuclear export is achieved has been well characterised, but how viral mRNAs are exported is poorly understood. The cellular NXF1-dependent mRNA export pathway has been shown to be involved in the export of some viral mRNAs, but how they are recruited to this pathway is unknown. Prior work from our laboratory showed that segment 7 mRNA was inefficiently exported to the cytoplasm in a sub-viral ‘minireplicon’ system, providing the first indication that there were viral requirements for IAV mRNA nuclear export. Further addition of individual viral polypeptides was tested and the effect on segment 7 mRNA export was analysed by fluorescent in situ hybridization (FISH) and confocal microscopy. This identified the NS1 protein as the viral factor required for efficient segment 7 nuclear export. Mutational studies on NS1 were carried out to unveil the mechanistic role of this protein in viral mRNA nuclear export, by plasmid transfection as well as in the context of recombinant viruses. These approaches indicated that both functional domains of NS1 were necessary to preserve the mRNA export function. Furthermore, these mutant proteins were used to examine the association between NS1 and the NXF1-dependent pathway in the context of mRNA nuclear export. Protein-protein and protein-RNA binding assays indicated that interactions between NXF1 and NS1, and NXF1 and segment 7 mRNA were necessary, but not sufficient to promote segment 7 viral mRNA export. Lastly, the role of NS1 protein in the nuclear export of viral mRNAs from other genome segments was studied. The intracellular localisation of most viral mRNAs was not affected by the absence of NS1 or the presence of an export-incompetent NS1 mutant protein. However, segment 4 mRNA exhibited a similar phenotype to segment 7 mRNA in showing a dependence on NS1 for efficient nuclear export. Overall, the results presented in this dissertation suggest that NS1 acts as an adaptor protein between the viral RNA synthesis machinery and cellular export pathway. This provides deeper insights for the characterization of a recently identified function of the IAV NS1 protein, of being required for the efficient nuclear export of mRNA from “late” kinetic class viral genes.

Existeixen moltes evidències que indiquen que les diferents funcions descrites de p21(Cip1) es deuen, en certa part, a la seva localització intracel·lular. Mentre que la p21(Cip1) nuclear inhibeix la proliferació cel·lular, la p21(Cip1) citoplasmàtica és capaç de regular la supervivència i la mobilitat cel·lular. El fet que les funcions de p21(Cip1) en cada un dels compartiments cel·lulars tinguin papers oposats fa que sigui d'un gran interès l'estudi dels canvis de localització de p21(Cip1) i els mecanismes que regulen aquesta translocació, així com les possibles vies que p21(Cip1) pugui fer servir per a localitzar-se en els diferents compartiments cel·lulars.En aquesta tesi s'han realitzat dos estudis diferenciats, però amb un objectiu comú ja que tots dos es centren en l'anàlisi dels mecanismes reguladors de la localització cel·lular de p21(Cip1). En la primera part d'aquesta tesi, observem la importància de la fosforilació de p21(Cip1) per part de la proteïna cinasa C (PKC). Aquesta fosforilació té lloc en el residu Ser153, molt proper a la senyal de localització nuclear (NLS) de la p21(Cip1) i es capaç de regular la localització cel·lular de p21(Cip1). Aquests resultats, juntament amb altres treballs, demostren que la fosforilació de p21(Cip1) afavoreix la seva localització en el citoplasma. Diferents aproximacions experimentals ens van permetre observar com aquesta fosforilació inhibeix la unió entre p21(Cip1) i CaM. D'aquest primer treball se'n deriva un model de regulació de la localització cel·lular de p21(Cip1) en el qual la unió a CaM i la fosforilació per PKC tenen papers oposats. D'una banda, la unió de p21(Cip1) a CaM inhibeix la seva fosforilació per part de PKC i afavoreix la localització de p21(Cip1) en el nucli. D'altra banda, la fosforilació de p21(Cip1) en el residu Ser153 indueix una localització citoplasmàtica de p21(Cip1). Treballs posteriors ens van permetre observar com la sortida de p21(Cip1) del nucli cap al citoplasma també està regulada. Després del dany al DNA, els nivells cel·lulars de p21(Cip1) incrementen, especialment en el nucli, per tal d'assegurar una aturada del cicle cel·lular. Observem com en resposta al dany al DNA, p21(Cip1) s'acumula no només en el nucleoplasma de les cèl·lules sinó que també s'acumula en el nuclèol. En les cèl·lules danyades els components nucleolars es troben desorganitzats i el nuclèol perd els contactes amb l'embolcall nuclear i presenta unes estructures esfèriques en el seu interior. La p21(Cip1) present en les estructures esfèriques del nuclèol està en un equilibri dinàmic amb la p21(Cip1) del nucleoplasma i la presència de p21(Cip1) en aquestes estructures correlaciona amb una inhibició de l'export p21(Cip1) cap al citoplasma. Aquests resultats donen suport a l'existència d'una via d'export de proteïnes nuclears a través del nuclèol, semblant a la que intervé en l'export de ribosomes, la qual es veuria afectada amb la desestructuració dels nuclèols en resposta al dany cel·lular. A més, amb els resultats obtinguts no descartem la possibilitat que p21(Cip1) pugui ser modificada en el nuclèol ja que en resposta al dany al DNA també s'hi localitzen altres proteïnes implicades en diferents vies de modificació post-traduccional. Així doncs, l'acumulació nuclear de p21(Cip1) en resposta al dany al DNA no es deu únicament a un increment de la seva transcripció sinó que aquesta acumulació també es deguda a la inhibició de la sortida de p21(Cip1) cap al citoplasma a través del nuclèol.En conclusió, tant l'entrada com la sortida de la p21(Cip1) del nucli és un mecanisme altament regulat que farà que la localització de p21(Cip1) pugui variar en diferents situacions fisiològiques de la cèl·lula. Aquest fet és de gran importància per al correcte funcionament cel·lular ja que com hem descrit anteriorment, p21(Cip1) és una proteïna amb funcions oposades depenent de la seva localització intracel·lular: oncogènica al citoplasma i supressora de tumors al nucli. / It is well known that p21(Cip1) is a protein with a dual function in oncogenesis depending mainly on its intracellular localization: tumor suppressor in the nucleus and oncogenic in the cytoplasm. The importance of p21(Cip1) cellular localization indicates that it has to be precisely regulated.On one side we observed the importance of p21(Cip1) phosphorylation by PKC inducing its cytoplasmic localization. PKC phosphorylates p21(Cip1) at Ser 153 and when phosphorylated, p21(Cip1) can not bind to CaM. From this study we conclude that CaM and PKC have an opposite role in the regulation of p21(Cip1) localization: CaM binding to p21(Cip1) prevents its phosphorylation by PKC at Ser153 and consequently allows its nuclear localization; while when phosphorylated at Ser153, p21(Cip1) is located at the cytoplasm.On the other side the export of p21(Cip1) from the nucleus to the cytoplasm is also regulated. After DNA damage, p21(Cip1) increases and accumulates in the nucleus to ensure cell cycle arrest. We observed that after DNA damage p21(Cip1) accumulates not only in the nucleoplasm but also in the disrupted nucleoli. In damaged cells the nucleolar components are disorganized and nucleoli have lost their contacts with the nuclear envelope and appear with spherical structures inside. The nucleolar p21(Cip1) forms a dynamic equilibrium between the nucleolus and the nucleoplasm and correlates with the inhibition of p21(Cip1) nuclear export. This result proves the existence of a nucleolar export route to the cytoplasm for p21(Cip1) similar to the one described for the ribosome export. Moreover, the results obtained suggested that p21(Cip1) could be modified in the nucleolus in response to DNA damage as different proteins involved in post-translation modifications also localize in the nucleoli after the damage. Thus, after DNA damage, p21(Cip1) accumulates in the nucleus due to an increase in its transcription and due to an inhibition of its export to the cytoplasm.All this results together indicate the importance of p21(Cip1) localization depending on the cellular context and that its localization is precisely regulated by different pathways.

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.