Les phosphatases CDC25 jouent un rôle important dans la progression du cycle cellulaire. En outre, une surexpression des CDC25 a été rapportée dans de nombreux cancers, notamment dans le cancer du sein, et est souvent corrélée à un pronostic défavorable. Les CDC25 sont constituées de trois isoformes : A, B et C codées par des gènes distincts, tous trois soumis à un mécanisme d’épissage alternatif. Quelques études ont suggéré que certains variants d’épissage de CDC25 pourraient être plus impliqués dans les cancers que d’autres, mais aucune étude de ce type n’a jusqu’à présent été menée dans le cancer du sein. Le premier aspect de cette étude, à visée clinique, consiste donc en l’évaluation de la proportion de différents variants d’épissage de CDC25 dans le cancer du sein, dans l’optique de développer un nouvel outil pronostique. Cette étude a été réalisée sur deux modèles. D’une part, différentes lignées cellulaires cancéreuses mammaires ont été caractérisées concernant l’expression des variants de CDC25 grâce à la mise au point d’une méthode de RT-PCR quantitative inédite. De manière intéressante, nous avons observé une surexpression des transcrits A2 et B2 et une augmentation du rapport C5/C1 dans les cellules résistantes aux traitements anticancéreux, laissant supposer un lien entre l’expression de ces variants et le phénotype de résistance. D’autre part, cette étude a été étendue à la détermination de l’expression des variants de CDC25 dans des tissus mammaires tumoraux par comparaison à celle des tissus péritumoraux appariés. Les résultats de PCR quantitative obtenus pour les 75 paires de tissus testées ont mis en évidence une surexpression de CDC25A dans 64% des tumeurs, principalement due au variant A1 (69%) ; de CDC25B dans 55% des tumeurs, en partie liée à l’expression des variants B1 et B2 (47% et 21% respectivement) ; et de CDC25C dans 75% des tumeurs, le variant C5 étant clairement plus impliqué que C1 (surexpression dans 86% et 43% des tumeurs respectivement). Nous avons finalement pu établir des corrélations entre l’expression des transcrits CDC25 et certaines caractéristiques anatomopathologiques des tumeurs, telles que le grade de la tumeur et un faible statut des récepteurs aux œstrogènes pour CDC25A et CDC25B et la taille de la tumeur pour CDC25C.Le second volet de ce projet consiste en une étude plus mécanistique portant sur la régulation de l’épissage des CDC25 en conditions de dommages à l’ADN. Le traitement de plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein par différents agents génotoxiques (doxorubicine, camptothécine, étoposide, cisplatine et tert-butyl hydroperoxyde) induit une modification du profil d’épissage de CDC25C, consistant en une forte augmentation de la proportion du variant C5 par rapport à celle de C1 (au niveau de l’ARNm et des protéines). Cette régulation a lieu au cours de la réponse précoce aux dommages à l’ADN, avant la mise en place de l’apoptose et est associée à un arrêt du cycle cellulaire. Nous avons par ailleurs montré que cette modulation de l’épissage de CDC25C est dépendante des kinases ATM/ATR et indépendante de p53. Ces résultats ont permis de mettre en lumière un mécanisme additionnel de réponse cellulaire à un stress génotoxique dans les cellules de cancer du sein. / CDC25 phosphatases play an important role in cell cycle progression. Moreover, an overexpression of CDC25 was reported in numerous cancers, particularly in breast cancer, and is often correlated with a poor prognosis. CDC25 are represented by three isoforms: A, B and C encoded by distinct genes, all three submitted to an alternative splicing mechanism. Few studies suggested that some CDC25 splicing variants could be more involved in cancers than others, but no such study has so far been conducted in breast cancer.The first aspect of this study, referred to clinic, consists in the evaluation of different CDC25 splicing variants proportion in breast cancer, from the perspective of developing a new prognostic tool. This study was performed on two models. On the one hand, several mammary cancerous cell lines were characterized concerning CDC25 variants expression thanks to the development of a novel quantitative RT-PCR method. Interestingly, we observed an overexpression of A2 and B2 transcripts and an increase of C5/C1 ratio in multidrug resistant cell lines, suggesting a link between the expression of these variants and the resistance phenotype. On the other hand, this study was extended to the determination of CDC25 variants expression in mammary tumoral tissues in comparison to that of matched peritumoral tissues. Quantitative PCR results obtained for the 75 pairs of tissues tested showed an overexpression of CDC25A in 64% of tumors, mainly due to A1 variant (69%); of CDC25B in 55% of tumors, partially linked to B1 and B2 variants expression (47% and 21% respectively); and of CDC25C in 75% of tumors, the C5 variant being clearly more involved than C1 (overexpression in 86% and 43% respectively). We have finally established correlations between CDC25 transcripts expression and some tumor characteristics, as the tumor grade and a lack of estrogens receptors for CDC25A and CDC25B and the tumor size for CDC25C.The second part of this project consists in a mechanistic study regarding the regulation of CDC25 splicing in DNA damage conditions. The treatment of several breast cancer cell lines with different genotoxic agents (doxorubicin, camptothecin, etoposide, cisplatin and tert-butyl hydroperoxide) induces a modification of CDC25C splicing profile, consisting in a large increase in C5 variant proportion compared to that of C1 (both at mRNA and protein levels). This regulation occurs during the early response to DNA damage, before the onset of apoptosis and is associated with a cell cycle arrest. We have also shown that this modulation of CDC25C splicing is dependent of ATM/ATR kinases and independent of p53. Finally, these results allowed to highlight an additional regulation pathway in the cellular response to genotoxic stress in breast cancer cells.

Les phosphatases CDC25 sont des enzymes clés qui interviennent dans la progression du cycle cellulaire en régulant l’activité des kinases dépendantes des cyclines (Cdk) par déphosphorylation. Ces phosphatases sont des cibles thérapeutiques intéressantes car leur surexpression, notamment dans le cancer du sein, a pu être corrélée au développement de résistance à certains agents anticancéreux ainsi qu’à un mauvais pronostic.Ce projet vise à évaluer le système des phosphatases CDC25 en tant que cibles intéressantes dans le traitement du cancer du sein.Lors de cette étude, nous nous sommes intéressés à deux composés organosoufrés naturellement présents dans l’ail et l’oignon, les diallyl- (DAS4) et dipropyl- (DPS4) tétrasulfures. Nous avons montré que ces composés étaient capables d’inhiber, de manière irréversible, les phosphatases CDC25A et C in vitro. Le potentiel anticancéreux des composés DAS4 et DPS4 a été confirmé sur des cellules d’adénocarcinome mammaire humain : MCF-7 et MDA-MB-231 (lignées sensibles) et Vcr-R (lignée résistante). Leur croissance est apparue significativement altérée par ces deux composés qui a pu être associée à un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M. Par ailleurs, nos résultats ont également suggéré l’existence d’une activité pro-apoptotique des composés DAS4 et DPS4 qui est indépendante de la production d’espèces réactives oxygénées. L’étude de l’induction de l’apoptose dans le cas des cellules MCF-7 a révélé l’implication des protéines de la famille Bcl-2.Ces résultats suggèrent que l’inhibition des phosphatases CDC25A et C serait un des mécanismes qui contribuerait à l’activité anticancéreuse des composés organosoufrés. / The CDC25 phosphatases are important regulators of eukaryotic cell cycle progression and play a crucial role in the activation of cyclin-dependent kinases (Cdk) by dephosphorylation. CDC25s are attractive targets in cancer therapy because their over-expression was reported in various types of human malignancies, including breast cancer, and this has been correlated with either poor prognosis or tumor aggressiveness.Our study aims to evaluate the CDC25s as interesting targets in breast cancer treatment. This study reports the inhibitory activity of two tetrasulfides : diallyl- (DAS4) and dipropyl- (DPS4) tetrasulfides naturally occurring in garlic and onion, towards the human cell division cycle (CDC) 25 phosphatases. Both compounds have emerged as interesting irreversible inhibitors of the CDC25 isoforms A and C in vitro.Then, we have investigated the anticancer properties of DAS4 et DPS4 on both sensitive (MCF-7 and MDA-MB-231) and resistant (Vcr-R) human breast carcinoma cell lines. Experiments performed on cultured cells have showed that growth of both sensitive and resistant cells was significantly decreased by these tetrasulfides and appeared to be associated with a G2/M cell cycle arrest. In addition, our results also suggested that DAS4 and DPS4 induce apoptotis in MCF-7 cells without affecting reactive oxygen species production. Analysis of mechanisms implicated in apoptosis induction in MCF-7 cells after treatment with DAS4 et DPS4 have suggested the involvement of the Bcl-2 family members. Taken together, these results suggest phosphatases CDC25A and C as possible targets of naturally occuring polysulfides contributing to their anticancer properties.

In Schizosaccharomyces pombe mitosis is initiated when Cdc25 tyrosine phosphatase dephosphorylates Cdc2 (Cdk1) and in turn Cdc2 kinase phosphorylates mitotic targets. Cdc2 is thought to phosphorylate and further activate Cdc25, forming a positive feedback loop between the two for robust entry into mitosis. Pyp3 tyrosine phosphatase is essential in the absence of Cdc25. Its role is thought to be in directly dephosphorylating Cdc2 under these conditions. Pyp3 also presents a link between cell division and growth. It interacts physically and genetically with the mRNA cap-binding protein eIF4E and is thought to play the same role as mammalian 4E-binding proteins. Pyp3 has a consensus TOS motif potentially enabling nutritional input from the TOR pathway into translation regulation. Since known 4E-BPs are not phosphatases, Pyp3 may act as a 4E-binding protein independently of its phosphatase activity. Evolutionarily conserved Cdc2 phosphorylation sites in Cdc25 were substituted to non-phosphorylatable Ala, or to Glu as a phosphomimic. The T89E phosphomimic mutation creates an activated allele of Cdc25, cdc25-89w. It has a dominant semi-wee phenotype due to accelerated entry into mitosis. Pyp3 was mutagenized to remove the function of the phosphatase active site and also the putative TOS motif. The Pyp3 active site is essential for its role in cell cycle initiation. It is also essential for the genetic interaction with eIF4E, tif1. Removal of a putative Pyp3 TOS motif affects the Pyp3 localization to cytoplasmic foci following co-overexpression of eIF4E. Similar localization occurs in response to heat stress. These results make important contributions to the understanding of mitotic initiation, and link between cell growth and division. / Thesis (Master, Biology) -- Queen's University, 2013-09-12 14:40:40.384

Dans le cadre des travaux développés sur les coumarines et autres flavonoïdes au laboratoire (aurones inhibitrices de NFkB, polycycles chromaniques inhibiteurs de CDC25), le travail de la thèse a consisté à poursuivre dans ce domaine en construisant de nouvelles chalcones à partir de dérivés acétylés de coumarines par condensation avec des aldéhydes cinnamiques préparées suivant différentes méthodes. Les chalcones ainsi préparées ont été étudiées pour les effets antioxydants en utilisant la spectrophotométrie ainsi que pour l’inhibition des phosphatases CDC25 / As part of the work developed on coumarin and other flavonoids in our laboratory (aurones as potential NFK-B inhibitors, chromanic polycycles as CDC25 phosphatases inhibitors), the aim of this thesis was to pursue the research in this area by synthesizing new chalcones from acetylated coumarines derivatives by condensation with cynnamic aldehydes prepared by different methods. The prepared chalcones were studied for their antioxidant activity using spectrophotometry and for their inhibition of CDC25 phosphatases

De récentes études suggèrent que la régulation des phosphatases par le peroxyde d’hydrogène pourrait jouer un rôle important dans la signalisation cellulaire. Dans les cellules cancéreuses qui possèdent un statut redox souvent pro-oxydant, ce mécanisme de régulation pourrait être crucial pour la prolifération tumorale. Les phosphatases CDC25 (A, B et C) sont des régulateurs de la progression du cycle cellulaire. Sohn et Rudolph ont montré que les CDC25B et C peuvent être inactivées par le peroxyde d’hydrogène et réactivées en présence du système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (trx/trxR), in vitro. L’existence d’une telle régulation dans des cellules cancéreuses pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques puisqu’une inhibition des trxR ou des trx pourrait induire une inhibition des CDC25 et ainsi prévenir la croissance tumorale. Après avoir vérifié que CDC25A était également sensible au peroxyde d’hydrogène et réactivable in vitro par le système trx/trxR, les effets du peroxyde d’hydrogène et de deux inhibiteurs du système trx/trxR, l’Auranofine et l’Acroléine, ont été testés sur des lignées d’adénocarcinome mammaire humain (MCF7 et MDA-MB 231). Ces deux lignées présentent des niveaux d’expression variables pour la trx1. Dans les deux types de cellules, H2O2 induit un arrêt du cycle cellulaire malgré l’absence d’inhibition totale des CDC25. La conservation de l’état de phosphorylation des CDK lors de ce traitement témoigne donc de l’existence d’un système protecteur efficace pour ces phosphatases. L’inhibition totale des trxR par l’Auranofine engendre des effets cytotoxiques et une production de peroxydes dans les deux lignées. Il en est de même pour les cellules MDA-MB 231 traitées par l’Acroléine alors que les cellules MCF7 sont totalement résistantes à cette molécule. Le traitement des cellules par l’Auranofine induit un stress oxydant modéré car il n’altère pas le taux intracellulaire de glutathion, n’induit pas d’oxydation des trx1 et ne modifie pas la répartition des cellules dans le cycle cellulaire. Toutefois, ce traitement induit des cassures de l’ADN qui peuvent expliquer la cytotoxicité de ce composé. L’acroléine au contraire provoque, dans les cellules MDA-MB 231, une importante déplétion en glutathion associé à une oxydation majeure des trx1 et à un arrêt du cycle cellulaire. Ce dernier ne semble toutefois pas dû à une hyper-phosphorylation des CDK, ce qui suggère qu’une altération complète du système trx/trxR n’induit pas une inhibition totale des CDC25. Afin d’apporter des éléments nouveaux pour la compréhension des mécanismes de régulation redox des CDC25 et du cycle cellulaire dans les cellules de cancer du sein, nous avons ensuite étudié les impacts d’une surexpression de la Mn-SOD dans les cellules MCF7 puisque ces dernières sous-expriment cette protéine par rapport aux cellules MDA-MB 231. Les résultats obtenus révèlent que la répartition des cellules dans le cycle cellulaire et la phosphorylation des CDK ne sont pas sensibles à ce changement d’expression. Dans ce travail nous avons donc pu mettre en évidence que le rôle des CDC25 dans la régulation du cycle cellulaire n’est pas dépendant de l’état de fonctionnalité du système trx/trxR ou du niveau d’expression des Mn-SOD mais qu’il existe un système protecteur puissant qui permet de maintenir au moins en partie l’activité de déphosphorylation des CDC25 en milieu pro-oxydant dans les cellules de cancer du sein / Recent studies suggest that the regulation of phosphatases by hydrogen peroxide may play an important role in cell signaling. In cancer cells, which often possess a pro-oxidative redox state, this regulation could be essential for tumor growth. CDC25 phosphatases (A, B and C) are key regulators of cell cycle progression. Sohn and Rudolph have shown that CDC25B and C are inactivated by hydrogen peroxide and reactivated by the thioredoxin/thioredoxin reductase system (trx/trxR), in vitro. Such regulation in cancer cells could open new therapeutic avenues since the inhibition of trxR or trx could induce a CDC25 inhibition and so prevent tumor cell multiplication. After verifying that CDC25 activity is sensitive to H202 and could be restored by trx/trxR system in vitro, the effects of hydrogen peroxide and that of two trx/trxR inhibitors (Auranofin and Acrolein) was tested on human breast adenocarcinoma cells (MCF7 and MDA-MB 231). These two cell lines exhibit differential expression level for trx1. In both cell lines, H202 could induce a cell cycle arrest in spite of the lack of a full CDC25 inhibition. The maintenance of the CDK phosphorylation state suggests that an efficient protective system exists for these phosphatases. The total inhibition of trxR by Auranofin led to cytotoxic effects and peroxide production in both cell lines. Similar results were obtained for MDA-MB 231 cells treated with Acrolein while MCF7 cells were found to be resistant to this compound. Auranofin could trigger a moderate oxidative stress in treated cells without affecting intracellular GSH content, trx1 oxidation and cell cycle distribution. However, this treatment could trigger double-strand DNA breaks, which could explain the cytotoxicity of Auranofin. Conversely, Acrolein could provoke a strong GSH depletion associated with a full oxidation of trx1 and a cell cycle arrest in MDA-MB 231 cells. Nevertheless, this cell cycle disruption was not due to CDK hyper-phosphorylation, suggesting that a total inhibition of the trx/trxR system does not trigger a full CDC25 inhibition. Furthermore, in order to bring additional knowledge about CDC25 and cell cycle oxidative regulation in breast cancer cells, we have studied the effects of the Mn-SOD over-expression in MCF7 cells. In this cell line, Mn-SOD expression level was found to be lower than in MDA-MB 231 cells. Our results showed that the cell cycle distribution and CDK phosphorylation are not affected by Mn-SOD over-expression. In conclusion, we have shown in this work that the CDC25 function in cell cycle regulation is independent of both a functional trx/trxR system and Mn-SOD expression level but that, under pro-oxidative conditions, a potent protective system maintains at least partially CDC25 dephosphorylation activity in breast cancer cells

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Dephosphorylation of the Cdc2 kinase by the Cdc25 tyrosine phosphatase is the universally conserved trigger for mitotic entry. Cdc25 is also the point of convergence for checkpoint signaling pathways which monitor the genome for damaged DNA and incomplete replication. In addition, Cdc25 is inhibited by a MAP kinase cascade in the event of osmotic, oxidative and/or heat stress. These pathways inhibit cell cycle progression by phosphorylating Cdc25 resulting in its association with 14-3-3 and nuclear export. Although Cdc25 can be observed leaving the nucleus following inhibitory signals it is controversial whether phosphorylation, 14-3-3 binding or export itself is required for checkpoint proficiency. In fission yeast, Cdc25 is phosphorylated in vitro on 12 serine and threonine residues by the effector kinase of the DNA replication checkpoint, Cds1. Nine of these residues reside in the N-terminal regulatory region, while three are found in the extreme C-terminus of the protein. We show here that phosphorylation the nine N-terminal residues, nor any of the 12 in vitro sites, are required for enforcement of the DNA replication checkpoint. In lieu of Cdc25 phosphorylation the phosphatase is rapidly degraded and mitotic entry prevented by the action of the Mik1 kinase, targeting Cdc2. Thus, multiple mechanisms exist for preventing mitotic entry when S-phase progression is inhibited. The three C-terminal in vitro phosphorylation sites have not previously been examined in fission yeast. However, homology exists between the S. pombe protein and the Cdc25 orthologues in humans, Xenopus and Drosophila in this region. We report here that in S. pombe these sites are required to prevent mitotic entry following replication arrest in the absence of Mik1, and in the maintenance, but not establishment, of arrest following DNA damage. Our previous work showed that Cdc25 nuclear import requires the Sal3 importin-β but at the time we were unable to show a direct interaction between these two proteins. The final chapter of this thesis proves physical interaction by co-immunoprecipitation. Cdc25 mutants lacking all twelve putative Cds1 sites show nuclear localization during mitosis in a sal3- background, effectively reversing the cell cycle regulated pattern of accumulation of the phosphatase. / Thesis (Ph.D, Biology) -- Queen's University, 2011-06-20 12:16:15.71

The Cdc25 phosphatases are highly conserved from yeast through humans and play pivotal roles in regulating the activities of cyclin-dependent kinases (Cdks). Cdc25A is one of three human Cdc25 family members, and has previously been shown to be overexpressed in numerous cancers and to transform rodent fibroblasts. Cdc25A therefore represents a rational target for chemotherapeutic development. Further, a thorough understanding of its biology and regulation in normal and transformed cells may facilitate the development of strategies to specifically interfere with the proliferation of cancerous cells. In this work I describe experiments which demonstrate that bisperoxoVanadium compounds, and specifically bpV(Me2Phen), inhibit Cdc25A phosphatase in vitro and in vivo. Further, these compounds cause cell-cycle arrest, are cytotoxic to cancer cells, and slow the growth of tumours in mouse models. With respect to the fundamental biology of Cdc25A, I have identified a sequence element (NLS) responsible for nuclear localization of Cdc25A phosphatase. An analysis of this sequence demonstrated high conservation of flanking phosphoacceptor sites, notably Serine 292. S292 was predicted to be a consensus PKA or CamKII substrate. Using site-directed mutagenesis I have shown that S292 is the sole site of PKA phosphorylation in vitro. The functional importance of S292 phosphorylation was investigated via transfections of phospho-mimetic mutants of S292 (S292E) expressed as GFP-fusion proteins; these studies indicate that S292 phosphorylation may promote nuclear localization. Studies by other groups have indicated that S292 is a phosphorylation site for inhibitory kinases, namely Chk1 and Chk2 (4). I generated a phospho-specific antibody to this site and demonstrate by immunofluorescence and western blotting an unexpected pattern of S292 phosphorylation associated with nuclear bodies and the mitotic apparatus. I provide evidence to suggest that these sites represent local fine-tuning of Cdc25A, allowing Cdk activity to be controlled at the level of specific subcellular structures. These studies highlight the complexity of Cdc25 regulation and indicate a previously unappreciated degree of control of their activity such that these enzymes exist in multiple discrete pools within a given cell.

Dans le cadre de la recherche de nouvelles cibles pour le traitement du cancer, les phosphatases Cdc25 sont des candidats intéressants dont l'inhibition devrait permettre de ralentir la croissance tumorale et éventuellement d'améliorer les traitements actuellement en usage. Les objectifs de ce projet de thèse sont de concevoir et synthétiser de nouveaux composés capables d'inhiber les CDC25, et de déterminer l'efficacité des meilleurs composés dans les lignées cellulaires du cancer du sein. L'évaluation du potentiel inhibiteur des composés est réalisée in vitro par une méthode fluorimétrique très sensibilité (substrat 3-OMFP). Les effets des composés sont évalués dans les lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MB-231 : La viabilité des cellules est évaluée par la méthode colorimétrique du MTT, la cytotoxicité est évaluée par coloration au bleu trypan et par observation microscopique avec le système de vidéomicroscopie Incucyte. La mort cellulaire est caractérisée par la détection de marqueurs apoptotiques (caspases) et de marqueurs des dommages de l'ADN (H.2AX Histone PARP) par western blot. L'analyses des mécanismes liés à la mort cellulaire sont explorées par cytométrie en flux via la détection d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) avec les sondes H2DCFDA et Redox Sensor Red. L'inhibition de CDC25 dans les cellules est évaluée indirectement par détection des formes phosphorylées dse CDK en Western Blot. L'évaluation in vitro de 93 molécules synthétisées nous a permis d'identifier de nouveaux composés actifs. Ils appartiennent à diverses familles chimiques comprenant des stéroïdes, thiophènes, coumarines, imidazoles ainsi que des dérivés de quinone. Les dérivés coumariniques ont montré une intéressante inhibition de CDC25, non décrite jusqu'à présent. Une nouvelle structure coumarine-soufre-quinone, nommée SV37, a été conçue pour optimiser le potentiel d'inhibition. Ce composé présente un fort potentiel inhibiteur des CDC25 in vitro (CI50 < 5uM pour CDC25 A et C). L'effet de SV37 sur la croissance cellulaire a été évalué sur les lignées cellulaires MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 et HepG2 sur lesquelles une inhibition de la croissance cellulaire est observée (CI50 de 9 à 18 µM). L'analyse de la viabilité des cellules traitées à la CI50 indique l'absence de mort cellulaire pour la lignée MCF7, tandis que pour la lignée MDA-MB-231 la diminution de la croissance cellulaire est liée à une augmentation de la mort cellulaire. Afin d'étudier les mécanismes liés à la mort cellulaire, nous nous sommes concentrés sur l'étude du modèle triple négatif MDA-MB- 231. Les modifications morphologiques de ces cellules sont caractérisées par l'apparition d'altérations cellulaires compatibles avec la mort cellulaire. Le clivage des caspase-3 et 7 a été observé dès 16h de traitement, ce qui suggère l'induction d'une mort apoptotique. Par ailleurs, des ERO ont été détectées 15 min après le début du traitement, cette émission d'ERO a pu être totalement bloquée par un prétraitement avec la N-acétylcystéine (NAC). La détection de marqueurs des dommages de l'ADN, entre 16 et 28 heures après début du traitement, corrobore l'activation des caspases et les observations réalisées en vidéo-microscopie. Après traitement à CI50, une accumulation des pCDK dans les cellules a été observée après 4 et 8 heures, suggérant une inhibition de l'activité CDC25. De plus, les cellules prétraitées avec la NAC n'ont montré aucune accumulation de pCDK après traitement par SV37. Ces résultats suggèrent un lien direct entre la production de ROS induit par le composé SV37 et l'inhibition des CDC25. Ce projet a permis de définir les coumarines en tant que nouvelle classe de composés inhibitrice des phosphatases CDC25. Ces travaux ont de plus permis l'identification d'un composé coumarine-soufre-quinone SV37 qui constitue une structure de base pour le développement d'inhibiteurs de plus en plus efficaces, ... / Within the context of research for new targets for cancer therapy, Cdc25 phosphatases are interesting candidates, the inhibition of which being able to slow down tumor growth and eventually improve the cancer treatments currently in use. The objectives of this PhD project are to design and synthesize new compounds able to inhibit CDC25 and to determine efficiency of identified compounds in breast cancer cell lines. In vitro evaluation of inhibitory potential of compound is realized through a high sensitivity fluorometric method (3-OMFP substrate). Cellular effects were evaluated in MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. Effects on cell viability are assessed through MTT assays, and cytotoxicity is evaluated through trypan blue assays and microscopic observations with Incucyte videomicroscopy system. Cell death was characterized by detection of apoptotic markers (caspases) and DNA damages markers (PARP Histone H.2AX) by Western Blotting. The analyses of mechanisms underlying cell death were explored through cytometric detection of reactive oxygen species (ROS) with H2DCFDA and Redox Sensor Red probes. Inhibition of CDC25 in cells was indirectly evaluated through detection of phosphorylated forms of CDK by Western Blotting. In vitro evaluation of 93 synthesized compounds allowed us to find new active compound in various chemical families including steroid, thiophene, coumarinic, imidazole and quinone derivatives. The coumarinic derivatives showed potent CDC25 inhibition. A new coumarin-sulfurquinone combined structure, named SV37, was designed to optimize efficiency of inhibition. In vitro tests on this compound, showed a strong CDC25 inhibitory potential (IC50 under 5µM for CDC25 A and C). Effect of SV37 on cell growth was evaluated on various cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 and HepG2). Results indicate inhibition of cell growth (IC50 values from 9 to 18 µM). Analysis of cell viability indicates no remarkable cell death in MCF7 at IC50 value whereas in MDA-MB-231 the cell growth decrease was characterized by an increase of cell death. For deeper investigations on the cell death and on the underlying mechanisms, we focused the study on the triple negative model MDA-MB-231. The morphological changes of MDA-MB-231 cells during the treatment were characterized by the appearance of cellular alterations compatible with a cellular demise and culminating with a disruption of cells after 20h. Caspase-3 and 7 cleavages were observed 16h after beginning of the treatment, suggesting an apoptotic cell death. A ROS induction was observed 15 min after the beginning of the treatment and was totally prevented by Nacetylcysteine (NAC) pretreatment. DNA damage markers were detected between 16 and 28 hours after beginning of treatment, a timing falling with caspase activation and with the appearance of cell demise observed by video microscopy. Accumulation of pCDK in cells was observed after 4 and 8 hr of treatment by SV37 at IC50 suggesting an inhibition of CDC25 activity, and cells pretreated with NAC showed no accumulation of pCDK after SV37 treatment. This strongly suggests a direct link between ROS generation by the compound SV37 and the accumulation of pCDK. This project increased knowledge on inhibitors of CDC25 phosphatases and allowed the identification of coumarine compound as new CDC25 inhibitors. This work will enable the development of ever more efficient inhibitors, leading to efficient inhibition of CDC25 and inhibition of tumor development

Le travail présenté dans ce mémoire a pour thème central la synthèse de nouvelles quinones, et plus spécialement des terpénylquinones et des hétéroquinones, composés bien connus pour avoir des propriétés biologiques intéressantes. Dans une première partie, la synthèse d'un podocarpane fonctionnalisé, intermédiaire avancé vers l'accès de terpénylquinones naturelles comme le célaphanol A, est présenté. La seconde partie, qui a été consacrée à la synthèse d'hétéroquinones, s'articule autour de deux axes, la préparation d'hétéroquinones substituées par deux chaînes thioalkyles d'une part et la synthèse d'hétéroquinones possédant une activité antipaludique d'autre part. Les produits obtenus dans le cadre du premier axe ont été testés en tant qu'agents anticancéreux (inhibiteurs de phosphatases CDC25), et l'évaluation de l'activité biologique des hétéroquinones comme agents antipaludiques nous a permis d'identifier le meilleur substrat qui a été couplé avec un dérivé terpénique.