Orientador: Renée Laufer Amorim / Resumo: As alterações na expressão de E-caderina, -catenina, APC e Caveolina-1 nas células epiteliais prostáticas têm sido estudados em humanos como mecanismos relacionados com progressão tumoral, invasão e metástase. Estas proteínas estão envolvidas no processo de adesão celular e ativação da via WNT canônica. No cão, a perda da expressão proteica de E-caderina e a translocação da -catenina da membrana para o citoplasma/núcleo foram descritas anteriormente em lesões prostáticas caninas. No entanto, nenhum estudo correlacionou alterações de expressão dessas proteínas com as proteínas APC e Caveolina-1. Devido ao prognóstico desfavorável do carcinoma prostático (CaP) no cão e a importância da identificação de novos marcadores prognósticos e preditivos, o presente estudo visou avaliar as expressões gênica e proteica de E-caderina, -catenina, APC e Caveolina-1 em diferentes lesões prostáticas caninas, além de avaliar o padrão de metilação do gene APC. Foram utilizados neste estudo 10 CaPs, 4 metástases de carcinoma prostático, 10 amostras de atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e 10 próstatas normais de cães para análise imuno-histoquímica. Para a técnica de RT-qPCR forma utilizados 11 próstatas normais, 11 PIA, 17 CaPs e 3 metástases. Para análise de metilacão foram utilizadas seis próstatas normais, seis próstatas com PIA e 12 CaPs. Este estudo revelou aumento de expressão gênica e proteica de Caveolina-1 nas amostras de CaP e metástases, além de menor expressão nas amostras de ca... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Altered expression of E-cadherin, -catenin, APC and Caveolin-1 in prostate epithelial cells has been studied in humans as mechanisms related with tumor progression, invasion and metastasis. These proteins are envolved in cell-cell cohesion and participate in the activation of the canonical WNT pathway. In dogs, membranous E-cadherin loss and translocation of -catenin from the membrane to cytoplasm/nucleus were described previously in canine prostatic lesions. However, studies correlating these genes have not been reported their proteins with APC and Caveolin-1 expressions in canine prostatic lesions. Due to poor prognosis in canine prostate carcinoma (PC) and the need to develop new prognostic and predictive biomarkers, this study aimed to evaluate gene and protein expression of E-cadherin, -catenin, APC and Caveolin-1 in different canine prostatic lesions, and the methylation status of APC gene. We used 10 PC, 4 prostate metastasis, 10 proliferative inflammatory atrophy(PIA) and 10 canine normal prostates tissues for immunohistochemistry. For RT-qPCR we used 11 normal prostate, 11 PIA, 17 PC and 4 metastasis. For methylation analysis, we used six normal prostates, 6 PIA and 13 PC. This study revealed increased Caveolin-1 gene and protein expression in PC and metastasis and lower expression were found in tumors with lower Gleason score. Membranous E-cadherin and - catenin staining was observed in normal prostate samples whereas heterogenous loss was detected in other samples.... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

INTRODUÇÃO: A molécula HIG2 pode atuar como agonista da via Wnt/beta-catenina, pois se liga ao receptor Frizzled 10 e induz a expressão de genes da mesma. Dados recentes do nosso grupo mostraram expressão diferencial do gene HIG2 em células mononucleares do sangue periférico e em especial linfócitos T CD4+ naïve, mas não em células diferenciadas de memória em indivíduos sadios. Também observamos in vitro em linfócitos T CD4+ de indivíduos saudáveis que o peptídeo sintético HIG2 induziu a ativação da via Wnt/beta-catenina, produção de HIG2 e outros produtos da via, além da proliferação de células T CD4+ naïve sugerindo um papel do HIG2 na proliferação homeostática de linfócitos T CD4+. HIPÓTESE: Como as células T CD4+ naïve são diretamente exportadas pelo timo, os níveis aumentados de HIG2 neste tipo celular sejam decorrentes da ativação da via Wnt/?-catenina nos estágios tardios da diferenciação de timócitos. Portanto, as células T CD4+ naïve e timócitos simples positivos para CD4 (SP CD4) apresentariam perfil semelhante de expressão de HIG2 e genes da via Wnt/beta-catenina, incluindo receptores, fatores de transcrição, genes estruturais da via e alvos quando comparadas as demais populações celulares. OBJETIVO: Avaliar a expressão de HIG2 e outros genes da via Wnt/beta-catenina em timócitos e linfócitos T CD4+ naïve e memória de camundongos. MÉTODOS: Isolamos timócitos duplo negativos (DN), timócitos duplo positivos (DP), simples positivos para CD4 e CD8 (SP CD4 e SP CD8) de timo e também células T CD4+ naïve e memória do baço dos mesmos camundongos pelo procedimento de citometria de fluxo. Analisamos a expressão de vários genes da via Wnt/beta-catenina por PCR em tempo real. RESULTADOS: Em timócitos DN há expressão significativa dos genes que codificam para Frizzled 6, LRP5, TCF-1 e TCF-4 em relação as outras populações celulares. Nos timócitos DP há maior expressão dos genes que codificam para LRP5, LRP6, beta-catenina, GSK-3beta, TCF-1 e Bcl-XL em relação às demais populações. Em timócitos SP CD4 foi detectada expressão diferencial de genes que codificam para Frizzled 10, LRP6, beta-catenina, LEF-1 e HIG2 enquanto que na população de timócitos SP CD8 não observamos expressão significativa de nenhum gene da via Wnt/beta-catenina. Nas células T CD4+ naïve há expressão significativa de Frizzled 5 e Frizzled 10 quando comparadas a timócitos SP CD8 e células T CD4+ de memória . Já nos linfócitos T CD4+ de memória, detectamos maior expressão de Frizzled 6, TCF-4, Bcl-XL e ciclina D1 em relação as demais populações. CONCLUSÃO: Cada população apresenta um perfil distinto de expressão gênica. As maiores semelhanças ocorrem entre os timócitos DN e DP onde as principais diferenças são a expressão de Frizzled 6 e Ciclina D1.Os timócitos SP CD4 e as células T CD4+ naïve não apresentaram níveis semelhantes de expressão gênica de elementos da via Wnt canônica, o que não corrobora a hipótese de que o perfil transcripcional de timócitos SP CD4 e linfócitos T CD4+ naïve é semelhante. Ainda, não observamos expressão aumentada de HIG2 em linfócitos T CD4+ naïve comparados aos de memória, o que contrasta com os resultados obtidos anteriormente por nosso grupo com amostras humanas sugerindo que camundongos não regulam a expressão de HIG2 em linfócitos T CD4+ como os seres humanos / INTRODUCTION: HIG2 molecule can act as an agonist of Wnt/?-catenin pathway, because it able to bind to Frizzled 10 receptor and induce the expression of the genes related to this pathway. Recent data from our group have shown differential expression of the HIG2 gene in peripheral blood mononuclear cells, and particularly in naive CD4 + T cells, but not in memory T cells in healthy individuals. We have also observed that inducing the CD4 + T lymphocytes from healthy individuals with HIG2 synthetic peptide in vitro, led to the activation of Wnt/beta-catenin pathway, HIG2 production and expression of other target genes of this pathway and the proliferation of naïve CD4 + T cells, suggesting that HIG2 may play a role in homeostatic proliferation of CD4+ T cells. HYPOTHESIS: As naïve CD4 + T cells are directly exported from the thymus, we have hypothesized that increased levels of HIG2 in this cell type is due to the activation of Wnt/beta-catenin pathway in the later stages of thymocyte differentiation. Therefore, naïve CD4 + T cells and CD4 single-positive thymocytes (CD4 SP) may share a similar pattern of gene expression of HIG2 and Wnt/beta-catenin genes (genes that encodes receptors and co-receptors, transcription factors, structural and target genes) when compared to other cell populations. AIM: our major aim is to evaluate the expression of HIG2 and other genes of the Wnt/beta-catenin in thymocytes, naïve CD4 + T lymphocytes and memory CD4+ T cells from mice. METHODS: We have isolated thymocytes double negative (DN) T cells, positive double positive (DP) T cells, CD4 and CD8 single-positive thymocytes (CD4 SP and CD8 SP) of thymus from BALB/c mice and we have also isolated naïve CD4 + T cells and memory CD4+ T cells of the spleen from the same mice we have used the thymus. We have analysed the expression of several genes of Wnt/beta-catenin by real time PCR RESULTS: In DN cells there was expression of the Frizzled 6, LRP5, TCF-1 and TCF-4 genes compared to other cell populations. In DP thymocytes it could be observed a greater expression of LRP5, LRP6, beta-catenin, GSK-3beta, TCF-1 and Bcl-XL genes compared to other populations. In CD4 SP thymocytes, it was detected differential expression of the Frizzled 10, LRP6, beta-catenin, LEF-1 HIG2 genes and in CD8 SP cells we could not observe significant expression of any gene of Wnt/?-catenin pathway. In naïve CD4 + T cells there was a significant expression of Frizzled5 and Frizzled 10 genes when compared to all the samples. In memory CD4 + T cells, we have detected higher expression of Frizzled 6, TCF-4, Bcl-XL and cyclin D1 genes than in any other populations. CONCLUSION: Each population has a distinct gene expression pattern. The biggest similarities occur between DN and DP thymocytes where the main differences are the expression of Frizzled 6 and cyclin D1.However, the pattern of gene expression in SP thymocytes is not similar to those presented by naïve CD4+ T cells. Moreover, we have not observed increased expression of HIG2 in naïve CD4 + lymphocytes compared to memory CD4+ T cells, which contrasts the results obtained previously by our group with human samples suggesting that mice might not regulate the HIG2 expression in CD4 + T lymphocytes as human beings do

El pàncrees és una glàndula secretora formada per teixit exocrí i endocrí. El compartiment endocrí està format per les cèl•lules alpha (productores de glucagó), les cèl•lules beta (productores d'insulina), les cèl•lules delta (somatostatina), les cèl•lules PP (polipèptid pancreàtic) i les cèl•lules epsilon (grelina). La Diabetis Mellitus és un grup de malalties metabòliques que es caracteritzen per mantenir nivells elevats de glucosa en sang com a resultat de la incapacitat de produir o utilitzar la insulina. Les cèl•lules productores d'insulina són les cèl•lules beta del pàncrees. Actualment, el tractament de la diabetis es basa en injeccions periòdiques d'insulina. Per solucionar i millorar la vida d'aquests pacients hi ha molts grups que treballen per trobar noves fonts de cèl•lules productores d'insulina que recuperin la massa de cèl•lules beta perdudes durant la diabetis. Per a això, és necessari conèixer detalladament els passos que se succeeixen per generar una cèl•lula productora d'insulina a partir d'una cèl•lula indiferenciada. Durant la organogènesi pancreàtica s'activen un conjunt de factors de transcripció que són essencials per a la correcta formació de l'òrgan, entre ells el factor proendocrí Neurogenina3 (Neurog3), així com també un seguit de senyals extrínsecs (vies de senyalització) que participen en aquest procés. Neurogenina3 és un factor de transcripció de la família bHLH que exerceix un paper essencial en la diferenciació endocrino-pancreàtica, ja que en la seva absència no hi ha formació de les cèl•lules endocrines del pàncrees. En el primer objectiu d'aquesta tesi hem identificat possibles noves dianes de Neurog3, mitjançant l'ús d'un model de diferenciació endocrina in vitro de cèl•lules ductals pancreàtiques, en el qual la sobreexpresió de Neurog3 indueix l'activació del programa transcripcional endocrino-pancreàtic. Mitjançant l'estudi de canvis globals en el perfil d'expressió gènica d'aquestes cèl•lules hem identificat un conjunt de gens relacionats amb la via de senyalització Wingless (Wnt) com a dianes potencials de Neurog3 in vitro. Entre aquests gens, hem centrat els nostres estudis en l'anàlisi del gen que codifica pel lligand de la via Wnt, Wnt9a. El segon objectiu d'aquesta tesi se centra a estudiar la possible participació del lligand Wnt9a en el procés de diferenciació endocrina del pàncrees. Així, vam demostrar per primera vegada la presència en pàncrees embrionari de ratolí del mRNA de Wnt9a, així com la regulació gènica d'aquest lligand per part de factors de transcripció que participen al programa de diferenciació endocrina. Estudiem també el paper de Wnt9a dins de la cascada endocrino-pancreàtica, demostrant un paper regulador de Wnt9a sobre els efectes promoguts per Neurog3 en alguns dels gens endocrins estudiats. Aquests resultats ens han portat al tercer objectiu d'aquesta tesi: caracterització de la diferenciació endocrino-pancreàtica en el model murí gen-anul•lat per Wnt9a. A estadi e18.5 (just abans del naixement) observem un augment generalitzat de les cèl•lules productores d'hormones del compartiment endocrí (cèl•lules β insulina-positives, cèl•lules α glucagó-positives i cèl•lules δ somatostatina-positives) en relació a l'àrea pancreàtica total, que correlaciona amb una major taxa de proliferació d'aquestes. L'anàlisi de l'expressió gènica realitzat a estadi e15.5 (moment de màxima expansió endocrina) no mostra diferències en els nivells del mRNA de Neurog3, indicant que l'augment en el compartiment endocrí observat a e18.5 no es deu a una major especificació endocrina. No obstant això, l'estudi de diferents factors integrants del programa transcripcional endocrí mostra un augment en l'expressió de Pdx1 en els animals deficients que podria explicar l'augment en cèl•lules beta observat a e18.5. Per tant, en aquesta tesi definim per primera vegada la relació directa entre factors de transcripció bHLH i components de la via Wnt en pàncrees, així com identifiquem la presència del mRNA de Wnt9a en pàncrees embrionari de ratolí i en illots adults. Demostrem la regulació gènica de Wnt9a per part de factors de la cascada de transcripció endocrina, així com la regulació d'aquests per part de Wnt9a sota l'acció de Neurog3. Identifiquem, mitjançant l'estudi del model animal gen anul•lat per Wnt9a, un augment del compartiment endocrí abans del naixement, a causa d'una major taxa de proliferació, en absència de Wnt9a. Per tant, el conjunt d'aquests resultats indicaria que la via de senyalització Wnt juga un paper important durant el procés de diferenciació endocrina del pàncrees, suggerint una connexió entre el programa transcripcional endocrí i la via de senyalització intracel•lular Wnt. / The pancreas is a gland consisting of secretory exocrine and endocrine tissue. The endocrine compartment is formed by the alpha cells (glucagon producing), the beta cells (insulin producing), delta cells (somatostatin), PP (pancreatic polypeptide) cells and epsilon cells (ghrelin). Diabetes Mellitus is a group of metabolic diseases characterized by maintaining high levels of blood glucose resulting from the inability to produce or use insulin. Currently, the treatment for diabetes is based on regular injections of insulin. There are many groups working on finding new sources of insulin-producing cells to recover beta cells mass lost during diabetes development. For this reason, it’s necessary to detail the molecular steps that occur from an undifferentiated cell to an insulin-producing cell. During pancreatic organogenesis, a set of transcription factors that are essential for proper formation of the organ are activated, including the proendocrine factor Neurogenin3 (Neurog3), as well as a number of extrinsic signals (signalling pathways). Neurogenin3 is a transcription factor that belongs to bHLH transcription factors family. It plays an essential role in pancreatic-endocrine differentiation, since in its absence there is no formation of endocrine cells. In the first objective of this thesis we have identified potential new targets for Neurog3, using an in vitro model of endocrine differentiation process, pancreatic ductal cells (mPAC), in which adenoviral overexpression of Neurog3 induces the activation of the transcriptional differentiation program. Using whole genomic profile study, we identified a set of genes related to signalling Wingless (Wnt) pathway as potential targets of Neurog3 in vitro. Among these genes, we focused our studies on the analysis of the gene encoding the ligand of the Wnt pathway, Wingless- type MMTV integration site 9A (Wnt9a). The second objective of this thesis focuses on the study of the possible role of Wnt9a during endocrine differentiation. Thus, we demonstrate for the first time, the presence of Wnt9a mRNA in mouse embryonic pancreas, as well as its regulation by transcription factors involved in endocrine differentiation program. We studied the role of Wnt9a within the endocrine differentiation cascade, demonstrating a regulatory role of Wnt9a on some Neurog3 activated genes. Finally, we did the characterization of the endocrine differentiation process in the Wnt9a knock out animal mouse model. At embryonic stage (e) 18.5 (just before birth), we observed a general increase in the major hormone-producing cells of the endocrine compartment (β cell insulin-positive, α cells glucagon-positive cells and δ somatostatin- positive) in relation to the total pancreatic area, which correlated with a high rate of proliferation. The analysis of gene expression performed at (e) 15.5 (time of maximum endocrine expansion) shows no difference in levels of Neurog3 mRNA, indicating that the increase in the endocrine compartment observed at (e) 18.5 is not due to a greater endocrine specification. However, the study of transcriptional endocrine factors shows an increase in the expression of Pdx1 gene in the deficient Wnt9a animals; this could explain the increase in beta cells observed at (e) 18.5. Therefore, this thesis define for the first time the direct relationship between bHLH transcription factors and components of the Wnt pathway in the pancreas, as well as the identification of Wnt9a mRNA in embryonic mouse pancreas and in adult islets. We demonstrate the regulation of Wnt9a by transcription factors of the endocrine cascade and the regulation of some of them by Wnt9a. We have identified an increase of the endocrine compartment, just before birth, in Wnt9a deficient animals, probably due to a higher rate of proliferation in the absence of Wnt9a. Hence, all these results indicate that Wnt signalling pathway plays an important role during pancreatic endocrine differentiation, suggesting a connection between the endocrine transcriptional program and Wnt signalling.

INTRODUÇÃO: A molécula HIG2 pode atuar como agonista da via Wnt/beta-catenina, pois se liga ao receptor Frizzled 10 e induz a expressão de genes da mesma. Dados recentes do nosso grupo mostraram expressão diferencial do gene HIG2 em células mononucleares do sangue periférico e em especial linfócitos T CD4+ naïve, mas não em células diferenciadas de memória em indivíduos sadios. Também observamos in vitro em linfócitos T CD4+ de indivíduos saudáveis que o peptídeo sintético HIG2 induziu a ativação da via Wnt/beta-catenina, produção de HIG2 e outros produtos da via, além da proliferação de células T CD4+ naïve sugerindo um papel do HIG2 na proliferação homeostática de linfócitos T CD4+. HIPÓTESE: Como as células T CD4+ naïve são diretamente exportadas pelo timo, os níveis aumentados de HIG2 neste tipo celular sejam decorrentes da ativação da via Wnt/?-catenina nos estágios tardios da diferenciação de timócitos. Portanto, as células T CD4+ naïve e timócitos simples positivos para CD4 (SP CD4) apresentariam perfil semelhante de expressão de HIG2 e genes da via Wnt/beta-catenina, incluindo receptores, fatores de transcrição, genes estruturais da via e alvos quando comparadas as demais populações celulares. OBJETIVO: Avaliar a expressão de HIG2 e outros genes da via Wnt/beta-catenina em timócitos e linfócitos T CD4+ naïve e memória de camundongos. MÉTODOS: Isolamos timócitos duplo negativos (DN), timócitos duplo positivos (DP), simples positivos para CD4 e CD8 (SP CD4 e SP CD8) de timo e também células T CD4+ naïve e memória do baço dos mesmos camundongos pelo procedimento de citometria de fluxo. Analisamos a expressão de vários genes da via Wnt/beta-catenina por PCR em tempo real. RESULTADOS: Em timócitos DN há expressão significativa dos genes que codificam para Frizzled 6, LRP5, TCF-1 e TCF-4 em relação as outras populações celulares. Nos timócitos DP há maior expressão dos genes que codificam para LRP5, LRP6, beta-catenina, GSK-3beta, TCF-1 e Bcl-XL em relação às demais populações. Em timócitos SP CD4 foi detectada expressão diferencial de genes que codificam para Frizzled 10, LRP6, beta-catenina, LEF-1 e HIG2 enquanto que na população de timócitos SP CD8 não observamos expressão significativa de nenhum gene da via Wnt/beta-catenina. Nas células T CD4+ naïve há expressão significativa de Frizzled 5 e Frizzled 10 quando comparadas a timócitos SP CD8 e células T CD4+ de memória . Já nos linfócitos T CD4+ de memória, detectamos maior expressão de Frizzled 6, TCF-4, Bcl-XL e ciclina D1 em relação as demais populações. CONCLUSÃO: Cada população apresenta um perfil distinto de expressão gênica. As maiores semelhanças ocorrem entre os timócitos DN e DP onde as principais diferenças são a expressão de Frizzled 6 e Ciclina D1.Os timócitos SP CD4 e as células T CD4+ naïve não apresentaram níveis semelhantes de expressão gênica de elementos da via Wnt canônica, o que não corrobora a hipótese de que o perfil transcripcional de timócitos SP CD4 e linfócitos T CD4+ naïve é semelhante. Ainda, não observamos expressão aumentada de HIG2 em linfócitos T CD4+ naïve comparados aos de memória, o que contrasta com os resultados obtidos anteriormente por nosso grupo com amostras humanas sugerindo que camundongos não regulam a expressão de HIG2 em linfócitos T CD4+ como os seres humanos / INTRODUCTION: HIG2 molecule can act as an agonist of Wnt/?-catenin pathway, because it able to bind to Frizzled 10 receptor and induce the expression of the genes related to this pathway. Recent data from our group have shown differential expression of the HIG2 gene in peripheral blood mononuclear cells, and particularly in naive CD4 + T cells, but not in memory T cells in healthy individuals. We have also observed that inducing the CD4 + T lymphocytes from healthy individuals with HIG2 synthetic peptide in vitro, led to the activation of Wnt/beta-catenin pathway, HIG2 production and expression of other target genes of this pathway and the proliferation of naïve CD4 + T cells, suggesting that HIG2 may play a role in homeostatic proliferation of CD4+ T cells. HYPOTHESIS: As naïve CD4 + T cells are directly exported from the thymus, we have hypothesized that increased levels of HIG2 in this cell type is due to the activation of Wnt/beta-catenin pathway in the later stages of thymocyte differentiation. Therefore, naïve CD4 + T cells and CD4 single-positive thymocytes (CD4 SP) may share a similar pattern of gene expression of HIG2 and Wnt/beta-catenin genes (genes that encodes receptors and co-receptors, transcription factors, structural and target genes) when compared to other cell populations. AIM: our major aim is to evaluate the expression of HIG2 and other genes of the Wnt/beta-catenin in thymocytes, naïve CD4 + T lymphocytes and memory CD4+ T cells from mice. METHODS: We have isolated thymocytes double negative (DN) T cells, positive double positive (DP) T cells, CD4 and CD8 single-positive thymocytes (CD4 SP and CD8 SP) of thymus from BALB/c mice and we have also isolated naïve CD4 + T cells and memory CD4+ T cells of the spleen from the same mice we have used the thymus. We have analysed the expression of several genes of Wnt/beta-catenin by real time PCR RESULTS: In DN cells there was expression of the Frizzled 6, LRP5, TCF-1 and TCF-4 genes compared to other cell populations. In DP thymocytes it could be observed a greater expression of LRP5, LRP6, beta-catenin, GSK-3beta, TCF-1 and Bcl-XL genes compared to other populations. In CD4 SP thymocytes, it was detected differential expression of the Frizzled 10, LRP6, beta-catenin, LEF-1 HIG2 genes and in CD8 SP cells we could not observe significant expression of any gene of Wnt/?-catenin pathway. In naïve CD4 + T cells there was a significant expression of Frizzled5 and Frizzled 10 genes when compared to all the samples. In memory CD4 + T cells, we have detected higher expression of Frizzled 6, TCF-4, Bcl-XL and cyclin D1 genes than in any other populations. CONCLUSION: Each population has a distinct gene expression pattern. The biggest similarities occur between DN and DP thymocytes where the main differences are the expression of Frizzled 6 and cyclin D1.However, the pattern of gene expression in SP thymocytes is not similar to those presented by naïve CD4+ T cells. Moreover, we have not observed increased expression of HIG2 in naïve CD4 + lymphocytes compared to memory CD4+ T cells, which contrasts the results obtained previously by our group with human samples suggesting that mice might not regulate the HIG2 expression in CD4 + T lymphocytes as human beings do

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-19T13:13:44Z No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Deyse Segati - 2017.pdf: 1820249 bytes, checksum: 36ea5524af9118dfeefed599a8c8ef16 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-19T13:14:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Deyse Segati - 2017.pdf: 1820249 bytes, checksum: 36ea5524af9118dfeefed599a8c8ef16 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T13:14:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Deyse Segati - 2017.pdf: 1820249 bytes, checksum: 36ea5524af9118dfeefed599a8c8ef16 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-08 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Cervical cancer is caused by persistent high-risk HPV infection. In addition, genetic and epigenetic changes such as the silencing of Wnt signaling pathway inhibitor genes appear to be essential for the development and progression of the disease. This study aimed to analyze the prevalence of HPV infections in cervical cancer and to verify the associations between age, histological type, degree of tumor differentiation and the presence of methylation DKK3, SOX17 and SFRP2. This is a cross-sectional study including cases of cervical cancer, distributed in diagnoses of squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. The samples were assayed for 25 HPV genotypes using the INNOLipa® kit, then performed M-PCR to identify the presence of methylation in the promoter region of the genes DKK3, SOX17 and SFRP2. The results of the research showed that the age is significantly lower for women with cervical adenocarcinomas compared to those with a diagnosis of squamous cell carcinoma. Infections with genotypes 18 and 45 were associated with the diagnosis of adenocarcinomas in women younger than 50 years. Methylation of inhibitors of the Wnt signaling pathway and HPV infections 16, 18 and 45 are frequent events during multistage carcinogenesis, however, only a significant association with SFRP2 methylation was observed. The methylation of gene promoter SOX17 was related to lower cervical cancer severity but not to HPV types. Adenocarcinomas were significantlyassociated with HPV infections 16, 18 and 45, and demonstrated a borderline association with DKK3 and SOX17 methylation. In summary, the results of the present study contribute to a better understanding of carcinogenesis of the cervix in the Center-West of Brazil. / O câncer de colo uterino é causado pela infecção persistente por HPV de alto risco oncogênico. Em adição, as alterações genéticas e epigenéticas como o silenciamento dos genes inibidoresda via de sinalização Wnt parecem ser essenciais para o desenvolvimento e progressão da doença. Esse estudo teve como objetivo analisar a prevalência de infecções por genótipos específicos de HPV em câncer de colo uterino e verificar as associações entre a idade, tipo histológico, o grau de diferenciação tumoral e a presença da metilação na região promotora dos genes DKK3, SOX17 e SFRP2. Trata-se de um estudo de corte transversal incluindo casos de câncer de colo uterino, distribuídos em diagnósticos de carcinomas de células escamosas e adenocarcinomas. As amostras foram testadas para 25 genótipos de HPV utilizando o kit INNOLipa®, em seguida foram submetidas a M-PCR para identificar a presença da metilação na região promotora dos genes DKK3, SOX17 e SFRP2. Os resultados da pesquisa mostraram que a idade é significativamente menor em mulheres com adenocarcinomas cervicais comparadas com aquelas com diagnóstico de carcinoma de células escamosas. A infecção por genótipos 18 e 45 foram positivamente associadas ao diagnóstico de adenocarcinomas em mulheres com idade menor que 50 anos. A metilação dos inibidores da via de sinalização Wnt e as infecções por HPV 16, 18 e 45 são eventos frequentes durante a carcinogênese em várias etapas, no entanto, apenas foi observada associação significativa com a metilação de SFRP2. A metilação da região promotora de SOX17 foi relacionada com menor gravidade do câncer de colo uterino, mas não com tipos de HPV. Os adenocarcinomas apresentaram associação significativa com infecções por HPV 16, 18 e 45, além de demonstrar uma associação limítrofe com a metilação de DKK3 e SOX17. Em resumo, resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento da carcinogêneses do colo uterino na região Centro-Oeste do Brasil.

Introdução: Em crianças das regiões Sul e Sudeste do Brasil há uma incidência elevada de tumores adrenocorticais (TAC). Anormalidades da ?-catenina tem sido encontradas em TAC em adultos e sugerem a ativação da via Wnt/ -catenina nestes tumores. No entanto, não há estudos avaliando o papel desta via em casuísticas de TAC pediátricos. Objetivos: Avaliar o papel da via Wnt/catenina e mutações do gene CTNNB1 na tumorigênese adrenocortical pediátrica. Indivíduos, Material e Métodos: Foram avaliados 62 pacientes pediátricos com TAC oriundos de dois centros de referência. Controles: córtex adrenal de indivíduos jovens com morte acidental. Avaliou-se a presença de mutação nos genes TP53 e CTNNB1. A expressão de genes da via Wnt (CTNNB1, o ligante WNT4, os inibidores SFRP1, DKK3 e AXIN1, o fator de transcrição TCF7 e os genes-alvo MYC e WISP2) foi avaliada por qPCR, utilizando-se o método de 2-Ct. Adicionalmente, a expressão de proteínas da via Wnt/-catenina e P53 foi avaliada por imunoistoquímica. Avaliou-se a relação entre possíveis anormalidades moleculares com o fenótipo clínico e o desfecho. Resultados: A sobrevida geral foi maior em pacientes menores que 5 anos de idade (p<0.0001) e em pacientes com estágios tumorais menos avançados (p<0.0001). A mutação P53 p.R337H foi encontrada em 87% dos pacientes e não se associou com características clinicopatológicas ou desfecho. Mutações do gene CTNNB1 foram encontradas em 4/62 (6%) TAC, todos carreadores da mutação P53 p.R337H. Houve associação entre óbito e presença de mutações do gene CTNNB1 (p=0,02). Acúmulo difuso da -catenina foi observado em 71% dos TAC, a maioria sem mutações do CTNNB1. Comparados a adrenais normais, os TAC apresentaram aumento da expressão do RNAm de CTNNB1 (p=0.008) e diminuição da expressão de genes inibidores da via Wnt: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) e AXIN1 (p=0.04). Com relação aos genes-alvo da via Wnt/-catenina, TAC apresentaram expressão aumentada de WISP2 e baixa expressão de MYC. Maior sobrevida geral foi associada à expressão baixa de SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) e TCF7 (p<0.01). Conclusões: Em TAC pediátricos, mutações somáticas ativadoras do gene CTNNB1 são pouco freqüentes e parecem estar associadas à maior ocorrência de óbito. Mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1, estes tumores apresentaram acúmulo de -catenina e do gene-alvo WISP2 e expressão reduzida de inibidores da via Wnt (DKK3, SFRP1 e AXIN1). Estes dados demonstram evidências de anormalidades na via Wnt/-catenina em TAC pediátricos, mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1. É provável que outros eventos genéticos afetando a via Wnt/-catenina estejam envolvidos na tumorigênese adrenocortical pediátrica / Context: CTNNB1 mutations and activation of Wnt/-catenin pathway are frequent in adult adrenocortical tumors (ACTs) but data on childhood ACTs are lacking. Objective: To investigate Wnt/-catenin pathway abnormalities and CTNNB1 mutations in childhood ACTs. Patients and Methods: Clinicopathological findings and outcome of 62 childhood ACTs patients were analyzed regarding to CTNNB1/ -catenin mutations and to the expression of Wnt-related genes (CTNNB1, a Wnt ligand: WNT4, Wnt inhibitors: SFRP1, DKK3 and AXIN1, a transcription factor: TCF7, and target genes: MYC and WISP2) by qPCR and immunohistochemistry. Results: Overall survival (OS) was higher in patients younger than 5 years (p<0.0001) and associated with less advanced tumoral stage (p<0.0001). The p.R337H P53 mutation, found in 87% of the patients, was not associated with clinicopathological findings or outcome. CTNNB1 activating mutations were found in only 4/62 ACTs (6%), all of them harboring TP53 mutation. There was association between the presence of CTNNB1 mutation and death (p=0.02). Diffuse -catenin accumulation was found in 71% of ACTs, most of them without CTNNB1 mutation. CTNNB1 mutated ACTs presented weak/moderate -catenin accumulation. Compared to normal adrenals, ACTs presented increased expression of CTNNB1 (p=0.008) and underexpression of Wnt inhibitor genes: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) and AXIN1 (p=0.04). With regards to Wnt/-catenin target genes, ACTs presented lower expression of MYC but increased expression of WISP2. Higher overall survival was associated with underexpression of SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) and TCF7 (p<0.01). Conclusions: In childhood ACTs, CTNNB1 mutations are rare and appear to be associated with poor prognosis. Regardless of CTNNB1 mutations, these tumors presented reduced expression of Wnt inhibitor genes (DKK3, SFRP1 and AXIN1) and increased expression of CTNNB1 and a target gene, WISP2. Thus, besides CTNNB1 mutations, additional genetic events affecting the Wnt/-catenin pathway may be involved in childhood adrenocortical tumorigenesis.

Introdução: Em crianças das regiões Sul e Sudeste do Brasil há uma incidência elevada de tumores adrenocorticais (TAC). Anormalidades da ?-catenina tem sido encontradas em TAC em adultos e sugerem a ativação da via Wnt/ -catenina nestes tumores. No entanto, não há estudos avaliando o papel desta via em casuísticas de TAC pediátricos. Objetivos: Avaliar o papel da via Wnt/catenina e mutações do gene CTNNB1 na tumorigênese adrenocortical pediátrica. Indivíduos, Material e Métodos: Foram avaliados 62 pacientes pediátricos com TAC oriundos de dois centros de referência. Controles: córtex adrenal de indivíduos jovens com morte acidental. Avaliou-se a presença de mutação nos genes TP53 e CTNNB1. A expressão de genes da via Wnt (CTNNB1, o ligante WNT4, os inibidores SFRP1, DKK3 e AXIN1, o fator de transcrição TCF7 e os genes-alvo MYC e WISP2) foi avaliada por qPCR, utilizando-se o método de 2-Ct. Adicionalmente, a expressão de proteínas da via Wnt/-catenina e P53 foi avaliada por imunoistoquímica. Avaliou-se a relação entre possíveis anormalidades moleculares com o fenótipo clínico e o desfecho. Resultados: A sobrevida geral foi maior em pacientes menores que 5 anos de idade (p<0.0001) e em pacientes com estágios tumorais menos avançados (p<0.0001). A mutação P53 p.R337H foi encontrada em 87% dos pacientes e não se associou com características clinicopatológicas ou desfecho. Mutações do gene CTNNB1 foram encontradas em 4/62 (6%) TAC, todos carreadores da mutação P53 p.R337H. Houve associação entre óbito e presença de mutações do gene CTNNB1 (p=0,02). Acúmulo difuso da -catenina foi observado em 71% dos TAC, a maioria sem mutações do CTNNB1. Comparados a adrenais normais, os TAC apresentaram aumento da expressão do RNAm de CTNNB1 (p=0.008) e diminuição da expressão de genes inibidores da via Wnt: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) e AXIN1 (p=0.04). Com relação aos genes-alvo da via Wnt/-catenina, TAC apresentaram expressão aumentada de WISP2 e baixa expressão de MYC. Maior sobrevida geral foi associada à expressão baixa de SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) e TCF7 (p<0.01). Conclusões: Em TAC pediátricos, mutações somáticas ativadoras do gene CTNNB1 são pouco freqüentes e parecem estar associadas à maior ocorrência de óbito. Mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1, estes tumores apresentaram acúmulo de -catenina e do gene-alvo WISP2 e expressão reduzida de inibidores da via Wnt (DKK3, SFRP1 e AXIN1). Estes dados demonstram evidências de anormalidades na via Wnt/-catenina em TAC pediátricos, mesmo na ausência de mutações do gene CTNNB1. É provável que outros eventos genéticos afetando a via Wnt/-catenina estejam envolvidos na tumorigênese adrenocortical pediátrica / Context: CTNNB1 mutations and activation of Wnt/-catenin pathway are frequent in adult adrenocortical tumors (ACTs) but data on childhood ACTs are lacking. Objective: To investigate Wnt/-catenin pathway abnormalities and CTNNB1 mutations in childhood ACTs. Patients and Methods: Clinicopathological findings and outcome of 62 childhood ACTs patients were analyzed regarding to CTNNB1/ -catenin mutations and to the expression of Wnt-related genes (CTNNB1, a Wnt ligand: WNT4, Wnt inhibitors: SFRP1, DKK3 and AXIN1, a transcription factor: TCF7, and target genes: MYC and WISP2) by qPCR and immunohistochemistry. Results: Overall survival (OS) was higher in patients younger than 5 years (p<0.0001) and associated with less advanced tumoral stage (p<0.0001). The p.R337H P53 mutation, found in 87% of the patients, was not associated with clinicopathological findings or outcome. CTNNB1 activating mutations were found in only 4/62 ACTs (6%), all of them harboring TP53 mutation. There was association between the presence of CTNNB1 mutation and death (p=0.02). Diffuse -catenin accumulation was found in 71% of ACTs, most of them without CTNNB1 mutation. CTNNB1 mutated ACTs presented weak/moderate -catenin accumulation. Compared to normal adrenals, ACTs presented increased expression of CTNNB1 (p=0.008) and underexpression of Wnt inhibitor genes: DKK3 (p<0.0001), SFRP1 (p=0.05) and AXIN1 (p=0.04). With regards to Wnt/-catenin target genes, ACTs presented lower expression of MYC but increased expression of WISP2. Higher overall survival was associated with underexpression of SFRP1 (p=0.01), WNT4 (p=0.004) and TCF7 (p<0.01). Conclusions: In childhood ACTs, CTNNB1 mutations are rare and appear to be associated with poor prognosis. Regardless of CTNNB1 mutations, these tumors presented reduced expression of Wnt inhibitor genes (DKK3, SFRP1 and AXIN1) and increased expression of CTNNB1 and a target gene, WISP2. Thus, besides CTNNB1 mutations, additional genetic events affecting the Wnt/-catenin pathway may be involved in childhood adrenocortical tumorigenesis.

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maschio_DanielaAparecida_M.pdf: 3472469 bytes, checksum: c4faacd3683560adfb7bc1ddb9464f73 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Tem havido um grande interesse na determinação das vias envolvidas na proliferação das células beta pancreáticas e a aplicação deste conhecimento em terapias moleculares e celulares da diabetes. Em especial, a via de sinalização da Wnt/beta-catenina (ou via Wnt canônica) tem sido pouco investigada no pâncreas endócrino. Em determinados tecidos/órgãos, é sabido que a proteína beta-catenina constitui não somente um componente estrutural das junções de adesão, mas também é uma molécula sinalizadora juntamente com a Wnt, participando de vários processos celulares, tais como diferenciação e proliferação. Hiperplasia da célula beta parece ocorrer em certas condições experimentais e in vivo, como no estado de resistência periférica à insulina. Entretanto, as vias intracelulares envolvidas nesse processo ainda permanecem desconhecidas. Os objetivos desta Dissertação de Mestrado foram: 1) verificar se as alterações metabólicas induzidas pela exposição à dieta hiperlipídica (DHL) por um curto período de tempo (60 dias) são acompanhadas por alterações morfométricas compensatórias do pâncreas endócrino de camundongos C57BL/6; 2) investigar o possível envolvimento da via de sinalização da Wnt/beta-catenina no processo de proliferação da célula beta neste modelo, analisando-se a localização celular (por imunofluorescência indireta), o conteúdo proteico (por immunoblotting) e a expressão gênica (por PCR de Tempo Real ou qPCR) de proteínas associadas à via Wnt/beta-catenina (a saber, beta-catenina, Ciclina D1/2, c-Myc, GSK-3? e Axina2 e, 3) analisar a expressão da proteína beta-catenina não fosforilada (forma ativa da via) em ilhotas não hiperplásicas de animais tratados com a DHL por apenas 30 dias. Nossos resultados demonstraram que, após 60 dias de tratamento com DHL, os animais se tornaram obesos e apresentaram acentuadas alterações metabólicas, tais como hiperglicemia em jejum e pós prandial, hiperinsulinemia em jejum e pós-prandial e, ainda, uma significativa resistência periférica à insulina (administrada intraperitonealmente), sendo esses animais, portanto, caracterizados como pré-diabéticos. Este quadro foi acompanhado por um aumento significativo da massa relativa de células beta e do seu número por ilhota, o que indica hiperplasia deste tipo celular no pâncreas endócrino, provavelmente compensatória ao quadro de resistência periférica à insulina apresentado pelos animais do grupo tratado. Como mostrado por immunoblotting, houve um aumento significativo na expressão de proteínas ativadoras ou alvo da via, como beta-catenina ativada (não fosforilada) e Ciclina D1/2 em ilhotas dos animais pré-diabéticos. Quanto às proteínas Axina2 e GSK-3? (inibidoras da via), não foi observada alteração significativa na expressão de Axina2, mas supreendemente houve aumento do conteúdo celular de GSK-3? nas ilhotas do grupo pré-diabético. A imunofluorescência para beta-catenina ativada mostrou a presença desta proteína tanto na região de contato intercelular como no citoplasma e núcleo das células beta para ambos os grupos. As outras três proteínas relacionadas à via, Ciclina D1/2, GSK-3? e Axina2, por sua vez, apresentaram uma distribuição exclusivamente citoplasmática nas células endócrinas das ilhotas pancreáticas, o que está de acordo com as suas respectivas funções. A análise por qPCR não revelou alteração significativa no conteúdo celular de RNAm de ?-catenina, mas uma tendência de aumento na expressão gênica de Ciclina D1 e c-Myc, genes alvo da via, em ilhotas hiperplásicas dos animais pré-diabéticos. Ainda, por immunoblotting para beta-catenina ativada, não observamos aumento significativo da expressão proteica dessa proteína em ilhotas do grupo tratado com DHL por apenas 30 dias, os quais não desenvolveram hiperplasia do pâncreas endócrino. Em conclusão, nossos dados sugerem que a via Wnt/beta-catenina parece estar ativada na pré-diabetes experimental, e provavelmente participa do processo de hiperplasia compensatória das células beta pancreática neste estado metabólico / Abstract: The role of the Wnt/beta-catenin signaling pathway (as known as the canonical Wnt pathway) in the endocrine pancreas physiology has not been thoroughly explored. In certain tissues/organs, it is known that beta-catenin, besides being a structural component of adhesion junctions, participates as a key protein in the Wnt signaling pathway, therefore being involved in crucial cellular processes such as differentiation and proliferation. Beta cell hyperplasia appears to occur under certain experimental conditions, and in vivo during the peripheral insulin resistance state. However, the intracellular pathways involved in this process are still unknown. The objectives of this Master's Dissertation were as follows: 1) to investigate whether the metabolic changes induced by exposure of adult male C57BL/6 mice to a high-fat diet (HFD) for a relatively short period of time (30 or 60 days) are accompanied by compensatory morphometric changes of the endocrine pancreas indicative of beta cell hyperplasia; and 2) to study the possible involvement of the pathway Wnt/?-catenin signaling in the process of beta cell proliferation in this animal model. For this, we carried out the analysis of the cellular localization (by indirect immunofluorescence), the protein cell content (by immunoblotting) and the gene expression (by PCR or Real-Time qPCR) of proteins associated to the Wnt/beta-catenin pathway (i.e., ?-catenin, Cyclin D1/2, c-Myc, Axin2 and GSK-3?). Our results showed that, after 60 days of treatment with HFD, the animals became obese, as well as, hyperglycemic, hyperinsulinemic (both at fast and fed states) and resistant to intraperitoneally injected insulin, being therefore characterized as prediabetic. This metabolic condition was accompanied by a significant increase in the relative mass of beta cells and the number of beta cells per islet, which indicates hyperplasia of this pancreatic endocrine cell, probably compensatory to the relatively higher insulin demand presented by the HFD-treated animals. As shown by immunoblotting, there was a significant increase in islet expression of the activator and target proteins, such as the active (unphosphorylated) beta-catenin and Cyclin D1/2 in prediabetic animals. Regarding Axina2 and GSK- 3? proteins (antagonists of the pathway), no changes were observed concerning Axin2 islet content between the experimental groups, but surprisingly there was a significant increase in cellular content of GSK-3? in islet homogenates from the prediabetic group. The immunofluorescence for active beta-catenin showed the presence of this protein at the intercellular contact region as well as within the cytoplasm and nucleus of beta cells in both groups. Meanwhile, Cyclin D1/2, GSK-3? and Axin2 displayed an exclusively cytoplasmic distribution in pancreatic endocrine cells, which is in accordance with their respective functions. The qPCR analysis revealed no significant change in mRNA expression of ?-catenin, but a tendency of increase in gene expression of Cyclin D1 and c-Myc, target genes of the pathway, in hyperplastic islets of the prediabetic animals. Additionally, the immunoblotting of active beta-catenin in homogenates of non-hyperplastic islets, isolated from mice fed a HFD for only 30 days, showed no significant change in expression this protein as compared to the control group. In conclusion, our data suggest that the Wnt/beta-catenin pathway may be activated during the process of compensatory hyperplasia of the beta cells seen in our animal model of obesity-associated prediabetes / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3&#946; e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e &#946;-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de &#946;-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3&#946;&#61538; de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3&#946; and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and &#946;-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of &#946;-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3&#946;. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3&#946; e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e &#946;-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de &#946;-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3&#946;&#61538; de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3&#946; and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and &#946;-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of &#946;-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3&#946;. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.