CATALÀ: La cetogènesi és un procés mitocondrial a partir del qual es sintetitzen els cossos cetònics: acetona, acetoacetat i 3-hidroxibutirat, que són emprats com a font d'energia en el mitocondri dels teixits extrahepàtics a través de l'acció de la Succinil-CoA:3-cetoàcid-CoA transferasa (SCOT). Alternativament, en el citosol dels teixits lipogènics, l'acetoacetat pot ser activat a acetoacetil-CoA, a través de l'enzim Acetoacetil-CoA sintetasa (AACS), proporcionant unitats acetil-CoA de manera independent i anàloga al citrat produït en el mitocondri, transferit al citosol i escindit per l'ATP-citrat liasa.1. Estudi de la funcionalitat de la seqüència del cDNA del gen AACS humà predit. Hem demostrat que la seqüència predita del cDNA del gen AACS humà codifica per una proteïna funcional. Els valors de les constants de Michaellis-Menten (Km) de la proteïna GST-AACS son de 37.6M, 155.24M i 2.3M per l'acetoacetat, l'ATP i el CoA, respectivament. A més, l'enzim AACS humà és inhibit a 15 M de CoA. 2. Estudi de les modificacions posttraduccionals de la proteïna AACS humana.L'anàlisi de la seqüència aminoacídica de la proteïna AACS humana revela la presència de diversos residus de lisina com a putatius llocs d'acetilació. La substitució de la Lys634 per Arg provoca una disminució de l'estat d'acetilació de la proteïna però no l'aboleix totalment. Mitjançant la deleció de l'extrem COOH-terminal hem pogut concloure que aquesta regió és determinant per a l'estat d'acetilació, encara que no es pot descartar la possibilitat d'altres residus de lisina acetilables en l'extrem NH2-terminal.3. Aportació al procés de la colesterogènesi del gen AACS humà.S'ha analitzat l'efecte de la sobreexpressió de la proteïna AACS humana en el procés de la colesterogènesi, mitjançant la generació d'un sistema induïble BDTMTet-On Gene Expression system en cèl·lules HeLa. L'acetoacetil-CoA, fruit de la reacció catalitzada per l'AACS, és incorporat de manera preferencial cap a la síntesi de colesterol, implicant que l'esquelet de quatre carbonis de l'acetoacetat o bé la seva forma activa, l'acetoacetil-CoA, no s'equilibra completament amb el pool de dos carbonis representat per l'acetat i l'acetil-CoA. Una de les hipòtesis que explicarien aquest fet és la possible existència d'interaccions (channeling) entre els primers enzims de la via de la colesterogènesi, és a dir, entre l'AACS i l'HMGCS1. No obstant això, els nostres experiments mostren que ambdues proteïnes no interaccionen ni de manera directa ni indirecta.4. Estudi dels mecanismes de regulació transcripcional del gen AACS humà.Hem caracteritzat els elements necessaris per a que es produeixi l'activitat basal del gen AACS humà i hem estudiar la seva regulació transcripcional per factors de transcripció implicats en l'homeòstasi lipídica: LXR, SREBPs i PPAR. Els nostres resultats mostren que l'Inr és funcional, i que les caixes GC presents en el promotor proximal del gen AACS uneixen el factor de transcripció Sp1, important en la mediació de l'activitat basal d'aquest promotor. Els putatius LXRE i SRE, localitzants en el promotor in silico, no són funcionals. En canvi, PPARregula l'expressió del gen AACS d'una manera no canònica a través de la proteïna Sp1 i mitjançant la interacció amb les caixes GC. 5. Regulació de l'expressió del gen AACS de rata en diferents situacions fisiològiques: ritme circadiari.L'expressió del gen AACS està sotmesa a regulació circadiària, produint-se el zenit d'expressió en fetge i en TAB a l'inici de la fase fosca, coincidint amb el període de màxima activitat dels rosegadors. El patró d'expressió del factor de transcripció SREBP-1 i de l'AACS en fetge és paral·lel, suggerint que SREBP-1c podria ser responsable de mitjançar la regulació de l'expressió de l'AACS en aquest òrgan en les situacions fisiològiques estudiades: dejuni/realimentació en les fases diürna i nocturna, i administració d'insulina. / Acetoacetyl-CoA synthetase (AACS, acetoacetate-CoA ligase, EC 6.2.1.16) is a cytosolic ketone body (acetoacetate)-specific ligase found in several lipogenic tissues that might play an important role in the provision of Acetyl-CoA units for lipogenesis. Transfer of acetyl as acetoacetate, from the mitochondria to the cytosol, would operate in parallel with transfer via citrate and ATP-citrate lyase.1. Kinetic parameters of the human AACS.The KM values for acetoacetate, ATP and CoA were 37.6 M, 155.24 M, and 2.3 M respectively. CoA exerts an inhibitory effect when concentration raised over 15 M.2. Study of the posttranslational protein modification of human AACS.Sequence analysis of human AACS protein shows the presence of multiple lysine residues as a target of acetylation modification. The invariant lysine of the PX4GK domain, is not relevant for total levels of human AACS acetylation because the mutation of Lys-633 to arginine, did not abrogate the reactivity with the α-acetyl-lysine antibody. However the replacement of Lys-634 with arginine yielded a decrease in the acetylation status of human AACS protein. 3. Human AACS and cholesterogenesis.We studied the effect of human AACS overexpression in HeLa cells using the BDTMTet-On Gene Expression system. As previosly reported, acetoacetate is used preferentially for cholesterol biosynthesis although we couldn't observe a substrate channeling in the early steps of cholesterogenesis.4. Study of the mechanisms of transcriptional regulation of human AACS gene.We isolated the human AACS promoter, characterized the elements required to initiate transcription and analyzed the expression of the gene in response to LXR, SREBPs and PPAR, all known important factors for lipidic homeostasis. We show that the human AACS promoter contains an Inr sequence and several GC boxes that are determinant for its basal activity. We also show that PPAR transcriptionally induces the expression of the AACS gene by a non-canonical mechanism, since it is recruited to the AACS promoter by direct interaction with Sp1. 5. Circadian rhythm.AACS transcriptional regulation is under the control of circadian rhythm in liver and BAT but not in brain. Our results suggest that circadian expression in liver is driven by the rhytmic expression of SREBP-1c.

La proteïna desacoblant mitocondrial UCP3, expressada en teixits metabòlicament molt importants (muscular i adipós marró) i homòloga a la proteïna termogènica UCP1, ha estat motiu de nombrosos estudis en els darrers anys dirigits a determinar la seva funció. Són moltes les dades bioquímiques i cel·lulars obtingudes, però la realitat és que la seva funció fisiològica bàsica en l'organisme no es coneix encara amb claretat. Amb aquest objetiu i mitjançant l'estudi d'expressió gènica en múscul esquelètic i teixits adiposos de ratolí knockout per UCP3 hem observat que: 1. L'absència d'UCP3 per disrupció dirigida del seu gen en aquests ratolins no causa alteracions significatives d'expressió de gens implicats en estrés oxidatiu en múscul esquelètic de ratolins nounats, tot i que en aquest període l'expressió d'UCP3 es veu fortament induïda en el ratolí wild-type. 2. En ratolins adultsknockout per a UCP3 en procés d'envelliment no es produeixen alteracions significatives dels paràmetres metabòlics circulants i l'expressió de gens implicats en estrés oxidatiu i metabolisme energètic en múscul esquelètic, teixit adipós marró, teixit adipós blanc i fetge resulta mínimament afectada. L'anàlisi massiu d'expressió gènica en múscul mitjançant microarray de genoma complet, tampoc evidencia alteracions substancials. 3. L'exposició perllongada a una dieta hiperlipídica sense carbohidrats en ratolins en envelliment dóna lloc a un increment de pes corporal sense alteracions destacables a nivell de metabolits circulants. Aquesta dieta provoca un fort increment d'expressió de la proteïna d'UCP3 a múscul esquelètic. 4. La dieta hiperlipídica té efectes diferencials en els ratolins knockout per UCP3, que es manifiesten en un increment específic de còssos cetònics circulants i en alteracions de l'expressió de gens implicats en estrés oxidatiu i metabolisme energètic. Això es produeix especialment en teixit adipós marró i fetge, veient-se en general, incrementada l'expressió de gens del catabolisme lipídic. 5. Malgrat la baixada d'expressió de Pref-1 en teixits adults, aquest gen es mostra sensiblement regulat, induint-se en teixit adipós marró degut a la manca d'UCP3 i en teixit adipós blanc en resposta a la dieta hiperlipídica.El teixit adipós marró i el teixit adipós blanc tenen un paper oposat al balanç energètic de l'individu. Davant l'evidència de Pref-1 com a controlador negatiu de la diferenciació de l'adipòcit blanc, ens plantejàrem l'estudi de la seva funció biològica en teixit adipós marró així com la seva regulació mitjançant models cel·lulars d'adipòcits marrons en cultiu i models d'animals modificats genèticament. Els nostres resultats indiquen que: 1. L'absència de Pref-1 per disrupció dirigida del gen (ratolins knockout per Pref-1) causa alteracions morfològiques i d'expressió gènica en el teixit adipós marró durant el desenvolupament, consistents en una sobreactivació termogènica del teixit. Això suggereix un potencial papel repressor de Pref-1 en aspectes específics (programa termogènic) de la diferenciació del teixit adipós marró respecte el blanc. No obstant, aquesta alteració sembla no mantenir-se en ratolins adults sota un estímul termogènic. 2. A diferència del teixit adipós blanc, el desenvolupament del teixit adipós marró es dóna en el període fetal, en un context d'elevada expressió del gen Pref-1. 3. En adipòcits marrons, el gen Pref-1 té regulació positiva per C/EBP-beta i sobretot, per C/EBP-delta que actua com a factor de transcripció regulador del promotor gènic de Pref-1. Aquest fet explicaria la potent sobreinducció de Pref-1 en teixit adipós marró de ratolins knockout per C/EBP-alfa, on s'observa sobreexpressió de C/EBP-beta i C/EBP-delta. Aquests resultats indicarien un paper diferencial de C/EBP-delta sobre la diferenciació i expressió gènica de l'adipòcit marró respecte l'adipòcit blanc. / Study of UCP3 and Pref-1 gene regulation in muscular and adipose tissuesAbstract: Mitochondrial uncoupling protein 3 (UCP3) homologous to termogenic UCP1, is mainly expressed in muscular and brown adipose tissues but its physiological function remains unknown. We have carried out gene expression studies in skeletal muscle and adipose tissues of UCP3 knockout mice and we have observed: 1. UCP3 gene deletion in those mice does not impairs oxidative stress related gene expression in skeletal muscle from newborn mice, althought UCP3 gene expression is dramatically induced in wild-type mice during this period. 2. Ageing does not impairs blood parameters neither expression of genes related to oxidative stress and oxidative metabolism in skeletal muscle, brown (BAT) and white (WAT) adipose tissues and liver from knockout mice. Whole genome microarray did not show clear changes in gene expresion. 3. Long term high-fat carbohidrate free diet feeding during agening lead to body weight increase without any change in blood parameters, and a significant increase in UCP3 protein content in skeletal muscle. 4. This diet caused diferential effects on knockout mice: blood ketone bodies increment and impaired expression of genes related to oxidative stress and energetic metabolism. 5. Pref-1 gene is sensitively regulated in adult brown and white fat.BAT and WAT have and oposite role in energy balance. Since Pref-1 has been described as a negative regulator of white adipocyte differenciation, we have studied its biological function and regulation on brown adipocytes and on BAT. 1. Pref-1 gene disruption (Pref-1 knockout mice) impairs BAT morfology and gene expression during its development, consisting on a thermogenic overactivation. This suggest a specific potential repressor rol for Pref-1 compared to WAT differentiation. Nevertheless, these changes do not persist in adult mice under thermogenic stimulus. 2. Unlike WAT, BAT development take place in foetal period, in presence of a high Pref-1 gene expression. 3. In brown adipocytes, Pref-1 gene is positively regulated by C/EBP-beta and specially by C/EBP-delta transcription factors. This fact can explain Pref-1 strong overinduction in BAT from C/EBP-alpha knockout mice which also displays C/EBP-beta and C/EBP-delta overexpression. These results suggest differential rol for C/EBP-delta in brown adipocyte differentiation and gene expression compared to white adipocyte.

Les aminoacil-ARNt sintetases (aaRS) són els enzims encarregats d'aminoacilar els ARN de transferència (ARNt) per tal que puguin ser utilitzats pels ribosomes en el procés de síntesi proteica. La síntesi de les proteïnes codificades en el genoma mitocondrial i constitutives dels complexos de la cadena respiratòria i la fosforilació oxidativa requereixen una maquinària traduccional pròpia de l'orgànul. Per tant, mutacions en els elements que constitueixen l'aparell de traducció genètica mitocondrial poden desencadenar patologies greus en humans. Existeixen malalties mitocondriales humanes causades per mutacions en l'ADN mitocondrial que afecten específicament els ARNt i ARNr i, a més, s'han descrit mutacions en proteïnes mitocondrials codificades en el genoma nuclear, entre les quals es troben mutacions en aaRS mitocondrials. La complexitat de les patologies mitocondrials, degudes a defectes en la síntesi proteica en l'orgànul, justifica la generació de models animals que permetin caracteritzar els efectes de deficiències d'aminoacilació mitocondrial, i el desenvolupament d'estratègies terapèutiques. En base a aquest objectiu, al llarg de la present tesi doctoral hem generat un model de patologia mitocondrial en Drosophila melanogaster amb el propòsit de caracteritzar els efectes d'una deficiència de traducció en l'orgànul com a conseqüència de la manipulació de la seril-ARNt sintetasa mitocondrial (DmSRS2). Els animals sotmesos al silenciament de l'expressió de la DmSRS2, mitjançant l'ARN d'interferència, mostren un descens en els nivells d'ARNtSer mitocondrials aminoacilats. La depleció de la DmSRS2, de manera generalitzada, compromet significativament la viabilitat de l'organisme i, de manera restringida en determinats òrgans i teixits, impedeix el correcte desenvolupament d'aquests. A més, el descens en els nivells de DmSRS2 provoca defectes en la morfologia, en la biogènesi i en la funció mitocondrials, que reprodueixen algunes de les característiques pròpies de malalties mitocondrials humanes. Cal afegir que en el context d'aquest projecte hem descobert una nova proteïna d'insecte homòloga a la seril-ARNt sintetasa mitocondrial (SLIMP), la caracterització de la qual s'ha convertit en un objectiu més d'aquesta tesi doctoral. La llarga història evolutiva de les aaRS explica l'àmplia varietat de funcions associades amb elles, i de proteïnes homòlogues, independents del paper convencional que desenvolupen en la traducció genètica. SLIMP representa una d'aquestes proteïnes, que probablement va sorgir de la duplicació d'una SRS mitocondrial a la base de l'evolució dels metazous, i s'ha mantingut en tots els insectes, en una espècie d'aràcnid i en una d'eriçó de mar. Tot i que SLIMP no desenvolupa una funció com aaRS, reté algunes de les característiques típiques de les SRS mitocondrials, com ho són la conformació dimèrica i la capacitat d'unir específicament els ARNtSer mitocondrials. SLIMP té un paper essencial en D. melanogaster atès que la reducció constitutiva i ubiqua de la seva expressió disminueix la viabilitat, i la depleció restringida en teixits concrets afecta el desenvolupament d'aquests. Proposem que la funció de SLIMP pot estar relacionada amb el metabolisme mitocondrial, ja que la seva depleció produeix greus anormalitats estructurals en l'orgànul, un increment en la biogènesi i una reducció de la capacitat respiratòria mitocondrial. Addicionalment, una dieta enriquida en molècules antioxidants produeix un efecte pal·liatiu en la viabilitat de les mosques sotmeses al silenciament global de SLIMP. / Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) aminoacylate transfer RNAs (tRNAs) for their use by the ribosome during protein synthesis. The synthesis of mitochondrially encoded proteins is performed by a translation apparatus specific for the organelle, and mutations in elements that constitute this apparatus can trigger severe pathologies in humans. Mutations in the mitochondrial DNA that specifically affect tRNA and rRNA, as well as mutations in nuclear encoded mitochondrial proteins, for instance, those affecting mitochondrial aaRS, are related to disease. The complexity of mitochondrial diseases caused by defects in protein synthesis justifies the generation of animal models which permit the characterization of the pathogenic mechanisms and the development of therapeutic strategies. In the present doctoral thesis we use Drosophila melanogaster to construct a model of a mitochondrial disease caused by a deficiency in mitochondrial translation, by means of RNAi-mediated silencing of mitochondrial seryl-tRNA synthetase (DmSRS2). Silencing of DmSRS2 causes a decrease in mitochondrial seryl-tRNASer levels. Global DmSRS2 depletion compromises viability, and when restricted to particular organs, it prevents their proper development. Moreover, DmSRS2 reduction affects mitochondrial morphology, biogenesis, and function.Within the context of this project we discovered a new insect protein, called SLIMP, homologous to mitochondrial seryl-tRNA synthetase, whose characterization became an additional objective of this thesis. Owing to their long evolutionary history, aaRS and their homologues can perform a wide variety of non-canonical functions. SLIMP is likely the result of a duplication of a mitochondrial SRS gene that occurred early in the evolution of metazoans and was maintained in insects. SLIMP is a dimeric protein and is able to bind mitochondrial tRNASer, properties it has retained from the ancestral mitochondrial SRSs. Although SLIMP does not function as an aaRS, it carries out an essential role in D. melanogaster mitochondria, as its depletion by RNAi decreases the viability of the organism and affects mitochondrial structure, biogenesis, and respiratory capacity.

The aim of this thesis is the characterization of a protein involved in apoptosis. Our group has identified an early step common to different forms of intrinsic apoptosis stimuli. This step requires de novo synthesis of a novel Cyclin, Cyclin O, that upon apoptosis induction in lymphoid cells forms active complexes, primarily with Cdk2. Cyclin O expression precedes glucocorticoid and gamma radiation-induced apoptosis in vivo in mouse thymus and its overexpression induces apoptosis in cultured cells. Knocking down the endogenous expression of Cyclin O by shRNA leads to the inhibition of glucocorticoid and DNA damage-induced apoptosis while leaving CD95 death receptor mediated apoptosis intact. This data demonstrates that apoptosis induction in lymphoid cells is one of the physiological roles of Cyclin O and it does not act by perturbing a normal cellular process such as the cell cycle. In addition we have identified c-Myb a substrate of Cdk2-Cyclin O complexes and we show that c-Myb is downregulated during apoptosis of lymphoid cells. / L'objectiu d'aquesta tesi és la caracterització d'una proteïna involucrada en l'apoptosi. El nostre grup ha identificat un pas primerenc comú en diversos estímuls apoptòtics de la ruta intrínseca. Aquest pas requereix la síntesi de novo d'una nova Ciclina, Ciclina O, que quan s'indueix apoptosi en cèl·lules limfoides forma complexes actius majoritàriament amb Cdk2. L'expressió de la Ciclina O és prèvia a l'apoptosi induïda per glucocorticoids i radiació gamma i la seva sobreexpressió indueix apoptosi en cultius cel·lulars. La baixada dels nivells d'expressió de la Ciclina O endògena amb shRNA provoca una inhibició de l'apoptosi induïda per glucocorticoids o agents que danyen el DNA, mentre que l'apoptosi mediada pel receptor CD95 es manté intacta. Aquests resultats demostren que la inducció d'apoptosi en cèl·lules limfoides és una de les funcions fisiològiques de la Ciclina O i que no es deu a una pertorbació de processos cel·lulars normals com ara el cicle cel·lular. A més a més, hem identificat c-Myb com a substrat dels complexes Cdk2-Ciclina O i demostrem que els nivells de c-Myb baixen durant l'apoptosis de cèl·lules limfoides.