Em invertebrados, os genes Scratch (Scrt) codificam fatores de transcrição que promovem a neurogênese durante o desenvolvimento. A função de Scrt em vertebrados é desconhecida, mas em camundongos Scrt1 e Scrt2 são especificamente expressos em neurônios pós-mitóticos no embrião e no sistema nervoso central adulto. Neste trabalho, nós clonamos a sequência codificante de Scrt2 de galinha (cScrt2) e caracterizamos seu padrão de expressão no embrião por PCR quantitativo e hibridação in situ. A sequência codificante completa foi clonada no vetor de expressão pMES-GFP e o produto previsto da tradução é uma proteína com 276 aminoácidos. A sequência de aminoácidos compartilha identidades de 70% com Scrt2 de rato e 58% com Scrt de zebrafish. Transcritos cScrt2 são detectados primeiramente na periferia do tubo neural do rombencéfalo em HH 15 e da medula espinhal em HH 17, coincidindo com os locais onde alguns dos primeiros neurônios se diferenciam durante a embriogênese. Entre HH 19-23, a expressão no domínio motor da medula espinhal se concentra progressivamente na interface entre as zonas ventricular e do manto. Além disso, a expressão de cScrt2 também é observada nos gânglios da raíz dorsal a partir de HH 22-23, principalmente no domínio dorsomedial. O campo de expressão de cScrt2 no tubo neural é complementar aos de Notch1, que é expresso em células-tronco neurais, e SCG10, marcador de neurônios diferenciados. Nossos resultados sugerem que durante a embriogênese da medula espinhal cScrt2 é especificamente expresso em neurônios pós-mitóticos indiferenciados. A construção pMES-GFP(cScrt2) possibilita futuras análises funcionais diretas por interferência gênica no embrião de galinha, que serão de grande valor para um melhor entendimento da função dos genes Scrt em vertebrados. / In invertebrates, the Scratch (Scrt) genes encode transcription factors that promote neurogenesis during development. The Scrt function in vertebrates is unknown, but in mice Scrt1 and Scrt2 are specifically expressed in post-mitotic neurons in the embryo and in the adult central nervous system. In this work, we have cloned the coding sequence of chicken Scrt2 (cScrt2) and characterized its expression pattern in the embryo with quantitative PCR and in situ hybridization. The complete coding sequence was cloned in the expression vector pMES-GFP and the predicted translation product is a 276-aminoacids protein. The aminoacid sequence shares identities of 70% with rat Scrt2 and 58% with zebrafish Scrt. cScrt2 transcripts are firstly detected in the periphery of the neural tube in the hindbrain by HH 15 and in the spinal cord by HH 17, coinciding with the places where some of the first neurons differentiate during embryogenesis. Between HH 19-23, the expression in the motor domain of the spinal cord is progressively concentrated in the interface between the ventricular and mantle zones. Furthermore, cScrt2 expression is also observed in the dorsal root ganglia after HH22-23, particularly in the dorsomedial domain. The expression pattern of cScrt2 in the neural tube is complementary to that of Notch1, which is expressed in neural stem cells, and SCG10, a marker for differentiated neurons. Our results suggest that during embryogenesis cScrt2 is specifically expressed in post-mitotic undifferentiated neurons. The construction pMES-GFP(cScrt2) makes possible future direct functional analysis by genetic interference in the chick embryo, which will be of great value for better understanding the Scrt genes function in vertebrates.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC IDIBAPS) / Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal. / Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.

The present thesis entitled “Construction of versatile biomolecule nano-platforms via Dip-pen Nanolithography and their application in bio-sensing and cell differentiation” aims at contributing to the field of Nanobiotechnology, best defined as miniaturized biotechnology where nanofabrication technology is used for biological purposes. To this end, this research work employs the relatively novel nanofabrication technique called Dip-pen Nanolithography (DPN) for direct patterning of biologically relevant molecules at the micro- and nanoscale, both for biosensor applications and cell differentiation studies. - The first chapter deals with the challenges encountered when working with Dip-pen Nanolithography and so called multi-pens. In order to facilitate the levelling of the tips with respect to the substrate and also to obtain a constant feedback of the force exerted from the tips to the substrate, a device was developed and fabricated together with a collaboration. The resulting piezoresistive device could be implemented successfully and was used to pattern two different molecules on gold substrates. An improved sensitivity at detecting the touching point could be shown when compared to conventional tips. - The second chapter deals with the miniaturization of an already in-house developed biosensor platform. Therefore, several different approaches were evaluated for the DPN patterning of oligonucleotides on gold or chemically modified glass in order to ensure a covalent attachment. The most successful strategy was the click chemistry route, where an azide bearing oligonucleotide was coupled to an alkyne bearing glass substrate, using a copper catalyst (1,3-dipolar cycloaddition) yielding an triazole. This way, a sensor platform could be established and the sensitivity could be assessed. - The third chapter deals with the development and fabrication of DPN patterned substrates for cell differentiation experiments. A biotin-thiol was chosen for patterning because it allows derivatization with streptavidin and any type of biotinylated molecule. The patterning was accomplished, using a lipid as a carrier molecule. This way, the feature size of the pattern was around 5 µm and the overall pattern area was bigger than 1 mm². The substrates were applied successfully in cell differentiation experiments, having a biotinylated BMP-2 immobilized on the substrates. / La presente tesis titulada "Construcción de nanoplataformas biomoleculares versátiles vía Nanolitografía Dip-pen y su aplicación en bio-sensing y diferenciación celular" pretende contribuir al campo de la nanobiotecnología, definida como la biotecnología en miniatura donde se utiliza la tecnología de nanofabricación con fines biológicos. Con este objectivo, este trabajo de investigación emplea la relativamente novedosa técnica de nanofabricación llamada Dip-Pen Nanolitografía (DPN) para obtener un patrón de moléculas biológicamente relevantes a micro y nanoescala, tanto para aplicaciones de biosensores como para los estudios de diferenciación celular. - El primer capítulo trata de los desafíos encontrados al trabajar con Dip-Pen Nanolitografía y los llamados multi-pens. Con el fin de facilitar la nivelación de la punta con respecto al sustrato y obtener un control constante de la fuerza ejercida desde las puntas al sustrato, se desarrolló y fabricó un dispositivo. El dispositivo piezo-resistivo resultante se pudo aplicar con éxito y se utilizó para la fabricación de patrones de dos moléculas diferentes en sustratos de oro. Se obtuvo una mejora de la sensiblidad en la detección del punto de contacto en comparación con puntas convencionales - El segundo capítulo trata de la miniaturización de una plataforma biosensora que ya se había desarollado previamente en el laboratorio. Se evaluaron varios métodos diferentes para la fabricación de un patrón de oligonucleótidos mediante DPN sobre oro o sobre vidrio modificado químicamente con el fin de asegurar una unión covalente. La estrategia más exitosa resultó ser la ruta de química click, donde un oligonucleótido con un grupo azida se acopla a un sustrato de vidrio que presenta un grupo alquino, utilizando un catalizador de cobre (cicloadición 1,3-dipolar) y produciendo un triazol. De esta manera, se pudo establecer una plataforma sensora y se pudo evaluar su sensibilidad - El tercer capítulo trata del desarrollo y la fabricación sustratos con patrón mediante DPN para experimentos de diferenciación celular. Una molécula de biotina-tiol fue elegida como patrón, ya que permite la derivatización con estreptavidina y, en un segundo paso, cualquier tipo de molécula de biotina. El patrón se llevó a cabo usando un lípido como molécula para facilitar el transporte de la tinta. De esta manera, el tamaño de la característica del patrón fue de alrededor de 5 micras y el área de patrón general más grande que 1 mm ². Los sustratos se aplicaron con éxito en experimentos de diferenciación celular, usando la proteína BMP-2 biotinilada inmovilizada sobre los sustratos.

The focus of this work was to functionally characterize the CD300e receptor expressed in human monocytes and myeloid dendritic cells and investigate the implications that receptor engagement has on their biology. We provide evidence formally supporting that CD300e functions as an activating receptor capable of regulating the innate immune response by triggering various pro- inflammatory functions including intracellular calcium mobilization, superoxide anion production, pro-inflammatory cytokine release and up-regulation of co-stimulatory molecules in myeloid cells. We also report that ligation of CD300e on the surface of monocytes results in their differentiation to functional MΦ2-like macrophages by an autocrine mechanism that involves M-CSF and its receptor (CD115). / L'objectiu d'aquest treball ha estat caracteritzar funcionalment el receptor CD300e expressat en monòcits i cèl·lules dendrítiques mieloides humanes, així com investigar les implicacions que l'activació d'aquest receptor pot tenir en la seva biologia. Demostrem formalment que el receptor CD300e funciona com un receptor activador capaç de regular la resposta immune innata activant diverses funcions proinflamatòries, incloent la mobilització de calci intracel·lular, la producció d'anió superòxid, la secreció de citocines proinflamatòries i la inducció de molècules coestimuladores en cèl·lules mieloides. També descrivim que l'activació del receptor CD300e a la superfície dels monòcits provoca la seva diferenciació cap a macròfags funcionals del tipus MΦ2 gràcies a un mecanisme autocrí que funciona a través del M-CSF i el seu receptor (CD115).

Orientador: Carla Beatriz Collares-Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T07:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos-Silva_JuniaCarolinaRebelo_M.pdf: 6726589 bytes, checksum: 09893d0d795475f8007b857273dde88e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As junções intercelulares são especializações da membrana plasmática através das quais células dentro de um tecido podem interagir e aderirem-se umas às outras. Nas ilhotas pancreáticas, as diferentes células endócrinas se interconectam por meio das junções de oclusão, comunicante, aderente e desmossomos. Tais contatos intercelulares parecem ser cruciais para o perfeito funcionamento deste órgão, porém, pouco se sabe sobre a função fisiopatológica e composição das junções intercelulares no pâncreas endócrino. O objetivo geral desta dissertação foi estudar a importância funcional da adesão e reconhecimento celular mediados pelas junções de oclusão (JO) e de adesão (JA) nos processos de maturação e disfunção da célula beta do pâncreas endócrino, ao longo do desenvolvimento do animal e na patogênese da diabetes tipo 2, respectivamente. Nossos dados mostram que as ilhotas de fetos e recém-nascidos de ratos Wistar, cuja resposta secretora de insulina à glicose é significativamente menor, apresentam uma morfologia menos organizada, caracterizada por um formato menos definido e uma associação mais freqüente com ductos, quando comparadas às ilhotas de jovens e adultos, que são responsivas à esse secretagogo. Na ausência de contato intercelular, quando as células das ilhotas de adultos foram dispersas, a resposta secretora de insulina foi completamente inibida, porém parcialmente restabelecida quando as células foram reagregadas. Quando comparado às ilhotas de adultos, o impacto da ausência de contatos intercelulares sobre a resposta secretora de insulina à glicose foi consideravelmente menor no caso das ilhotas de ratos recém-nascidos. A imunofluorescência para NCAM e pan-caderina revelou uma distribuição diferencial destas moléculas de adesão somente nas células das ilhotas pancreáticas de jovens e adultos, o que pode estar relacionada com a citoarquitetura típica (células beta, ocupando a região central e os outros tipos celulares na periferia da ilhota) adquirida no período pré-natal. Das proteínas associadas à JA e JO estudadas, ?- e ?-cateninas e ZO-1 (mas não a ocludina) foram expressas nas células endócrinas das ilhotas de todos os grupos experimentais. De forma geral, a imunofluorescência para tais proteínas revelou uma marcação intercelular menos definida nas células beta de ilhotas de recém-nascidos e fetos em comparação com os animais jovens e adultos. Isto pode indicar uma menor interação/adesão celular, que por sua vez, pode estar relacionada com a resposta secretora deficitária de insulina das ilhotas pancreáticas verificada na fase perinatal. Como modelo de diabetes do tipo 2, utilizamos camundongos C57, machos, alimentados com dieta hiperlipídica por 8 meses desde os 21 dias de idade. Após este período em dieta, os animais tornaram-se obesos e pré-diabéticos, apresentando moderada hiperglicemia e significativa hiperinsulinemia ao final desta dieta. Não observamos diferenças morfológicas marcantes entre os grupos e nem alterações significativas na distribuição intercelular da ZO-1, ?- e ?-cateninas nas ilhotas do grupo tratado em comparação ao grupo controle. Entretanto, verificou-se uma maior marcação intercelular para Ecaderina e uma maior associação de F-actina à membrana na região de contato intercelular nas células endócrinas das ilhotas do grupo pré-diabético em relação ao controle. Em conclusão, os contatos intercelulares mediados pelas proteínas associadas à JA e à JO parecem desempenhar um papel no processo de maturação do pâncreas do endócrino durante o desenvolvimento animal e na patogênese da diabetes do tipo 2 / Abstract: Intercellular junctions are specializations of the plasma membrane that allow cells within a tissue to interact and adhere to each other. In endocrine pancreas, the different endocrine cells are interconnected by tight, gap and adherens-type junctions. Such intercellular contacts seem to be crucial for the function of this organ, however, little is known about the pathophysiological role and biochemistry of intercellular junctions in the endocrine pancreas. The aim of this thesis was to study the importance of cell-cell recognition and adhesion mediated by proteins associated to tight and adherens junctions in pancreatic islets, with emphasis on the process of insulin secretion, along the animal development and in pathogenesis of type 2 diabetes. Pancreatic islets of foetuses (F) and newborn (N) Wistar rats, that display a relatively poor insulin secretory response to glucose, present an immature morphology and a less defined cytoarchitecture when compared to islets from young (Y) and adult (A) rats, that are responsive to glucose. The immunofluorescence for N-CAM and pan-cadherin, adhesion molecules that are important in cell segregation, revealed a differential distribution of these proteins only in cells of the islets from Y and A. A lower junctional content of ?-and ?-catenins and ZO-1 in islet cells was seen in F and N in comparison with Y and A. In addition, we found that in the absence of intercellular contact, the glucose-stimulated insulin secretion was completely blocked in A islets. In contrast, the impact of the disruption of cell-cell adhesion on insulin secretory response of N islets was relatively small. As a model of type 2 diabetes, we employed male C57 mice, fed on high-fat (HF) diet for 8 months since they were 21 days old. After HF diet, these mice became obese and pre-diabetic (displaying moderate hyperglycemia and marked hyperinsulinaemia). We did not observe marked differences either in morphology either in the intercellular distribution of ZO-1, ?- and ?-catenins in islets between the HF-treated and control groups. However, there was a stronger immunoreaction for Ecadherin at the cell-cell contact site and an increased association of F-actin to the plasma membrane of islet endocrine cells from pre-diabetic mice as compared to control ones. In conclusion, the intercellular contacts mediated by adherens and tight junction and their constitutive proteins seem to play a role in the developmental maturation of the endocrine pancreas and in the pathogenesis of type 2 diabetes / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Em invertebrados, os genes Scratch (Scrt) codificam fatores de transcrição que promovem a neurogênese durante o desenvolvimento. A função de Scrt em vertebrados é desconhecida, mas em camundongos Scrt1 e Scrt2 são especificamente expressos em neurônios pós-mitóticos no embrião e no sistema nervoso central adulto. Neste trabalho, nós clonamos a sequência codificante de Scrt2 de galinha (cScrt2) e caracterizamos seu padrão de expressão no embrião por PCR quantitativo e hibridação in situ. A sequência codificante completa foi clonada no vetor de expressão pMES-GFP e o produto previsto da tradução é uma proteína com 276 aminoácidos. A sequência de aminoácidos compartilha identidades de 70% com Scrt2 de rato e 58% com Scrt de zebrafish. Transcritos cScrt2 são detectados primeiramente na periferia do tubo neural do rombencéfalo em HH 15 e da medula espinhal em HH 17, coincidindo com os locais onde alguns dos primeiros neurônios se diferenciam durante a embriogênese. Entre HH 19-23, a expressão no domínio motor da medula espinhal se concentra progressivamente na interface entre as zonas ventricular e do manto. Além disso, a expressão de cScrt2 também é observada nos gânglios da raíz dorsal a partir de HH 22-23, principalmente no domínio dorsomedial. O campo de expressão de cScrt2 no tubo neural é complementar aos de Notch1, que é expresso em células-tronco neurais, e SCG10, marcador de neurônios diferenciados. Nossos resultados sugerem que durante a embriogênese da medula espinhal cScrt2 é especificamente expresso em neurônios pós-mitóticos indiferenciados. A construção pMES-GFP(cScrt2) possibilita futuras análises funcionais diretas por interferência gênica no embrião de galinha, que serão de grande valor para um melhor entendimento da função dos genes Scrt em vertebrados. / In invertebrates, the Scratch (Scrt) genes encode transcription factors that promote neurogenesis during development. The Scrt function in vertebrates is unknown, but in mice Scrt1 and Scrt2 are specifically expressed in post-mitotic neurons in the embryo and in the adult central nervous system. In this work, we have cloned the coding sequence of chicken Scrt2 (cScrt2) and characterized its expression pattern in the embryo with quantitative PCR and in situ hybridization. The complete coding sequence was cloned in the expression vector pMES-GFP and the predicted translation product is a 276-aminoacids protein. The aminoacid sequence shares identities of 70% with rat Scrt2 and 58% with zebrafish Scrt. cScrt2 transcripts are firstly detected in the periphery of the neural tube in the hindbrain by HH 15 and in the spinal cord by HH 17, coinciding with the places where some of the first neurons differentiate during embryogenesis. Between HH 19-23, the expression in the motor domain of the spinal cord is progressively concentrated in the interface between the ventricular and mantle zones. Furthermore, cScrt2 expression is also observed in the dorsal root ganglia after HH22-23, particularly in the dorsomedial domain. The expression pattern of cScrt2 in the neural tube is complementary to that of Notch1, which is expressed in neural stem cells, and SCG10, a marker for differentiated neurons. Our results suggest that during embryogenesis cScrt2 is specifically expressed in post-mitotic undifferentiated neurons. The construction pMES-GFP(cScrt2) makes possible future direct functional analysis by genetic interference in the chick embryo, which will be of great value for better understanding the Scrt genes function in vertebrates.

Foram estudadas as enzimas implicadas no metabolismo de cAMP, bem como as variações na concentração deste nucleotídeo cíclico e na atividade de adenilato ciclase durante o ciclo biológico de B. emersonii. Demonstrou-se que os zoósporos contêm enzimas específicas e distintas para a hidrólise de cAMP e cGMP. Existe apenas uma espécie molecular da cAMP fosfodiesterase, que hidrolisa cAMP a 5\'-AMP com um Km aparente de 2-4 µM; a presença de cGMP nas misturas de reação, não altera as propriedades cinéticas da enzima. A adenilato ciclase de B. emersonii é uma enzima particulada, provavelmente ligada à membrana plasmática do zoósporo, que exige especificamente Mn2+ para sua atividade. A enzima não é ativada por NaF, catecolaminas ou outros compostos de estrutura semelhante. O estudo das propriedades cinéticas da adenilato ciclase sugere um modelo simples no qual o verdadeiro substrato da enzima é o complexo MnATP2- e tanto ATP corno Mn2+ , nas suas formas livres, competem com o complexo pelo sítio catalítico da enzima, que apresenta uma afinidade maior pelas formas livres do que pelo complexo MnATP2-. A atividade especifica da adenilato ciclase, determinada durante o ciclo biológico do fungo, mostra-se elevada nos zoósporos, cai lentamente durante a germinação e permanece baixa em todo o período de crescimento, só voltando a apresentar um aumento na atividade após a indução da esporulação. Quando este processo e induzido na presença de cicloheximida, a atividade permanece baixa, sugerindo que a enzima é sintetizada \"de novo\" nesta fase do ciclo evolutivo. A concentração intracelular de cAMP foi também determinada nas várias fases do ciclo biológico de B. emersonii. No zoósporo encontrou-se um valor médio de 33 pmoles cAMP/mg proteína. Durante a germinação, os níveis de cAMP aumentam, atingindo um máximo (~ 100 pmoles/mg proteína)quando a quase totalidade dos zoósporos se transformou em esferócitos. A partir daí observou-se um declínio gradual nos níveis de cAMP, que permanecem baixos durante toda a fase de crescimento, voltando a elevar-se na fase final da esporulação até alcançar o nível de zoósporo. O grande aumento na concentração intracelular de cAMP na fase de esferócitos é parcialmente explicado pela predominância da atividade de adenilato ciclase sobre a atividade de cAMP fosfodiesterase neste período; a possibilidade de uma ativação \"in vivo\" da adenilato ciclase, neste estágio do ciclo, não pode ser excluída. A queda nos níveis de cAMP que ocorre na passagem de esferócito a gérmen, numa fase onde a atividade de cAMP fosfodiesterase já e muito baixa, é devido principalmente a excreção deste nucleotídio cíclico para o meio extracelular. O grande aumento nos níveis de cAMP durante a transição de zoósporo a esferócito pode estar relacionado com a ativação metabólica ocorrendo nesta fase e pode também refletir uma característica de sistemas em diferenciação, isto é, a necessidade de altos níveis de cAMP para a transição entre dois estados celulares diferenciados. / The enzymes involved in the metabolism of cAMP have been studied, as well as the fluctuations in the concentration of this cyclic nucleotide and in the adenylate cyclase activity during the life cycle of B. emersonii. Zoospores were shown to contain independent specific enzymes involved in the hydrolysis of cAMP and cGMP. A single molecular species was found for the cAMP phosphodiesterase activity, which catalyses the hydrolysis of cAMP to 5\'-AMP. This enzyme displays normal Michaelis kinetics with an apparent Km of 2-4 µM; the addition of cGMP to the reaction mixtures does not modify the kinetic properties of the enzyme. Adenylate cyclase activity in B. emersonii is associated with particulate subcellular fractions, most probably bound to the zoospore plasma membrane. The activity requires Mn2+ and it is not activated by NaF, cathecolamines or other related compounds. The enzyme substrate is the MnATP2- complex and the kinetic data obtained studying the adenylate cyclase activity can be explained by a simple model where free ATP and Mn2+ compete with MnATP2- for the catalytic site of the enzyme, the affinity for MnATP2- being lower than for free Mn2+ and ATP. The specific activity of adenylate cyclase has been determined throughout the fungus life cycle. The enzyme activity is high in zoospores, falls slowly during germination remaining low at the growth phase and rising again during the later stage of sporulation. When this process is induced in the presence of cycloheximide, there is no increase in adenylate cyclase activity, suggesting that \"de novo\" synthesis of the enzyme occurs at this stage. Fluctuations in the intracellular levels of cAMP during the cell cycle of B. emersonii have also been shown. Zoospores contain an average concentration of 33 pmoles cAMP/mg protein. During germination, a significant increase in the cAMP levels is observed, reaching a maximum (ca. 100 pmoles/mg protein) when the majority of the zoospores have changed into round cells. From then on a gradual decline in the cAMP levels is observed. During the growth phase the cAMP contents of the cells remain low, increasing again late in the sporulation stage. The large increase in the intracellular concentration of cAMP in the round cell phase is partially explained by the predominance of adenylate cyclase activity over cAMP phosphodiesterase activity (during this stage); the possibility of an \"in vivo\" activation of the adenylate cyclase during this period, however, cannot be excluded. The decrease in the cAMP levels occurring during the passage of round cells to germlings, in a stage where cAMP phosphodiesterase activity is negligible, is mainly due to the excretion of this cyclic nucleotide to the extracellular medium. The rise in cAMP contents during encystment might be related to the activation of metabolism occurring in this phase and may also reflect a characteristic of differentiating systems, that is, high cAMP levels being necessary for a differentiative transition.

Foram estudadas as enzimas implicadas no metabolismo de cAMP, bem como as variações na concentração deste nucleotídeo cíclico e na atividade de adenilato ciclase durante o ciclo biológico de B. emersonii. Demonstrou-se que os zoósporos contêm enzimas específicas e distintas para a hidrólise de cAMP e cGMP. Existe apenas uma espécie molecular da cAMP fosfodiesterase, que hidrolisa cAMP a 5\'-AMP com um Km aparente de 2-4 µM; a presença de cGMP nas misturas de reação, não altera as propriedades cinéticas da enzima. A adenilato ciclase de B. emersonii é uma enzima particulada, provavelmente ligada à membrana plasmática do zoósporo, que exige especificamente Mn2+ para sua atividade. A enzima não é ativada por NaF, catecolaminas ou outros compostos de estrutura semelhante. O estudo das propriedades cinéticas da adenilato ciclase sugere um modelo simples no qual o verdadeiro substrato da enzima é o complexo MnATP2- e tanto ATP corno Mn2+ , nas suas formas livres, competem com o complexo pelo sítio catalítico da enzima, que apresenta uma afinidade maior pelas formas livres do que pelo complexo MnATP2-. A atividade especifica da adenilato ciclase, determinada durante o ciclo biológico do fungo, mostra-se elevada nos zoósporos, cai lentamente durante a germinação e permanece baixa em todo o período de crescimento, só voltando a apresentar um aumento na atividade após a indução da esporulação. Quando este processo e induzido na presença de cicloheximida, a atividade permanece baixa, sugerindo que a enzima é sintetizada \"de novo\" nesta fase do ciclo evolutivo. A concentração intracelular de cAMP foi também determinada nas várias fases do ciclo biológico de B. emersonii. No zoósporo encontrou-se um valor médio de 33 pmoles cAMP/mg proteína. Durante a germinação, os níveis de cAMP aumentam, atingindo um máximo (~ 100 pmoles/mg proteína)quando a quase totalidade dos zoósporos se transformou em esferócitos. A partir daí observou-se um declínio gradual nos níveis de cAMP, que permanecem baixos durante toda a fase de crescimento, voltando a elevar-se na fase final da esporulação até alcançar o nível de zoósporo. O grande aumento na concentração intracelular de cAMP na fase de esferócitos é parcialmente explicado pela predominância da atividade de adenilato ciclase sobre a atividade de cAMP fosfodiesterase neste período; a possibilidade de uma ativação \"in vivo\" da adenilato ciclase, neste estágio do ciclo, não pode ser excluída. A queda nos níveis de cAMP que ocorre na passagem de esferócito a gérmen, numa fase onde a atividade de cAMP fosfodiesterase já e muito baixa, é devido principalmente a excreção deste nucleotídio cíclico para o meio extracelular. O grande aumento nos níveis de cAMP durante a transição de zoósporo a esferócito pode estar relacionado com a ativação metabólica ocorrendo nesta fase e pode também refletir uma característica de sistemas em diferenciação, isto é, a necessidade de altos níveis de cAMP para a transição entre dois estados celulares diferenciados. / The enzymes involved in the metabolism of cAMP have been studied, as well as the fluctuations in the concentration of this cyclic nucleotide and in the adenylate cyclase activity during the life cycle of B. emersonii. Zoospores were shown to contain independent specific enzymes involved in the hydrolysis of cAMP and cGMP. A single molecular species was found for the cAMP phosphodiesterase activity, which catalyses the hydrolysis of cAMP to 5\'-AMP. This enzyme displays normal Michaelis kinetics with an apparent Km of 2-4 µM; the addition of cGMP to the reaction mixtures does not modify the kinetic properties of the enzyme. Adenylate cyclase activity in B. emersonii is associated with particulate subcellular fractions, most probably bound to the zoospore plasma membrane. The activity requires Mn2+ and it is not activated by NaF, cathecolamines or other related compounds. The enzyme substrate is the MnATP2- complex and the kinetic data obtained studying the adenylate cyclase activity can be explained by a simple model where free ATP and Mn2+ compete with MnATP2- for the catalytic site of the enzyme, the affinity for MnATP2- being lower than for free Mn2+ and ATP. The specific activity of adenylate cyclase has been determined throughout the fungus life cycle. The enzyme activity is high in zoospores, falls slowly during germination remaining low at the growth phase and rising again during the later stage of sporulation. When this process is induced in the presence of cycloheximide, there is no increase in adenylate cyclase activity, suggesting that \"de novo\" synthesis of the enzyme occurs at this stage. Fluctuations in the intracellular levels of cAMP during the cell cycle of B. emersonii have also been shown. Zoospores contain an average concentration of 33 pmoles cAMP/mg protein. During germination, a significant increase in the cAMP levels is observed, reaching a maximum (ca. 100 pmoles/mg protein) when the majority of the zoospores have changed into round cells. From then on a gradual decline in the cAMP levels is observed. During the growth phase the cAMP contents of the cells remain low, increasing again late in the sporulation stage. The large increase in the intracellular concentration of cAMP in the round cell phase is partially explained by the predominance of adenylate cyclase activity over cAMP phosphodiesterase activity (during this stage); the possibility of an \"in vivo\" activation of the adenylate cyclase during this period, however, cannot be excluded. The decrease in the cAMP levels occurring during the passage of round cells to germlings, in a stage where cAMP phosphodiesterase activity is negligible, is mainly due to the excretion of this cyclic nucleotide to the extracellular medium. The rise in cAMP contents during encystment might be related to the activation of metabolism occurring in this phase and may also reflect a characteristic of differentiating systems, that is, high cAMP levels being necessary for a differentiative transition.

<p>Leydig-ove&nbsp; ćelije&nbsp; testisa&nbsp; su&nbsp; primarno&nbsp; mesto&nbsp; sinteze mu&scaron;kih polnih hormona. Ovi hormoni su neophodani za reproduktivno,&nbsp; ali&nbsp; i&nbsp; za&nbsp; op&scaron;te&nbsp; zdravlje&nbsp; budući&nbsp; da&nbsp; su<br />ozbiljni zdravstveni problemi često povezani sa njihovom smanjenom produkcijom.&nbsp; Insulin i insulinu sličan faktor rasta&nbsp; 1,&nbsp; IGF1&nbsp; <em>(engl.</em>&nbsp; insulin&nbsp; like&nbsp; growth&nbsp; factor&nbsp; 1),&nbsp; i<br />signalizacija koju pokreću preko svojih receptora&nbsp; (INSR i IGF1R),&nbsp; su&nbsp; jedan&nbsp; od&nbsp; ključnih&nbsp; faktora&nbsp; koji&nbsp; reguli&scaron;u specifični razvoj tkiva, pa i samih gonada. Ipak,&nbsp; uloga&nbsp; i<br />mehanizmi&nbsp; delovanja&nbsp; ovih&nbsp; receptora&nbsp; u&nbsp; steroidogenim tkivima nisu&nbsp; u potpunosti&nbsp; poznati.&nbsp; Stoga je&nbsp; istraživanje&nbsp; uokviru ove&nbsp; doktorske&nbsp; disertacije&nbsp; koncipirano sa ciljem da se,&nbsp; na&nbsp; modelu&nbsp; prepubertalnih&nbsp; (P21)&nbsp; i&nbsp; adultnih&nbsp; (P80) mužjaka mi&scaron;eva sa kondicionalnom delecijom<em> Insr </em>i <em>Igf1</em>r gena&nbsp; u&nbsp; steroidogenim&nbsp; ćelijama&nbsp; (Insr/Igf1r-DKO), defini&scaron;e uloga INSR i IGF1R u regulisanju diferencijacije i&nbsp; steroidogene&nbsp; funkcije&nbsp; Leydig-ovih&nbsp; ćelija.&nbsp; Pored&nbsp; toga, mužjaci&nbsp; i&nbsp; ženke&nbsp; P21&nbsp; mi&scaron;eva&nbsp; sa&nbsp; istom&nbsp; delecijom&nbsp; su kori&scaron;ćeni&nbsp; za&nbsp; praćenje&nbsp; ekspresije&nbsp; glavnih&nbsp; markera mitohondrijalne&nbsp; biogeneze&nbsp; i&nbsp; fuzije/arhitekture&nbsp; u&nbsp; Leydigovim&nbsp; ćelijama,&nbsp; ovarijumima&nbsp; i&nbsp;&nbsp; nadbubrežnim&nbsp; žlezdama. Rezultati&nbsp; su&nbsp; potvrdili&nbsp; da&nbsp; delecija&nbsp; Insr&nbsp; i&nbsp; Igf1r&nbsp; u<br />steroidogenim&nbsp; tkivima&nbsp; utiče&nbsp; na&nbsp; diferencijaciju&nbsp; i funkcionalne karakteristike Leydig-ovih ćelija P21 i P80 mi&scaron;eva,&nbsp; upućujući&nbsp; na&nbsp; pojavu&nbsp; tzv.&nbsp; &bdquo;feminizacije&ldquo;.&nbsp; Broj<br />Leydig-ovih&nbsp; ćelija&nbsp; izolovanih&nbsp; iz&nbsp; P21&nbsp; i&nbsp; P80&nbsp; Insr/Igf1rDKO&nbsp; mi&scaron;eva&nbsp; bio&nbsp; je&nbsp; smanjen,&nbsp; a&nbsp; morfologija&nbsp; i ultrastruktura&nbsp; ovih&nbsp; ćelija&nbsp; izmenjene&nbsp; kod&nbsp; P21&nbsp; Insr/Igf1rDKO&nbsp; mi&scaron;eva.&nbsp; Steroidogeni&nbsp; kapacitet&nbsp; i&nbsp; aktivnost,&nbsp; kao&nbsp; i ekspresija&nbsp; glavnih&nbsp; elemenata&nbsp; steroidogene&nbsp; ma&scaron;inerije <em>(Lhcgr, Star, Cyp11a1, Cyp17a1, Hsd3b1&nbsp; i&nbsp; 6, Hsd17b3,</em><br /><em>Sf</em>1)&nbsp; bili su&nbsp; smanjeni&nbsp; u Leydig-ovim ćelijama P21 i P80 <em>Insr/Igf1</em>r-DKO mi&scaron;eva,&nbsp; dok je ekspresija transkripcionih represora&nbsp; steroidogeneze&nbsp; (Arr19&nbsp; i&nbsp; Dax1)&nbsp; bila&nbsp; povećana specifično&nbsp; u&nbsp; istim&nbsp; ćelijama,&nbsp; ali&nbsp; ne&nbsp; i&nbsp; u&nbsp; ostatku&nbsp; testisa.<br />Transkripcioni&nbsp; profil&nbsp; markera&nbsp; mu&scaron;kog&nbsp; pola&nbsp; (<em>Sry,&nbsp; Sox9, Amh</em>)&nbsp; bio&nbsp; je&nbsp; izmenjen&nbsp; u Leydig-ovim ćelijama P21 i P80 <em>Insr/Igf1r</em>-DKO&nbsp; mi&scaron;eva.&nbsp; Transkripcija&nbsp; markera&nbsp; ženskog pola (<em>Rspo1, Wnt4</em>) u testisima,&nbsp; kao i ekspresija&nbsp; Cyp19a1 i&nbsp; produkcija estradiola (E2) u Leydig-ovim ćelijama,&nbsp; P21 i&nbsp; P80&nbsp;<em> Insr/Igf1r</em>-DKO&nbsp; mi&scaron;eva&nbsp; bile&nbsp; su&nbsp; povećane. Transkripcija&nbsp; markera&nbsp; mitohondrijalne&nbsp; biogenze (<em>Ppargc1a,&nbsp; Tfam</em>,&nbsp; <em>Mtnd1</em>)&nbsp; bila&nbsp; je&nbsp; smanjena&nbsp; u&nbsp; Leydigovim&nbsp; ćelijama&nbsp; P21&nbsp; <em>Insr/Igf1r</em>-DKO&nbsp; mi&scaron;eva,&nbsp; dok&nbsp; supromene&nbsp; ekspresije&nbsp; izostale&nbsp; u&nbsp; ovarijumima&nbsp; ženki&nbsp; istog&nbsp; genotipa.&nbsp; Isti&nbsp; markeri&nbsp; su&nbsp; bili&nbsp; povećani&nbsp; u&nbsp; nabdubrežnim&nbsp; žlezdama&nbsp; oba&nbsp; pola.&nbsp; Markeri&nbsp; mitohondrijalne fuzije/arhitekture&nbsp; (<em>Mfn1&nbsp; i&nbsp; Mfn2)</em>&nbsp; bili&nbsp; su&nbsp; povećani&nbsp; u Leydig-ovim ćelijama P21 <em>Insr/Igf1r</em>-DKO mi&scaron;eva, &scaron;to je&nbsp; praćeno&nbsp; i&nbsp; naru&scaron;enom&nbsp; mitohondrijalnom&nbsp; fazom steroidogeneze (produkcija progesterona), kao i brojem i&nbsp; morfologijom ovim organela.&nbsp; Ekspresija istih markera u ovarijumima&nbsp; bila&nbsp; je&nbsp; nepromenjena.&nbsp; Sumirano,&nbsp; rezultati ovog istraživanja&nbsp; su&nbsp; pokazali&nbsp; da su&nbsp; INSR i IGF1R&nbsp; važni za&nbsp; diferencijaciju&nbsp; i&nbsp; steroidogenu&nbsp; funkciju&nbsp; Leydig-ovih&nbsp; ćelija&nbsp; P21&nbsp; i&nbsp; P80&nbsp; mi&scaron;eva.&nbsp; Takođe,&nbsp; ovi&nbsp; receptori&nbsp; su&nbsp; važni regulatori&nbsp; markera&nbsp; mitohondrijalne&nbsp; biogeneze&nbsp; i fuzije/arhiteture u steroidogenim ćelijama mu&scaron;kih gonada&nbsp; P21 mi&scaron;eva, ali ne i u steroidogenim ćelijama ovarijuma.&nbsp;</p> / <p>Leydig cells of testes are the primary site of the male sex hormones&nbsp; synthesis.&nbsp; These&nbsp; hormones&nbsp; are&nbsp; indispensable for&nbsp; both&nbsp; reproductive&nbsp; and&nbsp; general&nbsp; health&nbsp; since&nbsp; serious health&nbsp; problems&nbsp; are&nbsp; often&nbsp; associated&nbsp; with&nbsp; their&nbsp; reduced production.&nbsp; Insulin&nbsp; and&nbsp; insulin-like&nbsp; growth&nbsp; factor&nbsp; 1, IGF1&nbsp; (insulin&nbsp; like&nbsp; growth&nbsp; factor&nbsp; 1),&nbsp; and&nbsp; signaling triggered through&nbsp; their receptors (INSR and IGF1R), are&nbsp; one of the key&nbsp; factors&nbsp; that regulate specific development of&nbsp; tissue&nbsp; including&nbsp; gonads.&nbsp; However,&nbsp; the&nbsp; role&nbsp; and mechanisms&nbsp; of&nbsp; these&nbsp; receptors&nbsp; action&nbsp; in&nbsp; steroidogenic tissues are not known enough. This study was designed to&nbsp; observe &nbsp; the role of INSR and IGF1R in regulating the differentiation and steroidogenic function of Leydig cells by using the model of prepubertal (P21) and adult (P80) male mice with the conditional deletion of the&nbsp; Insr&nbsp; and Igf1r&nbsp; genes&nbsp; in&nbsp; steroidogenic&nbsp; cells&nbsp; (<em>Insr/Igf1r-</em>DKO).&nbsp; In addition,&nbsp; male&nbsp; and&nbsp; female&nbsp; P21&nbsp; mice&nbsp; with&nbsp; the&nbsp; samedeletion were used to monitor the expression of the main markers&nbsp; of&nbsp; mitochondrial&nbsp; biogenesis&nbsp; and fusion/architecture&nbsp; in&nbsp; Leydig&nbsp; cells,&nbsp; ovaries&nbsp; and&nbsp; adrenal glands.&nbsp; The&nbsp; results&nbsp; confirmed&nbsp; that&nbsp; deletion&nbsp; of&nbsp;<em> Insr</em>&nbsp; and<em> Igf1r&nbsp;</em> in&nbsp; steroidogenic&nbsp; tissues&nbsp; influences&nbsp; differentiation and&nbsp; functional&nbsp; characteristics&nbsp; of&nbsp; Leydig&nbsp; cells&nbsp; isolated from&nbsp; P21&nbsp; and&nbsp; P80&nbsp; mice,&nbsp; suggesting&nbsp; an&nbsp; appearance&nbsp; of &quot;feminization&quot;.&nbsp; The&nbsp; number&nbsp; of&nbsp; Leydig&nbsp; cells&nbsp; isolated from&nbsp; both&nbsp; P21&nbsp; and&nbsp; P80&nbsp; <em>Insr/Igf1</em>r-DKO&nbsp; mice&nbsp; was reduced.&nbsp; Morphology&nbsp; and&nbsp; ultrastructure&nbsp; of&nbsp; Leydig&nbsp; cells were&nbsp; disturbed&nbsp; in&nbsp; P21&nbsp; <em>Insr/Igf1r-</em>DKO&nbsp; mice. Steroidogenic capacity and activity, as well as expression of the main elements of&nbsp; steroidogenic machinery (<em>Lhcgr, Star, Cyp11a1, Cyp17a1, Hsd3b1&nbsp; and&nbsp; 6, Hsd17b3, Sf1) </em>were&nbsp; decreased&nbsp; in&nbsp; Leydig&nbsp; cells&nbsp; from&nbsp; P21&nbsp; and&nbsp; P80 I<em>nsr/Igf1</em>r-DKO&nbsp; mice,&nbsp; while&nbsp; the&nbsp; expression&nbsp; of transcriptional&nbsp; repressors&nbsp; of&nbsp; steroidogenesis&nbsp; (<em>Arr19</em>&nbsp; and <em>Dax1) </em>was increased&nbsp; in the same cells, but not in the rest of&nbsp; the&nbsp; testes.&nbsp; Transcription&nbsp; profile&nbsp; of&nbsp; the&nbsp; male&nbsp; sex markers&nbsp; (<em>Sry,&nbsp; Sox9</em>,&nbsp; <em>Amh</em>)&nbsp; was&nbsp; altered&nbsp; in&nbsp; Leydig&nbsp; cells from&nbsp; P21&nbsp; and&nbsp; P80&nbsp; <em>Insr/Igf1</em>r-DKO&nbsp; mice.&nbsp; Transcription of the female sex markers (<em>Rspo1, Wnt4</em>) in the testes, as well&nbsp; as&nbsp; <em>Cyp19a1&nbsp; </em>expression&nbsp; and&nbsp; estradiol&nbsp; (E2) production in Leydig cells,&nbsp; from P21 and P80&nbsp; I<em>nsr/Igf1</em>rDKO&nbsp; mice&nbsp; were&nbsp; increased.&nbsp; Transcription&nbsp; of mitochondrial&nbsp; biogenesis&nbsp; markers&nbsp; (<em>Ppargc1a,&nbsp; Tfam, Mtnd1</em>)&nbsp; was&nbsp; declined&nbsp; in&nbsp; Leydig&nbsp; cells&nbsp; from&nbsp; P21<em> Insr/Igf1r-</em>DKO mice, while changes were absent in&nbsp; the ovaries of the same genotype.&nbsp; Transcription of the&nbsp; same markers&nbsp; was&nbsp; increased&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; adrenal&nbsp; glands&nbsp; of&nbsp; both sexes.&nbsp; The&nbsp; mitochondrial&nbsp; fusion/architecture&nbsp; markers (<em>Mfn1</em>&nbsp; and&nbsp; <em>Mfn2</em>)&nbsp; were&nbsp; increased&nbsp; in&nbsp; Leydig&nbsp; cells&nbsp; from<em> Insr/Igf1r</em>-DKO&nbsp; mice&nbsp; and&nbsp; followed&nbsp; by&nbsp; disturbedmitochondrial&nbsp; phase&nbsp; of&nbsp; steroidogenesis&nbsp; (progesterone production), as well as&nbsp; decreased&nbsp; number and&nbsp; disturbed morphology&nbsp; of&nbsp; mitochondria.&nbsp;&nbsp; Expression&nbsp; of&nbsp; the&nbsp; same markers&nbsp; in&nbsp; the&nbsp; ovaries&nbsp; was&nbsp; unchanged.&nbsp; In&nbsp; summary, results&nbsp; of&nbsp; this&nbsp; study&nbsp; showed&nbsp; that&nbsp; INSR&nbsp; and&nbsp; IGF1R&nbsp; are important in differentiation and steroidogenic function of Leydig&nbsp; cells&nbsp; from&nbsp; P21&nbsp; and&nbsp; P80&nbsp; mice.&nbsp; Also,&nbsp; these receptors&nbsp; are&nbsp; important&nbsp; regulators&nbsp; of&nbsp; mitochondrial biogenesis&nbsp; and&nbsp;&nbsp; fusion/architecture&nbsp; markers&nbsp; in steroidogenic&nbsp; cells&nbsp; of&nbsp; P21&nbsp; male&nbsp; mice,&nbsp; but&nbsp; not&nbsp; in steroidogenic cells of ovaries.</p>