Muchos autores han estudiado la estructura y el desarrollo embriológico y ultraestructural del músculo cardíaco. Siendo el corazón el primer órgano interno que manifiesta una actividad visible al presentar un movimiento autónomo, es lógico que atrajese la curiosidad científica y se aplicaran sucesivamente todos los adelantos técnicos para el estudio de su estructura y ultraestructura, especialmente el microscopio óptico, el microscopio de contraste de fase, la histoquímica, el microscopio electrónico, la microscopia con inmunofluorescencia y la autorradiografia.El desarrollo del músculo miocárdico ha sido estudiado ampliamente con el microscopio óptico por varios autores (PATEN y KRAMER, 1933; RAWLES, 1943; ROMANOFF, 1960; ORTS LLORCA y cols. 1963,1967,1968,1970; De HAAN, 1965; entre otros).La puesta a punto del microscopio electrónico permitió a diversos investigadores el estudio de la citodiferenciación del miocardio a nivel ultraestructural (HIBBS, 1956; MUIR, 1957; WAINRACH y SOTELO, 1961; CARAVITA y GIBERTINI, 1966; MANASEK, 1968, 1969,1970; ORTS LLORCA y GONZALEZ DE SANTANDER, 1969; entre otros).A pesar de todos estos estudios, y de otros paralelos en el músculo esquelético (DESSOUKI y HIBBS, 1965; ALLEN Y PEPE, 1965; HEUSON-STIENNON, 1964, 1965, 1967; AUBER, 1969; y ISHIKAWA, BISCHOFF y HOLTZER, 1969), quedan aún muchos interrogantes en la diferenciación de estas células musculares, tales como la aparición y significado de los gránulos densos, la miofibrilogénesis, la asociación complejos de unión y bandas Z, etc.El miocardio fue también uno de los primeros tejidos en ser cultivados fuera del organismo (BURROWS 1910; CARREL, 1914). Los primeros investigadores ya observaron que al cabo de un cierto tiempo de cultivo el miocardio perdía su aspecto sincitial, y las células del cultivo adoptan formas alargadas, similares a fibroblastos; se pensó que este fenómeno era debido a una desaparición de los miocitos por degeneración, quedando únicamente las células acompañantes del tejido conectivo. (CARREL y EBELING, 1924). Otros autores creyeron que las células finales podrían ser miocitos transformados que hubieran regresado a una célula más primitiva, por lo que a este proceso se le denominó desdiferenciación (OLIVO, 1928).Estas modificaciones celulares fueron vistas posteriormente con el microscopio electrónico. (WEISSENFELS, 1962; FIRKET, 1967); pero no hemos encontrado ningún estudio detenido que demuestre de forma clara y secuencial el origen de estas células finales.Nosotros hemos estudiado la diferenciación de los miocitos del miocardio del embrión de pollo a lo largo de su evolución, desde los estadios iniciales hasta algunos días después del nacimiento. Posteriormente hemos realizado dos series de cultivos, de corazón de embrión de pollo, una a partir de un embrión de 4 días y la otra a partir de uno de 7 días, pues entre ambos estadías las células presentan distinto grado de madurez.Hemos comparado los resultados obtenidos con el material cultivado entre sí y con los obtenidos en el material embrionario; al mismo tiempo hemos estudiado el origen de las células "desdiferenciadas" y sus transformaciones progresivas.

Studies of the role of tuberous sclerosis complex (TSC) proteins (TSC1/TSC2) in pathology have focused mainly on their capacity to regulate translation and cell growth, but their relation with alterations of cellular structures and the cell cycle is not yet fully understood. The transforming acidic coiled-coil (TACC) domain-containing proteins are central players in structures and processes involving the microtubule network. Here, TACC3 interactome mapping identified TSC2 and 15 other proteins, including TACC homo and heterodimers, and two evolutionary conserved interactors (ch-TOG/CKAP5 and FAM161B). TACC3 and TSC2 co-localize and co-purify with components of the nuclear envelope, and their deficiency causes morphological alterations of this structure. During cell division, TACC3 is necessary for the proper localization of phospho-Ser939 TSC2 at the spindle poles and cytokinetic bridges. Consistently, abscission alterations and increased frequency of binucleated cells were observed in Tacc3- and Tsc2-deficent cells relative to controls. In regulating cell division, TSC2 acts epistatic to TACC3 and, in addition to canonical TSC/mTOR signaling and cytokinetic associations, converges to the early mitotic checkpoint mediated by CHFR. Our findings link TACC3 to novel structural and cell division functions of TSC2, which may provide additional explanations of the clinical and pathological manifestations of lymphangioleiomyomatosis disease and TSC syndrome, including the greater clinical severity associated with TSC2 germline mutations relative to TSC1. / "ESTUDI DE LA CONNEXIÓ ENTRE EL CENTROSOMA, L'ESCLEROSI TUBEROSA I LA DIFERENCIACIÓ EPITELIAL"TEXT:La major part dels estudis realitzats per tal d'esbrinar les funcions de les proteïnes TSC1 i TSC2 causants de l'Esclerosi Tuberosa (TSC) s'han centrat en la seva capacitat de regular la transcripció i el creixement cel·lular, però la seva relació amb alteracions d'estructures cel·lulars i el cicle cel·lular no estan ben determinades. Les proteïnes TACC tenen un paper primordial en estructures i processos relacionats amb les xarxes de microtúbuls (MTs). En aquest estudi hem realitzat un mapatge d'interaccions centrat en TACC3 i hem identificat TSC2 i 15 proteïnes més, com són els homo- i heterodímers de TACC, i dues proteïnes (ch-TOG/CKAP5 i FAM161B), la interacció de les quals està conservada entre espècies. TACC3 i TSC2 co-localitzen i co-purifiquen amb components de l'embolcall nuclear i la seva deficiència dóna lloc a alteracions d'aquesta estructura. Al llarg de la divisió cel·lular, TACC3 és necessària per a la localització de phospho-Ser939-TSC2 als pols del fus mitòtic i al punt de divisió de citocinesi. En concordança, cèl·lules deficients en Tacc3 i Tsc2 presenten un retràs en la citocinesi i una elevada freqüència de cèl·lules binucleades. Pel que fa a la regulació del cicle cel·lular, TSC2 actua de forma epistàtica sobre TACC3 i, a més de la seva funció de senyalització en la via TSC/mTOR i les associacions amb la citocinesi, convergeix amb el punt de regulació temprà de mitosi mediat per CHFR. Els nostres resultats relacionen TACC3 amb noves funcions estructurals i de divisió cel·lular per part de TSC2, la qual cosa podria proporcionar noves explicacions a les manifestacions clíniques i patològiques de la limfangioleiomiomatosi (LAM) i TSC.

L'objectiu d'aquesta tesi ha estat buscar nous agents inductors de diferenciació, aturada del cicle cel·lular o mort cel·lular, per a les cèl·lules de neuroblastoma humà, més eficaços i més selectius que els fàrmacs utilitzats en la teràpia actual. Amb aquesta finalitat, hem estudiat l'efecte ex vivo en diferents línies cel·lulars de neuroblastoma humà de dos compostos, el pigment bacterià prodigiosina, i l'inhibidor general d'histona desacetilases de classe I/II tricostatina A. La PG ha mostrat tenir un efecte citotòxic i citostàtic en les línies de neuroblastoma. Indueix mort cel·lular per mecanismes apoptòtics dependents de caspases, i especialment en les cèl·lules de neuroblastoma tipus N, les fenotípicament més agressives. No obstant la inhibició de l'activació de les caspases no reverteix complertament la mort cel·lular, indicant la implicació d'altres mecanismes de mort cel·lular en el procés desencadenat per PG. L'aturada de la proliferació cel·lular és en canvi molt més acusada en les cèl·lules tipus S, tot i que és un fenomen observat en totes les cèl·lules estudiades. A més a més, en el present treball hem descrit com la PG, després de la seva entrada per difusió en la cèl·lula, s'acumula especialment en els mitocondris, induint un efecte desacoblant entre la cadena respiratòria i l'activitat de l'ATPasa-F0-F1 mitocondrial de les cèl·lules de neuroblastoma. Com a resultat, la producció d'ATP es veu disminuïda notablement però la taxa de consum d'oxigen no s'altera. Nosaltres suggerim que l'explicació a aquest fet podria trobar-se en l'habilitat que té la PG per a atrapar protons a pH fisiològic, modificant així els gradients de pH intracel·lulars, no tant sols els vesiculars i els lisosomals, si no també molt possiblement els intramitocondrials. Al capítol dos es descriuen els resultats de l'estudi del tractament de les cèl·lules de neuroblastoma amb TSA. El TSA indueix una aturada del cicle cel·lular en G2/M i apoptosi, però també autofàgia, procés fins al moment no descrit en aquestes cèl·lules com a resposta a l'exposició a HDIs, no havent-se observat diferències en aquests efectes entre les cèl·lules neuroblàstiques tipus N, S i I. En concordança amb estudis previs, la disminució de la proliferació i l'aturada en G2/M ha resultat ser conseqüència d'un procés independent de les caspases. Probablement associat a l'augment d'expressió de l'inhibidor de CDKs p21WAF/Cip1 i a l'activació de la via supressora de tumors del RB, tal i com suggereix la disminució de l'expressió de N-Myc, E2F-1 i Survivina, tots ells implicats en aquesta via, i a més a més marcadors de mal pronòstic en el neuroblastoma. Podent ser la disminució de la Survivina responsable per si sola del desencadenament de l'apoptosi. No obstant, l'efecte del TSA no ha estat el mateix en totes les línies cel·lulars de neuroblastoma estudiades, sent les cèl·lules SK-N-AS les més resistents. En aquestes cèl·lules, tot i activar-se els mateixos mecanismes que en la resta de cèl·lules estudiades, la disminució de la viabilitat és molt reduïda i, a les dosis utilitzades, sembla prevaldre un efecte citostàtic. És més, mentre en les cèl·lules LA1-55N, SK-N-JD i LA1-5S, apoptosi i autofàgia semblen estar induint-se simultàniament i col·laborar en la mort cel·lular induïda pel TSA, en les SK-N-AS els resultats suggereixen que aquests dos mecanismes tenen finalitats antagòniques, de manera que l'autofàgia promou la supervivència cel·lular. Així doncs, els resultats obtinguts indiquen que els dos compostos són capaços d'induir una disminució de la viabilitat cel·lular deguda a una aturada de la proliferació i/o a la mort cel·lular. A més a més, els resultats de l'exposició de les cèl·lules als dos compostos són prou diferents als produïts pels anticancerígens convencionals, com per considerar-se el seu assaig en diferents combinacions amb altres quimioteràpics. / "Characterization of cell death in human neuroblastoma cell lines."TEXT:The objective of this thesis was to look for new agents capable to induce differentiation, cell cycle arrest or cell death in neuroblastoma human cells, more efficient and selective than the ones use in actual therapy. With this purpose, we have studied the ex vivo effect of two compounds in different human neuroblastoma cell lines, the red pigment prodigiosin, and trichostatin A, a general inhibitor of histone deacetylases of class I/II. Prodigiosin showed a cytotoxic and cytostatic effect in neuroblastoma cells. It induced cell death through caspase-dependent apoptotic mechanisms, especially in N-type neuroblastoma cells, the more aggressive ones. We suggest this effect could be explained by prodigiosin ability to capture protons at physiologic pH, modifying the intracellular pH gradients.At the second chapter we described the effect of trichostatin A in this cell model. Trichostatin-A induces a G2/M-cycle arrest, apoptosis and authopagy in the three types of neuroblastoma cells, N-, I- and S-type. However, not all the cells exhibited the same sensibility, being the SK-N-AS cells the more resistant to this compound. Moreover, while in LA1-55N, SK-N-JD and LA1-5S cells apoptosis and autophagy seem to be induced simultaneously and to collaborate in TSA-induced cell death, in SK-N-AS cells these two mechanisms seem to have antagonic purposes, leading autophagy to cell survival.In conclusion, the results indicate that these two agents are able to induce a decrease in cell viability because of cell-cycle arrest and/or cell death. Furthermore, the consequences of the exposition of the cells to these compounds are different enough to the obtained by conventional therapy, to consider its assay with different combinations of other chemotherapy agents.

Macrophages are key regulators of immune system connecting innate and specific immune responses. Macrophages proliferate in presence of their growth factor, M-CSF. The addition of bacterial lipopolysacharide, LPS, induces macrophage activation and stops their proliferation engaging a pro-inflammatory response. The activation of ERK MAPK is required for both macrophage proliferation and activation. However, different time-course of ERK activation is displayed. Proliferation is a process dependent on early and short ERK activation, whereas LPS addition delays and elongates ERK activation inducing an inflammatory response. Proliferating or activating responses are balanced by the extent and duration of ERK phosphorylation that is regulated by mitogen kinase phosphatase MKP1 (DUSP1). MKP1 is induced by both M-CSF and LPS and its kinetics of induction is correlated with those of inactivation of MAPKs. The induction of MKP-1 by M-CSF or LPS is mediated by PKC-epsilon.Our studies in primary cultures of murine bone marrow derived macrophages, show that MKP-1 expression by both M-CSF and LPS is dependent on activation of Raf-1 kinase, and its interaction with PKC Õ. The time-course of activation of ERK is correlated with that of Raf-1 and MEK-1/2. The use of specific inhibitors and RNA of interference, has shown that ERK activation during proliferation is dependent on Raf-1 activation, whereas in response to inflamatory stimuli such as LPS an alternative pathway to Raf-1 to direct the activation of these kinases. Inhibition of Raf-1 activity causes a growth arrest. The cell cycle blockage at G1 phase correlated with increased expression of cyclin-dependent kinase (Cdks) inhibitors, p21Waf1 and p27Kip1. On the other hand, no effects were observed during macrophage activation as assessed by pro-inflammatory cytokine expression and induction of nitric oxide synthase following LPS stimulation. In addition, the transcriptional induction of MKP-1 phosphatase by both M-CSF and LPS is independent of ERK and p38 activation, but dependent on JNK activation as assessed using inhibitors. In consequence to inactivation of MKP-1, an elongation of other MAPKs activity, ERK and p38, is observed. Macrophages constitutively express JNK1 and JNK2 isoforms, while no JNK3 is detected. JNK1 is the main isoform involved in JNK activity. Using single knock-out mice for jnk1 and jnk2 genes, we have demonstrated that MKP-1 induction is mediated by JNK1 isoform. Moreover, JNK1 is also required for biosynthesis of proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-1beta and IL-6) and for induction of nitric oxide synthase. This requirement is independent on JNK1 function as regulator of MKP-1 induction, as shown using knock-out mice for this phosphatase. These data indicate that Raf-1 is critical in ERK MAPK activation during macrophage proliferation whereas its absence does not compromise macrophage activation. Furthermore, Raf-1 is involved in the expression of MKP-1 phosphatase implicated in MAPK deactivation, through interaction with PKC-epsilon isoform. In addition, MKP-1 phosphatase expression is also dependent on JNK activity suggesting a selfregulation of MAPKs through induction of phosphatases. From different JNK isoforms, JNK1 is involved both in the expression of MKP-1 phosphatase and displays a direct role in the LPS-dependent macrophage activation.

Los microRNAs (miRNAs) son unas pequeñas moléculas de RNA (20-25nt) que no codifican para proteína, sin embargo actúan inhibiendo la traducción a proteína de RNAs mensajeros mediante la unión a su región UTR 3'. Se ha visto que estos miRNAs juegan un papel esencial en la regulación de la diferenciación celular y en el mantenimiento del estado pluripotente en las células madre. De la misma manera se los ha visto desregulados en múltiples tumores, llegando a ser considerados en algunos casos oncogenes o genes supresores de tumores.En la presente tesis se realizado un análisis de la expresión de miRNAs maduros en dos modelos tumorales diferentes: por un lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en tejido tumoral y normal de pacientes afectos de cáncer colorectal y en muestras de colon embrionario humano de embriones de 7-12 semanas de desarrollo. Por otro lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en ganglios de pacientes afectos de linfoma de Hodgkin clásico y en ganglios normales. Para ello se han analizado un total de 156 miRNAs maduros mediante stem-loop RT-PCR y PCR a tiempo real(TaqMan). La validación de los resultados se ha realizado mediante el uso de líneas celulares (DLD1 de cáncer colorectal, y L-428, HD-MY-Z y L-1236 de linfoma de Hodgkin) y mediante hibridación in situ de miRNAs con sondas de tipo LNA(Exiqon) en la plataforma automática Bond Max (Vision Biosystems).En el análisis del cáncer colorectal y la embriogénesis del colon se ha detectado una expresión solapada de miRNAs entre la mucosa colónica embrionaria y el cáncer colorectal. Se ha determinado una firma de miRNAs que caracteriza al cáncer colorectal de estadio I y II. Se ha definido también el patrón de expresión de miRNAs durante la embriogénesis del colon. Además hemos demostrado que el cluster de miRNAs miR-17-92 y su proteína diana E2F1 comparten un patrón de expresión común entre la embriogénesis del colon humano y la carcinogénesis colorectal, actuando en la regulación del proceso de proliferación celular. En este sentido, la hibridación in situ confirmó la sobreexpresión de miR-17-5p en la base de las criptas colónicas, en el compartimiento proliferativo. Por otro lado, en el estudio del patrón de expresión de miRNAs en el linfoma de Hodgkin clásico (LHc), se ha encontrado una firma de 25 miRNAs que caracterizan a este LHc. Entre estos miR-21, miR-134 y miR-138 mediante hibridación in situ se los ha detectado en el citoplasma de las células de Hodgkin/Reed Sternberg (H/RS). La validación de los 25 miRNAs en las líneas celulares ha demostrado que 20 son expresados por las líneas celulares y únicamente 5 son de expresión exclusiva del microambiente reactivo. Por otro lado se han definido 32 miRNAs que permiten discriminar entre el subtipo histológico esclerosis nodular, del subtipo celularidad mixta, de los cuales 11 mostraban diferencias que caracterizaban a las células tumorales de un tipo u otro. Además se analizó si la presencia del virus de Epstein Barr (EBV) estaba alterando el patrón de miRNAs en los pacientes de LHc EBV+ respecto a los EBV-, y se encontraron un conjunto de 10 miRNAs diferencialmente expresados entre los dos grupos de pacientes. Finalmente se vio que miR-138 estaba sobreexpresado en estadios iniciales (I-II) y se infraexpresaba en estadios avanzados (III-IV).Los miRNAs se deben considerar como moléculas claves tanto en la embriogénesis del colon, como en la transformación neoplásica del epitelio colónico, así como en el LHc, pudiendo ser utilizadas en un futuro como herramienta terapéutica. / MicroRNAs (miRNAs) are negative regulators of gene expression that play an important role in hematopoiesis and tumorigenesis and have been shown to be essential to regulate cell differentiation and maintenance of the pluripotent cell state.To date, no evidence has linked miRNA expression in embryonic and tumor tissue. We assessed the expression of mature miRNAs in human embryonic colon tissue and in colorectal cancer and paired normal colon tissue. Overlapping miRNA expression was detected between embryonic colonic mucosa and colorectal cancer. We demonstrated that miR-17-92 cluster and expression of its target E2F1 share a common pattern between human colon embryogenesis and colonic carcinogenesis, regulating the proliferation process. In this sense, in situ hybridization assay confirmed the overexpression of miR-17-5p in the crypt progenitor compartment. miRNAs pathways must be considered to be included as major players contributing to both embryonic development and neoplastic transformation of colonic epithelium. In other hand, we analyzed miRNA expression in classic Hodgkin lymphoma (cHL) and the influence of Epstein-Barr virus (EBV) infection on the miRNA expression profiles. The expression of 157 miRNAs in lymph nodes from 49 cHL patients and 10 reactive lymph nodes (RLNs) was analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Hierarchic clustering revealed 3 well-defined groups: nodular sclerosis cHL, mixed cellularity cHL, and RLNs. A distinctive signature of 25 miRNAs differentiated cHL from RLNs, and 36 miRNAs were differentially expressed in the nodular sclerosis and mixed cellularity subtypes. These results were validated in a set of 30 cHLs and 5 RLNs, and in 3 cHL cell lines. miR-96, miR-128a, and miR-128b were selectively down-regulated in cHL with EBV. Our findings suggest that miRNAs play an important role in the biology of cHL and may be useful in developing therapies targeting miRNAs.

La proteïna desacoblant mitocondrial UCP3, expressada en teixits metabòlicament molt importants (muscular i adipós marró) i homòloga a la proteïna termogènica UCP1, ha estat motiu de nombrosos estudis en els darrers anys dirigits a determinar la seva funció. Són moltes les dades bioquímiques i cel·lulars obtingudes, però la realitat és que la seva funció fisiològica bàsica en l'organisme no es coneix encara amb claretat. Amb aquest objetiu i mitjançant l'estudi d'expressió gènica en múscul esquelètic i teixits adiposos de ratolí knockout per UCP3 hem observat que: 1. L'absència d'UCP3 per disrupció dirigida del seu gen en aquests ratolins no causa alteracions significatives d'expressió de gens implicats en estrés oxidatiu en múscul esquelètic de ratolins nounats, tot i que en aquest període l'expressió d'UCP3 es veu fortament induïda en el ratolí wild-type. 2. En ratolins adultsknockout per a UCP3 en procés d'envelliment no es produeixen alteracions significatives dels paràmetres metabòlics circulants i l'expressió de gens implicats en estrés oxidatiu i metabolisme energètic en múscul esquelètic, teixit adipós marró, teixit adipós blanc i fetge resulta mínimament afectada. L'anàlisi massiu d'expressió gènica en múscul mitjançant microarray de genoma complet, tampoc evidencia alteracions substancials. 3. L'exposició perllongada a una dieta hiperlipídica sense carbohidrats en ratolins en envelliment dóna lloc a un increment de pes corporal sense alteracions destacables a nivell de metabolits circulants. Aquesta dieta provoca un fort increment d'expressió de la proteïna d'UCP3 a múscul esquelètic. 4. La dieta hiperlipídica té efectes diferencials en els ratolins knockout per UCP3, que es manifiesten en un increment específic de còssos cetònics circulants i en alteracions de l'expressió de gens implicats en estrés oxidatiu i metabolisme energètic. Això es produeix especialment en teixit adipós marró i fetge, veient-se en general, incrementada l'expressió de gens del catabolisme lipídic. 5. Malgrat la baixada d'expressió de Pref-1 en teixits adults, aquest gen es mostra sensiblement regulat, induint-se en teixit adipós marró degut a la manca d'UCP3 i en teixit adipós blanc en resposta a la dieta hiperlipídica.El teixit adipós marró i el teixit adipós blanc tenen un paper oposat al balanç energètic de l'individu. Davant l'evidència de Pref-1 com a controlador negatiu de la diferenciació de l'adipòcit blanc, ens plantejàrem l'estudi de la seva funció biològica en teixit adipós marró així com la seva regulació mitjançant models cel·lulars d'adipòcits marrons en cultiu i models d'animals modificats genèticament. Els nostres resultats indiquen que: 1. L'absència de Pref-1 per disrupció dirigida del gen (ratolins knockout per Pref-1) causa alteracions morfològiques i d'expressió gènica en el teixit adipós marró durant el desenvolupament, consistents en una sobreactivació termogènica del teixit. Això suggereix un potencial papel repressor de Pref-1 en aspectes específics (programa termogènic) de la diferenciació del teixit adipós marró respecte el blanc. No obstant, aquesta alteració sembla no mantenir-se en ratolins adults sota un estímul termogènic. 2. A diferència del teixit adipós blanc, el desenvolupament del teixit adipós marró es dóna en el període fetal, en un context d'elevada expressió del gen Pref-1. 3. En adipòcits marrons, el gen Pref-1 té regulació positiva per C/EBP-beta i sobretot, per C/EBP-delta que actua com a factor de transcripció regulador del promotor gènic de Pref-1. Aquest fet explicaria la potent sobreinducció de Pref-1 en teixit adipós marró de ratolins knockout per C/EBP-alfa, on s'observa sobreexpressió de C/EBP-beta i C/EBP-delta. Aquests resultats indicarien un paper diferencial de C/EBP-delta sobre la diferenciació i expressió gènica de l'adipòcit marró respecte l'adipòcit blanc. / Study of UCP3 and Pref-1 gene regulation in muscular and adipose tissuesAbstract: Mitochondrial uncoupling protein 3 (UCP3) homologous to termogenic UCP1, is mainly expressed in muscular and brown adipose tissues but its physiological function remains unknown. We have carried out gene expression studies in skeletal muscle and adipose tissues of UCP3 knockout mice and we have observed: 1. UCP3 gene deletion in those mice does not impairs oxidative stress related gene expression in skeletal muscle from newborn mice, althought UCP3 gene expression is dramatically induced in wild-type mice during this period. 2. Ageing does not impairs blood parameters neither expression of genes related to oxidative stress and oxidative metabolism in skeletal muscle, brown (BAT) and white (WAT) adipose tissues and liver from knockout mice. Whole genome microarray did not show clear changes in gene expresion. 3. Long term high-fat carbohidrate free diet feeding during agening lead to body weight increase without any change in blood parameters, and a significant increase in UCP3 protein content in skeletal muscle. 4. This diet caused diferential effects on knockout mice: blood ketone bodies increment and impaired expression of genes related to oxidative stress and energetic metabolism. 5. Pref-1 gene is sensitively regulated in adult brown and white fat.BAT and WAT have and oposite role in energy balance. Since Pref-1 has been described as a negative regulator of white adipocyte differenciation, we have studied its biological function and regulation on brown adipocytes and on BAT. 1. Pref-1 gene disruption (Pref-1 knockout mice) impairs BAT morfology and gene expression during its development, consisting on a thermogenic overactivation. This suggest a specific potential repressor rol for Pref-1 compared to WAT differentiation. Nevertheless, these changes do not persist in adult mice under thermogenic stimulus. 2. Unlike WAT, BAT development take place in foetal period, in presence of a high Pref-1 gene expression. 3. In brown adipocytes, Pref-1 gene is positively regulated by C/EBP-beta and specially by C/EBP-delta transcription factors. This fact can explain Pref-1 strong overinduction in BAT from C/EBP-alpha knockout mice which also displays C/EBP-beta and C/EBP-delta overexpression. These results suggest differential rol for C/EBP-delta in brown adipocyte differentiation and gene expression compared to white adipocyte.

La línea celular HT-29 M6 es una línea tumoral humana derivada de adenocarcinoma de colon, con capacidad de diferenciación in vitro hacia un fenotipo mucosecretor, obtenida por selección con 10-7 M y 10-6 M de metotrexato, en tratamientos sucesivos, de la línea parental indiferenciada HT-29 (Lesuffleur T, et al, 1990). Nosotros utilizamos esta línea celular como modelo para estudiar el proceso de diferenciación in vitro que ocurre de manera espontánea durante el crecimiento hacia confluencia. Los resultados que presentamos en este trabajo aportan evidencias sólidas acerca del papel del calcio extracelular como modulador no sólo de la epitelialización, sino también del ciclo celular y de la expresión génica durante la diferenciación in vitro. Aunque puede existir más de un mecanismo por el que el calcio extracelular sea responsable de los efectos observados, los resultados obtenidos son consistentes con el requerimiento de contactos de adhesión para la diferenciación epitelial. Además, los resultados sugieren que reguladores del ciclo celular, concretamente ciclina D1 y p27, desempeñan un papel determinante en el control del programa de expresión génica durante la diferenciación. Este resultado es muy relevante ya que: (1) su función parece tener lugar de manera general sobre el programa de expresión génica, y (2) al estar estas proteínas implicadas en la progresión tumoral, su mecanismo de acción emerge como una diana para manipular el fenotipo de diferenciación celular y con ello la tumorigenicidad. Por otro lado, hemos descubierto que parte del proceso de diferenciación in vitro es independiente de la formación de contactos de adhesión y de la epitelialización, concretamente niveles basales de expresión génica asociada a diferenciación y la producción de vesículas de moco. Asimismo, en condiciones de no adherencia celular, las células no adquieren capacidad invasiva, lo cual nos está indicando que la desdiferenciación celular observada en tumores y la adquisición de capacidad invasiva podría tener lugar por vías separadas. Finalmente, hemos obtenido evidencias preliminares acerca de la existencia de una vía de regulación de APC sobre p21CIP1 cuya inactivación podría estar relacionada con la reversibilidad del programa de diferenciación in vitro y con su incapacidad para llevar a término un programa de diferenciación terminal.

El pàncrees és una glàndula secretora formada per teixit exocrí i endocrí. El compartiment endocrí està format per les cèl•lules alpha (productores de glucagó), les cèl•lules beta (productores d'insulina), les cèl•lules delta (somatostatina), les cèl•lules PP (polipèptid pancreàtic) i les cèl•lules epsilon (grelina). La Diabetis Mellitus és un grup de malalties metabòliques que es caracteritzen per mantenir nivells elevats de glucosa en sang com a resultat de la incapacitat de produir o utilitzar la insulina. Les cèl•lules productores d'insulina són les cèl•lules beta del pàncrees. Actualment, el tractament de la diabetis es basa en injeccions periòdiques d'insulina. Per solucionar i millorar la vida d'aquests pacients hi ha molts grups que treballen per trobar noves fonts de cèl•lules productores d'insulina que recuperin la massa de cèl•lules beta perdudes durant la diabetis. Per a això, és necessari conèixer detalladament els passos que se succeeixen per generar una cèl•lula productora d'insulina a partir d'una cèl•lula indiferenciada. Durant la organogènesi pancreàtica s'activen un conjunt de factors de transcripció que són essencials per a la correcta formació de l'òrgan, entre ells el factor proendocrí Neurogenina3 (Neurog3), així com també un seguit de senyals extrínsecs (vies de senyalització) que participen en aquest procés. Neurogenina3 és un factor de transcripció de la família bHLH que exerceix un paper essencial en la diferenciació endocrino-pancreàtica, ja que en la seva absència no hi ha formació de les cèl•lules endocrines del pàncrees. En el primer objectiu d'aquesta tesi hem identificat possibles noves dianes de Neurog3, mitjançant l'ús d'un model de diferenciació endocrina in vitro de cèl•lules ductals pancreàtiques, en el qual la sobreexpresió de Neurog3 indueix l'activació del programa transcripcional endocrino-pancreàtic. Mitjançant l'estudi de canvis globals en el perfil d'expressió gènica d'aquestes cèl•lules hem identificat un conjunt de gens relacionats amb la via de senyalització Wingless (Wnt) com a dianes potencials de Neurog3 in vitro. Entre aquests gens, hem centrat els nostres estudis en l'anàlisi del gen que codifica pel lligand de la via Wnt, Wnt9a. El segon objectiu d'aquesta tesi se centra a estudiar la possible participació del lligand Wnt9a en el procés de diferenciació endocrina del pàncrees. Així, vam demostrar per primera vegada la presència en pàncrees embrionari de ratolí del mRNA de Wnt9a, així com la regulació gènica d'aquest lligand per part de factors de transcripció que participen al programa de diferenciació endocrina. Estudiem també el paper de Wnt9a dins de la cascada endocrino-pancreàtica, demostrant un paper regulador de Wnt9a sobre els efectes promoguts per Neurog3 en alguns dels gens endocrins estudiats. Aquests resultats ens han portat al tercer objectiu d'aquesta tesi: caracterització de la diferenciació endocrino-pancreàtica en el model murí gen-anul•lat per Wnt9a. A estadi e18.5 (just abans del naixement) observem un augment generalitzat de les cèl•lules productores d'hormones del compartiment endocrí (cèl•lules β insulina-positives, cèl•lules α glucagó-positives i cèl•lules δ somatostatina-positives) en relació a l'àrea pancreàtica total, que correlaciona amb una major taxa de proliferació d'aquestes. L'anàlisi de l'expressió gènica realitzat a estadi e15.5 (moment de màxima expansió endocrina) no mostra diferències en els nivells del mRNA de Neurog3, indicant que l'augment en el compartiment endocrí observat a e18.5 no es deu a una major especificació endocrina. No obstant això, l'estudi de diferents factors integrants del programa transcripcional endocrí mostra un augment en l'expressió de Pdx1 en els animals deficients que podria explicar l'augment en cèl•lules beta observat a e18.5. Per tant, en aquesta tesi definim per primera vegada la relació directa entre factors de transcripció bHLH i components de la via Wnt en pàncrees, així com identifiquem la presència del mRNA de Wnt9a en pàncrees embrionari de ratolí i en illots adults. Demostrem la regulació gènica de Wnt9a per part de factors de la cascada de transcripció endocrina, així com la regulació d'aquests per part de Wnt9a sota l'acció de Neurog3. Identifiquem, mitjançant l'estudi del model animal gen anul•lat per Wnt9a, un augment del compartiment endocrí abans del naixement, a causa d'una major taxa de proliferació, en absència de Wnt9a. Per tant, el conjunt d'aquests resultats indicaria que la via de senyalització Wnt juga un paper important durant el procés de diferenciació endocrina del pàncrees, suggerint una connexió entre el programa transcripcional endocrí i la via de senyalització intracel•lular Wnt. / The pancreas is a gland consisting of secretory exocrine and endocrine tissue. The endocrine compartment is formed by the alpha cells (glucagon producing), the beta cells (insulin producing), delta cells (somatostatin), PP (pancreatic polypeptide) cells and epsilon cells (ghrelin). Diabetes Mellitus is a group of metabolic diseases characterized by maintaining high levels of blood glucose resulting from the inability to produce or use insulin. Currently, the treatment for diabetes is based on regular injections of insulin. There are many groups working on finding new sources of insulin-producing cells to recover beta cells mass lost during diabetes development. For this reason, it’s necessary to detail the molecular steps that occur from an undifferentiated cell to an insulin-producing cell. During pancreatic organogenesis, a set of transcription factors that are essential for proper formation of the organ are activated, including the proendocrine factor Neurogenin3 (Neurog3), as well as a number of extrinsic signals (signalling pathways). Neurogenin3 is a transcription factor that belongs to bHLH transcription factors family. It plays an essential role in pancreatic-endocrine differentiation, since in its absence there is no formation of endocrine cells. In the first objective of this thesis we have identified potential new targets for Neurog3, using an in vitro model of endocrine differentiation process, pancreatic ductal cells (mPAC), in which adenoviral overexpression of Neurog3 induces the activation of the transcriptional differentiation program. Using whole genomic profile study, we identified a set of genes related to signalling Wingless (Wnt) pathway as potential targets of Neurog3 in vitro. Among these genes, we focused our studies on the analysis of the gene encoding the ligand of the Wnt pathway, Wingless- type MMTV integration site 9A (Wnt9a). The second objective of this thesis focuses on the study of the possible role of Wnt9a during endocrine differentiation. Thus, we demonstrate for the first time, the presence of Wnt9a mRNA in mouse embryonic pancreas, as well as its regulation by transcription factors involved in endocrine differentiation program. We studied the role of Wnt9a within the endocrine differentiation cascade, demonstrating a regulatory role of Wnt9a on some Neurog3 activated genes. Finally, we did the characterization of the endocrine differentiation process in the Wnt9a knock out animal mouse model. At embryonic stage (e) 18.5 (just before birth), we observed a general increase in the major hormone-producing cells of the endocrine compartment (β cell insulin-positive, α cells glucagon-positive cells and δ somatostatin- positive) in relation to the total pancreatic area, which correlated with a high rate of proliferation. The analysis of gene expression performed at (e) 15.5 (time of maximum endocrine expansion) shows no difference in levels of Neurog3 mRNA, indicating that the increase in the endocrine compartment observed at (e) 18.5 is not due to a greater endocrine specification. However, the study of transcriptional endocrine factors shows an increase in the expression of Pdx1 gene in the deficient Wnt9a animals; this could explain the increase in beta cells observed at (e) 18.5. Therefore, this thesis define for the first time the direct relationship between bHLH transcription factors and components of the Wnt pathway in the pancreas, as well as the identification of Wnt9a mRNA in embryonic mouse pancreas and in adult islets. We demonstrate the regulation of Wnt9a by transcription factors of the endocrine cascade and the regulation of some of them by Wnt9a. We have identified an increase of the endocrine compartment, just before birth, in Wnt9a deficient animals, probably due to a higher rate of proliferation in the absence of Wnt9a. Hence, all these results indicate that Wnt signalling pathway plays an important role during pancreatic endocrine differentiation, suggesting a connection between the endocrine transcriptional program and Wnt signalling.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC IDIBAPS) / Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal. / Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.

The present thesis entitled “Construction of versatile biomolecule nano-platforms via Dip-pen Nanolithography and their application in bio-sensing and cell differentiation” aims at contributing to the field of Nanobiotechnology, best defined as miniaturized biotechnology where nanofabrication technology is used for biological purposes. To this end, this research work employs the relatively novel nanofabrication technique called Dip-pen Nanolithography (DPN) for direct patterning of biologically relevant molecules at the micro- and nanoscale, both for biosensor applications and cell differentiation studies. - The first chapter deals with the challenges encountered when working with Dip-pen Nanolithography and so called multi-pens. In order to facilitate the levelling of the tips with respect to the substrate and also to obtain a constant feedback of the force exerted from the tips to the substrate, a device was developed and fabricated together with a collaboration. The resulting piezoresistive device could be implemented successfully and was used to pattern two different molecules on gold substrates. An improved sensitivity at detecting the touching point could be shown when compared to conventional tips. - The second chapter deals with the miniaturization of an already in-house developed biosensor platform. Therefore, several different approaches were evaluated for the DPN patterning of oligonucleotides on gold or chemically modified glass in order to ensure a covalent attachment. The most successful strategy was the click chemistry route, where an azide bearing oligonucleotide was coupled to an alkyne bearing glass substrate, using a copper catalyst (1,3-dipolar cycloaddition) yielding an triazole. This way, a sensor platform could be established and the sensitivity could be assessed. - The third chapter deals with the development and fabrication of DPN patterned substrates for cell differentiation experiments. A biotin-thiol was chosen for patterning because it allows derivatization with streptavidin and any type of biotinylated molecule. The patterning was accomplished, using a lipid as a carrier molecule. This way, the feature size of the pattern was around 5 µm and the overall pattern area was bigger than 1 mm². The substrates were applied successfully in cell differentiation experiments, having a biotinylated BMP-2 immobilized on the substrates. / La presente tesis titulada "Construcción de nanoplataformas biomoleculares versátiles vía Nanolitografía Dip-pen y su aplicación en bio-sensing y diferenciación celular" pretende contribuir al campo de la nanobiotecnología, definida como la biotecnología en miniatura donde se utiliza la tecnología de nanofabricación con fines biológicos. Con este objectivo, este trabajo de investigación emplea la relativamente novedosa técnica de nanofabricación llamada Dip-Pen Nanolitografía (DPN) para obtener un patrón de moléculas biológicamente relevantes a micro y nanoescala, tanto para aplicaciones de biosensores como para los estudios de diferenciación celular. - El primer capítulo trata de los desafíos encontrados al trabajar con Dip-Pen Nanolitografía y los llamados multi-pens. Con el fin de facilitar la nivelación de la punta con respecto al sustrato y obtener un control constante de la fuerza ejercida desde las puntas al sustrato, se desarrolló y fabricó un dispositivo. El dispositivo piezo-resistivo resultante se pudo aplicar con éxito y se utilizó para la fabricación de patrones de dos moléculas diferentes en sustratos de oro. Se obtuvo una mejora de la sensiblidad en la detección del punto de contacto en comparación con puntas convencionales - El segundo capítulo trata de la miniaturización de una plataforma biosensora que ya se había desarollado previamente en el laboratorio. Se evaluaron varios métodos diferentes para la fabricación de un patrón de oligonucleótidos mediante DPN sobre oro o sobre vidrio modificado químicamente con el fin de asegurar una unión covalente. La estrategia más exitosa resultó ser la ruta de química click, donde un oligonucleótido con un grupo azida se acopla a un sustrato de vidrio que presenta un grupo alquino, utilizando un catalizador de cobre (cicloadición 1,3-dipolar) y produciendo un triazol. De esta manera, se pudo establecer una plataforma sensora y se pudo evaluar su sensibilidad - El tercer capítulo trata del desarrollo y la fabricación sustratos con patrón mediante DPN para experimentos de diferenciación celular. Una molécula de biotina-tiol fue elegida como patrón, ya que permite la derivatización con estreptavidina y, en un segundo paso, cualquier tipo de molécula de biotina. El patrón se llevó a cabo usando un lípido como molécula para facilitar el transporte de la tinta. De esta manera, el tamaño de la característica del patrón fue de alrededor de 5 micras y el área de patrón general más grande que 1 mm ². Los sustratos se aplicaron con éxito en experimentos de diferenciación celular, usando la proteína BMP-2 biotinilada inmovilizada sobre los sustratos.