Per aprofundir en les causes genètiques de l’anèmia de Fanconi (FA) i la susceptibilitat al càncer de mama (BrCa), així com en els mecanismes moleculars de reparació del dany al DNA per part de la via de senyalització FA/BrCa, s’ha dut a terme un cribatge massiu d’interaccions proteïna-proteïna per 34 components involucrats en aquesta via. Aquest estudi ha identificat 25 noves interaccions d’alta fiabilitat, la majoria de les quals estan involucrades en la regulació del cicle cel•lular o la resposta al dany al DNA. Algunes d’aquestes interaccions han estat validades mitjançant estudis de co-immunoprecipitació endògena i sobreexpressió en cèl•lules de mamífer. En aquesta tesi doctoral hem caracteritzat la nova interacció entre FANCN/PALB2 ¡ MORF4L1/MRG15. S’han realitzat estudis bioquímics i funcionals amb la finalitat de caracteritzar-la tan molecularment com funcionalment en cèl•lules d’humans, de ratolí i Caenorhabditis elegans. Els resultats obtinguts ens permeten dibuixar un possible mòdul funcional entre BRCA2, PALB2, RAD51 i RPA1 que suggereixen una implicació de MRG15 en la reparació dels trencaments de doble cadena (DSB) en el DNA. Els nostres resultats no mostren alteracions patogèniques de MORF4L1/MRG15 en els pacients FA amb mutació desconeguda. Pel que fa a l’estudi de dos variants genètiques comunes en el locus MORF4L1, tampoc s’observa una associació significativa amb el risc a càncer de mama entre els portadors de mutació BRCA1 i BRCA2; tot i que s’observa una tendència entre els portadors de mutacions BRCA2. És per aquest motiu, que serà necessari un anàlisi amb sèries de portadors més grans. / Towards a full model of the molecular network altered in Fanconi anemia and breast cancer Proteins encoded by Fanconi anemia (FA) and/or breast cancer (BrCa) susceptibility genes cooperate in a common DNA damage repair signaling pathway. There are fiveteen FA complementation groups (FANCs) that encode for proteins of this pathway and three of these genes overlap between FA and BrCa. With the objective to gain deeper insight into this pathway and its influence on cancer risk, we search for novel components through protein physical interaction screens. Protein physical interactions were screened using the yeast two-hybrid system (Y2H). Novel interactions were validated through co-immunoprecipitation and co-affinity purification assays. A previously identified co-purifying protein with PALB2 was indentified MRG15 (MORF4L4 gene). Biochemical and functional assays were performed to characterize the molecular interaction in human, mouse and Caenorhabditis elegans. Results obtanined draw molecular and functional relationships with BRCA2, RAD51 and RPA that suggest a role for MRG15 in the repair of DNA double-strand breaks. Mrg15 deficient murine embryonic fibroblast showed intermediate sensitivity to γ-radiation relative to controls and impaired Rad51 foci formation. No alterations or mutations were identified for MORF4L1 in unclassified FA patients and BrCa familial cases. However, a potential modifier effect for a common genetic variation in MORF4L1 can not be ruled out among BRCA2 mutation carriers.

Existeixen moltes evidències que indiquen que les diferents funcions descrites de p21(Cip1) es deuen, en certa part, a la seva localització intracel·lular. Mentre que la p21(Cip1) nuclear inhibeix la proliferació cel·lular, la p21(Cip1) citoplasmàtica és capaç de regular la supervivència i la mobilitat cel·lular. El fet que les funcions de p21(Cip1) en cada un dels compartiments cel·lulars tinguin papers oposats fa que sigui d'un gran interès l'estudi dels canvis de localització de p21(Cip1) i els mecanismes que regulen aquesta translocació, així com les possibles vies que p21(Cip1) pugui fer servir per a localitzar-se en els diferents compartiments cel·lulars.En aquesta tesi s'han realitzat dos estudis diferenciats, però amb un objectiu comú ja que tots dos es centren en l'anàlisi dels mecanismes reguladors de la localització cel·lular de p21(Cip1). En la primera part d'aquesta tesi, observem la importància de la fosforilació de p21(Cip1) per part de la proteïna cinasa C (PKC). Aquesta fosforilació té lloc en el residu Ser153, molt proper a la senyal de localització nuclear (NLS) de la p21(Cip1) i es capaç de regular la localització cel·lular de p21(Cip1). Aquests resultats, juntament amb altres treballs, demostren que la fosforilació de p21(Cip1) afavoreix la seva localització en el citoplasma. Diferents aproximacions experimentals ens van permetre observar com aquesta fosforilació inhibeix la unió entre p21(Cip1) i CaM. D'aquest primer treball se'n deriva un model de regulació de la localització cel·lular de p21(Cip1) en el qual la unió a CaM i la fosforilació per PKC tenen papers oposats. D'una banda, la unió de p21(Cip1) a CaM inhibeix la seva fosforilació per part de PKC i afavoreix la localització de p21(Cip1) en el nucli. D'altra banda, la fosforilació de p21(Cip1) en el residu Ser153 indueix una localització citoplasmàtica de p21(Cip1). Treballs posteriors ens van permetre observar com la sortida de p21(Cip1) del nucli cap al citoplasma també està regulada. Després del dany al DNA, els nivells cel·lulars de p21(Cip1) incrementen, especialment en el nucli, per tal d'assegurar una aturada del cicle cel·lular. Observem com en resposta al dany al DNA, p21(Cip1) s'acumula no només en el nucleoplasma de les cèl·lules sinó que també s'acumula en el nuclèol. En les cèl·lules danyades els components nucleolars es troben desorganitzats i el nuclèol perd els contactes amb l'embolcall nuclear i presenta unes estructures esfèriques en el seu interior. La p21(Cip1) present en les estructures esfèriques del nuclèol està en un equilibri dinàmic amb la p21(Cip1) del nucleoplasma i la presència de p21(Cip1) en aquestes estructures correlaciona amb una inhibició de l'export p21(Cip1) cap al citoplasma. Aquests resultats donen suport a l'existència d'una via d'export de proteïnes nuclears a través del nuclèol, semblant a la que intervé en l'export de ribosomes, la qual es veuria afectada amb la desestructuració dels nuclèols en resposta al dany cel·lular. A més, amb els resultats obtinguts no descartem la possibilitat que p21(Cip1) pugui ser modificada en el nuclèol ja que en resposta al dany al DNA també s'hi localitzen altres proteïnes implicades en diferents vies de modificació post-traduccional. Així doncs, l'acumulació nuclear de p21(Cip1) en resposta al dany al DNA no es deu únicament a un increment de la seva transcripció sinó que aquesta acumulació també es deguda a la inhibició de la sortida de p21(Cip1) cap al citoplasma a través del nuclèol.En conclusió, tant l'entrada com la sortida de la p21(Cip1) del nucli és un mecanisme altament regulat que farà que la localització de p21(Cip1) pugui variar en diferents situacions fisiològiques de la cèl·lula. Aquest fet és de gran importància per al correcte funcionament cel·lular ja que com hem descrit anteriorment, p21(Cip1) és una proteïna amb funcions oposades depenent de la seva localització intracel·lular: oncogènica al citoplasma i supressora de tumors al nucli. / It is well known that p21(Cip1) is a protein with a dual function in oncogenesis depending mainly on its intracellular localization: tumor suppressor in the nucleus and oncogenic in the cytoplasm. The importance of p21(Cip1) cellular localization indicates that it has to be precisely regulated.On one side we observed the importance of p21(Cip1) phosphorylation by PKC inducing its cytoplasmic localization. PKC phosphorylates p21(Cip1) at Ser 153 and when phosphorylated, p21(Cip1) can not bind to CaM. From this study we conclude that CaM and PKC have an opposite role in the regulation of p21(Cip1) localization: CaM binding to p21(Cip1) prevents its phosphorylation by PKC at Ser153 and consequently allows its nuclear localization; while when phosphorylated at Ser153, p21(Cip1) is located at the cytoplasm.On the other side the export of p21(Cip1) from the nucleus to the cytoplasm is also regulated. After DNA damage, p21(Cip1) increases and accumulates in the nucleus to ensure cell cycle arrest. We observed that after DNA damage p21(Cip1) accumulates not only in the nucleoplasm but also in the disrupted nucleoli. In damaged cells the nucleolar components are disorganized and nucleoli have lost their contacts with the nuclear envelope and appear with spherical structures inside. The nucleolar p21(Cip1) forms a dynamic equilibrium between the nucleolus and the nucleoplasm and correlates with the inhibition of p21(Cip1) nuclear export. This result proves the existence of a nucleolar export route to the cytoplasm for p21(Cip1) similar to the one described for the ribosome export. Moreover, the results obtained suggested that p21(Cip1) could be modified in the nucleolus in response to DNA damage as different proteins involved in post-translation modifications also localize in the nucleoli after the damage. Thus, after DNA damage, p21(Cip1) accumulates in the nucleus due to an increase in its transcription and due to an inhibition of its export to the cytoplasm.All this results together indicate the importance of p21(Cip1) localization depending on the cellular context and that its localization is precisely regulated by different pathways.

The aim of this thesis is the characterization of a protein involved in apoptosis. Our group has identified an early step common to different forms of intrinsic apoptosis stimuli. This step requires de novo synthesis of a novel Cyclin, Cyclin O, that upon apoptosis induction in lymphoid cells forms active complexes, primarily with Cdk2. Cyclin O expression precedes glucocorticoid and gamma radiation-induced apoptosis in vivo in mouse thymus and its overexpression induces apoptosis in cultured cells. Knocking down the endogenous expression of Cyclin O by shRNA leads to the inhibition of glucocorticoid and DNA damage-induced apoptosis while leaving CD95 death receptor mediated apoptosis intact. This data demonstrates that apoptosis induction in lymphoid cells is one of the physiological roles of Cyclin O and it does not act by perturbing a normal cellular process such as the cell cycle. In addition we have identified c-Myb a substrate of Cdk2-Cyclin O complexes and we show that c-Myb is downregulated during apoptosis of lymphoid cells. / L'objectiu d'aquesta tesi és la caracterització d'una proteïna involucrada en l'apoptosi. El nostre grup ha identificat un pas primerenc comú en diversos estímuls apoptòtics de la ruta intrínseca. Aquest pas requereix la síntesi de novo d'una nova Ciclina, Ciclina O, que quan s'indueix apoptosi en cèl·lules limfoides forma complexes actius majoritàriament amb Cdk2. L'expressió de la Ciclina O és prèvia a l'apoptosi induïda per glucocorticoids i radiació gamma i la seva sobreexpressió indueix apoptosi en cultius cel·lulars. La baixada dels nivells d'expressió de la Ciclina O endògena amb shRNA provoca una inhibició de l'apoptosi induïda per glucocorticoids o agents que danyen el DNA, mentre que l'apoptosi mediada pel receptor CD95 es manté intacta. Aquests resultats demostren que la inducció d'apoptosi en cèl·lules limfoides és una de les funcions fisiològiques de la Ciclina O i que no es deu a una pertorbació de processos cel·lulars normals com ara el cicle cel·lular. A més a més, hem identificat c-Myb com a substrat dels complexes Cdk2-Ciclina O i demostrem que els nivells de c-Myb baixen durant l'apoptosis de cèl·lules limfoides.