Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-14T15:37:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1034565 bytes, checksum: c504a98dadccf295255bca92bfe49d24 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T15:37:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1034565 bytes, checksum: c504a98dadccf295255bca92bfe49d24 (MD5) Previous issue date: 2005-04-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os genes WRKY codificam proteínas de ligação ao DNA que reconhecem a seqüência conservada de nucleotídeos (T)(T)TGAC(C/T) (W box), presente em promotores de genes de defesa relatados em plantas. As proteínas WRKY podem ser divididas em grupos e subgrupos distintos, com base nas características do domínio WRKY de ligação ao DNA altamente conservado entre os membros dessa família e de pequenos domínios adicionais conservados. Esse trabalho objetivou caracterizar, mediante a obtenção da seqüência completa, dois fatores de transcrição WRKY relacionados aos clones de cDNA MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3 que foram expressos na linhagem resistente NC-EBR-2 de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) 36 horas após a inoculação com o fungo Alternaria solani. A triagem efetuada por PCR de uma biblioteca de fosmídeos da linhagem NC- EBR-2, utilizando-se oligonucleotídeos derivados das seqüências dos clones MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3, resultou na identificação de um clone fosmídeo correspondente a cada clone. Por meio do seqüenciamento shotgun desses clones, foram obtidas duas ORFs (open reading frame, sequência aberta de leitura) denominadas de LeWRKY1 (fator de transcrição WRKY 1 de L. esculentum) com 1.165pb e LeWRKY2 (fator de transcrição WRKY 2 de L. esculentum) com 1.570pb, correspondente aos clones MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3, respectivamente. A proteína codificada por LeWRKY1, que apresenta similaridade de seqüência com a proteína NtWRKY3 de Nicotiana tabacum, possui em sua seqüência de 328 aminoácidos um domínio WRKY de ligação ao DNA, um motivo dedo de zinco do tipo Cys 2 His 2, um motivo conservado denominado domínio 1 que constitui um sinal de localização nuclear e um domínio conservado que inclui a região C de ligação a calmodulina. Essas características permitem classificar LeWRKY1 no grupo II, subgrupo d, dos fatores de transcrição WRKY. Esta proteína apresenta também um domínio N-terminal de 41 aminoácidos com função ainda desconhecida. Na região promotora de LeWRKY1 foi observada a presença do elemento promotor TATA box a –55pb e duas regiões W box a – 89pb (WA) e a –76pb (WB) do sítio de início da transcrição. Análise de Southern blot revelou que esse gene está presente em mais de uma cópia no genoma do tomateiro. A proteína codificada pelo gene LeWRKY2 apresentou similaridade de seqüência com a proteína tWRKY4 de Nicotiana tabacum e possui uma seqüência de 291 aminoácidos constituída de um domínio WRKY de ligação ao DNA e um motivo dedo de zinco Cys 2 HisCys, sendo classificada como membro do grupo III dos fatores de transcrição WRKY. A análise por meio de Southern blot indicou que o gene LeWRKY2 está presente em única cópia no genoma do tomateiro. A comprovação e a quantificação da contribuição desses genes na resistência do tomateiro a Alternaria solani depende, entretanto, de estudos de expressão e análise funcional. / The WRKY genes codify to DNA binding proteins that recognize the conserved nucleotide sequences (T)(T)TGAC(C/T) (W box) present in promoters of plant defense genes. The WRKY proteins can be divided in distinct groups and subgroups, based on characteristics of the DNA binding WRKY domain and on additional conserved small domains. This work aimed to characterize, by means of sequencing, two WRKY transcription factors related to cDNA clones MG.LE.EB.A3.0208D3 and MG.LE.EB.A3.0209E3 expressed in the resistant tomato lineage NC-EBR-2 36 hours post inoculation with the fungus Alternaria solani. Genomic DNA fragments that contained the genes correspondent to each cDNA clones were identified by PCR screening of NC-EBR-2 fosmid genomic library making use of primers derived from MG.LE.EB.A3.0208D3 and MG.LE.EB.A3.0209E3 sequences. Two ORFs (open reading frame) were obtained by sequencing clones from the shotgun library of these fosmids. They were designated as LeWRKY1 (L. esculentum WRKY transcription factor 1, correspondent to MG.LE.EB.A3.0208D3) and LeWRKY2 (L. esculentum WRKY transcription factor 2, correspondent to MG.LE.EB.A3.0209E3), having 1.165bp and 1.570bp, respectively. The protein codified by LeWRKY1 that is similar to the protein NtWRKY3 of Nicotiana tabacum and has 328 amino acids with one WRKY DNA binding domain, one Cys 2 His 2 zinc finger motif, one conserved nuclear localization signal, and one conserved domain that included the calmodulin binding region C. These characteristics classify LeWRKY1 into group II, subgroup d of WRKY transcription factors. This protein also presents an N-terminal domain that comprises 41 amino acids of unknown function. One TATA box element at –55 bp and two W box regions at –89 bp (WA) and –76 bp (WB) at the transcription start position were observed in promoter region of LeWRKY1. Southern blot analysis indicated that more than one copy of this gene is present in the tomato genome. The protein codified by LeWRKY2 presented sequence similarity to tWRKY4 protein of N. tabacum and has 291 amino acids sequence that consists of WRKY DNA binding protein domain and one Cys 2 HisCys zinc finger motif, being classified as group III member of WRKY transcription factors. Southern blot analysis indicated that of LeWRKY2 is a single copy gene. / Dissertação antiga

Devido ao constante ataque à camada de ozônio, as plantas, nos próximos anos, terão que lidar cada vez mais com uma maior quantidade de luz UV atingindo a atmosfera terrestre. O arroz é considerado uma planta modelo para as monocotiledôneas por possuir um genoma relativamente pequeno (aproximadamente 390 Mb) e devido a sua grande sintenia com outros cereais. Recentemente, as proteínas E2F foram descritas, especialmente em vertebrados, como fatores transcricionais que podem estar envolvidos com a resposta ao dano de DNA. Tendo como objetivo principal estudar como a família de fatores transcricionais E2F responde ao dano genotóxico em arroz, experimentos com luz UV-B foram conduzidos para avaliar o envolvimento destes com as respostas ao dano de DNA. Além disso, foram realizadas análises filogenéticas dessa família gênica com representantes de plantas. Em arroz, estudos prévios de nosso grupo identificaram seis genes pertencentes à família E2F, sendo quatro E2F típicos e dois E2F atípicos. Em resposta à luz UV, dois dos quatro genes que codificam E2F típicos e os dois genes de E2F atípicos, tiveram a expressão relativa aumentada após o estresse em relação a plantas mantidas em condição controle. Nesse experimento, além dos genes E2F e dos genes de reparo, também foram avaliados os níveis de transcritos de genes sabidamente envolvidos com ciclo celular e apoptose, permitindo-se verificar se o aumento de expressão dos genes E2F em resposta ao estresse está efetivamente relacionado com a resposta a danos no DNA e não a estes dois outros processos celulares. As análises filogenéticas revelaram que um desses dois E2F típicos, que apresentou sua expressão diferencial nas condições testadas, provavelmente atue como um repressor de transcrição. Esta afirmação está baseada em estudos comparativos com sequências da planta modelo para as dicotiledôneas, Arabidopsis thaliana. O conjunto de resultados obtidos sugere que alguns membros da família E2F de arroz estão envolvidos especificamente com as repostas ao dano ao DNA, além de permitir a proposição de um possível mecanismo de ação. / Due to the constant attack to the ozone layer, the plants, in the coming years, will have to deal with an increasing amount of UV light reaching the earth's atmosphere. Rice is considered a model plant for monocots due to its relatively small genome (approximately 390 Mb) and because its high synteny with other cereals. E2F proteins have recently been reported, especially in vertebrates, as transcriptional factors involved in the response to DNA damage. To study how the family of transcription factors E2F responds to genotoxic damage in rice, experiments with UV-B were conducted to evaluate their involvement with the responses to DNA damage. In addition, phylogenetic analyzes of this gene family in plants were performed. In rice, previous studies of our group identified six genes belonging to the E2F family, four typical and two atypical E2F. In response to UV light, two of four genes encoding typical E2F and the two atypical E2F genes increased their relative expression after stress compared to the plants grown in the control condition. In this experiment, in addition to the E2F gene and repair genes, we have also analyzed the transcriptional level of genes known to be involved with cell cycle and apoptosis, in order to verify if the increases in E2F gene expression, in response to stress, are actually related to the response to DNA damage, rather than to other two cellular processes. Phylogenetic analysis revealed that one of these two typical E2F, which showed differential expression under the conditions tested, probably acts as a transcriptional repressor. This analysis is based on comparisons with sequences from the model plant for dicots, Arabidopsis thaliana. These set of results suggest that some members of the E2F family of rice are involved specifically with responses to DNA damage and allowed the proposition of a possible mechanism of action.

As proteínas Dof (ligação ao DNA com um dedo, do inglês, DNA binding with One Finger) compreendem uma família de fatores de transcrição exclusiva de plantas, caracterizadas pela presença de um domínio de ligação ao DNA semelhante ao domínio ‘dedo-de-zinco’. Estas proteínas estão associadas a diferentes processos biológicos vegetais como germinação, florescimento e outros. O objetivo principal do presente trabalho foi a caracterização funcional de três fatores de transcrição Dof de Eucalyptus grandis a fim de avaliar a função dos mesmos na biogênese do sistema vascular desta planta. Baseado em resultados prévios do nosso grupo, foram escolhidos três genes (EgD01698, EgD00607 e EgK00405) que apresentaram um perfil de expressão significativo em tecidos vasculares de caules de E. grandis e, também, alta homologia a genes Dof previamente caracterizados em tecidos vasculares de outros vegetais. As regiões codificadoras desses genes foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Por recombinação, os genes foram transferidos para o vetor pH7WG2D (VIB) para expressão em Arabidopsis thaliana. Os genes Dof também foram clonados no vetor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) para a expressão heteróloga em Escherichia coli Plantas de A. thaliana foram transformadas com os vetores binários pelo método de imersão floral e as sementes foram selecionadas com o antibiótico higromicina. Apenas duas plantas para o gene D00607 e duas para o gene K00405 foram obtidas. As plantas transgênicas estão atualmente sob cultivo para serem geradas linhagens homozigotas e, assim, caracterizadas molecularmente. Além disso, a localização subcelular foi verificada pela expressão transiente de Dof::GFP em folhas de Nicotiana benthamiana. A expressão de GFP foi detectada difusa no citoplasma e no núcleo. Entretanto, esses ensaios deverão ser repetidos para confirmação dos resultados. Em paralelo, células de E. coli BL21 (DE3) pT-GroE foram transformadas com os vetores pGEX-4T-1-D01698 e pGEX-4T-1-D00607. A expressão gênica foi induzida durante 20 h a 20oC com 1 mM IPTG. As proteínas foram detectadas na fração solúvel por SDS-PAGE e western blot e, posteriormente, purificadas por cromatografia de afinidade. A expressão bem sucedida das proteínas Dof em E. coli permitirá a produção dessas proteínas para futuros estudos de caracterização funcional. / DNA binding with one finger (Dof) proteins comprehend a family of plant exclusive transcription factors characterized by the presence of the Dof DNA binding domain whose structure is similar to the zinc finger domain. They are associated with diverse biological plant processes such as germination, flowering and many others. The aim of this work was to functionally characterize three Dof genes from Eucalyptus grandis in order to evaluate their role in the biogenesis of vascular system. Based on previous results related to the E. grandis Dof gene family studies obtained by our group, we chose three genes (D01698, D00607 and K00405) with higher expression profile in vascular tissues of E. grandis stalk, as well as with higher homology to Dof genes previously characterized as critical to the genesis of vascular tissues. The CDS of these genes were amplified by PCR and cloned into pENTR/D-TOPO entry vector (Invitrogen). Via recombination, Dof genes were then transferred to the pH7WG2D binary vector (VIB) for the expression in Arabidopsis thaliana. They were also cloned into the pGEX-4T-1 vector (GE Healthcare) for Escherichia coli recombinant gene expression. A. thaliana plants were genetically transformed with recombinant binary plasmids by the floral dip method and seeds were selected by hygromycin resistance Only two plants for the D00607 gene and two plants for the K00405 gene were obtained. Plants are being cultivated in order to obtain homozygous individuals and they will be molecularly characterized. Additionally, subcellular localization was verified by transient expression of Dof::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the cytoplasm and nucleus. However, these assays need to be repeated in order to confirm the previous results. In parallel, E. coli BL21 (DE3) pT-GroE cells were transformed with pGEX-4T-1- D01698 and pGEX-4T-1-D00607. Gene expression was induced for 20 h at 20 oC with 1 mM IPTG for protein production. Proteins were detected in the soluble fraction by SDS-PAGE and western blot analysis and then were purified by affinity chromatography. The successful expression of Dof proteins in E. coli provides a way to produce these proteins for future functional characterization studies.

As proteínas Dof (ligação ao DNA com um dedo, do inglês, DNA binding with One Finger) compreendem uma família de fatores de transcrição exclusiva de plantas, caracterizadas pela presença de um domínio de ligação ao DNA semelhante ao domínio ‘dedo-de-zinco’. Estas proteínas estão associadas a diferentes processos biológicos vegetais como germinação, florescimento e outros. O objetivo principal do presente trabalho foi a caracterização funcional de três fatores de transcrição Dof de Eucalyptus grandis a fim de avaliar a função dos mesmos na biogênese do sistema vascular desta planta. Baseado em resultados prévios do nosso grupo, foram escolhidos três genes (EgD01698, EgD00607 e EgK00405) que apresentaram um perfil de expressão significativo em tecidos vasculares de caules de E. grandis e, também, alta homologia a genes Dof previamente caracterizados em tecidos vasculares de outros vegetais. As regiões codificadoras desses genes foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Por recombinação, os genes foram transferidos para o vetor pH7WG2D (VIB) para expressão em Arabidopsis thaliana. Os genes Dof também foram clonados no vetor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) para a expressão heteróloga em Escherichia coli Plantas de A. thaliana foram transformadas com os vetores binários pelo método de imersão floral e as sementes foram selecionadas com o antibiótico higromicina. Apenas duas plantas para o gene D00607 e duas para o gene K00405 foram obtidas. As plantas transgênicas estão atualmente sob cultivo para serem geradas linhagens homozigotas e, assim, caracterizadas molecularmente. Além disso, a localização subcelular foi verificada pela expressão transiente de Dof::GFP em folhas de Nicotiana benthamiana. A expressão de GFP foi detectada difusa no citoplasma e no núcleo. Entretanto, esses ensaios deverão ser repetidos para confirmação dos resultados. Em paralelo, células de E. coli BL21 (DE3) pT-GroE foram transformadas com os vetores pGEX-4T-1-D01698 e pGEX-4T-1-D00607. A expressão gênica foi induzida durante 20 h a 20oC com 1 mM IPTG. As proteínas foram detectadas na fração solúvel por SDS-PAGE e western blot e, posteriormente, purificadas por cromatografia de afinidade. A expressão bem sucedida das proteínas Dof em E. coli permitirá a produção dessas proteínas para futuros estudos de caracterização funcional. / DNA binding with one finger (Dof) proteins comprehend a family of plant exclusive transcription factors characterized by the presence of the Dof DNA binding domain whose structure is similar to the zinc finger domain. They are associated with diverse biological plant processes such as germination, flowering and many others. The aim of this work was to functionally characterize three Dof genes from Eucalyptus grandis in order to evaluate their role in the biogenesis of vascular system. Based on previous results related to the E. grandis Dof gene family studies obtained by our group, we chose three genes (D01698, D00607 and K00405) with higher expression profile in vascular tissues of E. grandis stalk, as well as with higher homology to Dof genes previously characterized as critical to the genesis of vascular tissues. The CDS of these genes were amplified by PCR and cloned into pENTR/D-TOPO entry vector (Invitrogen). Via recombination, Dof genes were then transferred to the pH7WG2D binary vector (VIB) for the expression in Arabidopsis thaliana. They were also cloned into the pGEX-4T-1 vector (GE Healthcare) for Escherichia coli recombinant gene expression. A. thaliana plants were genetically transformed with recombinant binary plasmids by the floral dip method and seeds were selected by hygromycin resistance Only two plants for the D00607 gene and two plants for the K00405 gene were obtained. Plants are being cultivated in order to obtain homozygous individuals and they will be molecularly characterized. Additionally, subcellular localization was verified by transient expression of Dof::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the cytoplasm and nucleus. However, these assays need to be repeated in order to confirm the previous results. In parallel, E. coli BL21 (DE3) pT-GroE cells were transformed with pGEX-4T-1- D01698 and pGEX-4T-1-D00607. Gene expression was induced for 20 h at 20 oC with 1 mM IPTG for protein production. Proteins were detected in the soluble fraction by SDS-PAGE and western blot analysis and then were purified by affinity chromatography. The successful expression of Dof proteins in E. coli provides a way to produce these proteins for future functional characterization studies.

Devido ao constante ataque à camada de ozônio, as plantas, nos próximos anos, terão que lidar cada vez mais com uma maior quantidade de luz UV atingindo a atmosfera terrestre. O arroz é considerado uma planta modelo para as monocotiledôneas por possuir um genoma relativamente pequeno (aproximadamente 390 Mb) e devido a sua grande sintenia com outros cereais. Recentemente, as proteínas E2F foram descritas, especialmente em vertebrados, como fatores transcricionais que podem estar envolvidos com a resposta ao dano de DNA. Tendo como objetivo principal estudar como a família de fatores transcricionais E2F responde ao dano genotóxico em arroz, experimentos com luz UV-B foram conduzidos para avaliar o envolvimento destes com as respostas ao dano de DNA. Além disso, foram realizadas análises filogenéticas dessa família gênica com representantes de plantas. Em arroz, estudos prévios de nosso grupo identificaram seis genes pertencentes à família E2F, sendo quatro E2F típicos e dois E2F atípicos. Em resposta à luz UV, dois dos quatro genes que codificam E2F típicos e os dois genes de E2F atípicos, tiveram a expressão relativa aumentada após o estresse em relação a plantas mantidas em condição controle. Nesse experimento, além dos genes E2F e dos genes de reparo, também foram avaliados os níveis de transcritos de genes sabidamente envolvidos com ciclo celular e apoptose, permitindo-se verificar se o aumento de expressão dos genes E2F em resposta ao estresse está efetivamente relacionado com a resposta a danos no DNA e não a estes dois outros processos celulares. As análises filogenéticas revelaram que um desses dois E2F típicos, que apresentou sua expressão diferencial nas condições testadas, provavelmente atue como um repressor de transcrição. Esta afirmação está baseada em estudos comparativos com sequências da planta modelo para as dicotiledôneas, Arabidopsis thaliana. O conjunto de resultados obtidos sugere que alguns membros da família E2F de arroz estão envolvidos especificamente com as repostas ao dano ao DNA, além de permitir a proposição de um possível mecanismo de ação. / Due to the constant attack to the ozone layer, the plants, in the coming years, will have to deal with an increasing amount of UV light reaching the earth's atmosphere. Rice is considered a model plant for monocots due to its relatively small genome (approximately 390 Mb) and because its high synteny with other cereals. E2F proteins have recently been reported, especially in vertebrates, as transcriptional factors involved in the response to DNA damage. To study how the family of transcription factors E2F responds to genotoxic damage in rice, experiments with UV-B were conducted to evaluate their involvement with the responses to DNA damage. In addition, phylogenetic analyzes of this gene family in plants were performed. In rice, previous studies of our group identified six genes belonging to the E2F family, four typical and two atypical E2F. In response to UV light, two of four genes encoding typical E2F and the two atypical E2F genes increased their relative expression after stress compared to the plants grown in the control condition. In this experiment, in addition to the E2F gene and repair genes, we have also analyzed the transcriptional level of genes known to be involved with cell cycle and apoptosis, in order to verify if the increases in E2F gene expression, in response to stress, are actually related to the response to DNA damage, rather than to other two cellular processes. Phylogenetic analysis revealed that one of these two typical E2F, which showed differential expression under the conditions tested, probably acts as a transcriptional repressor. This analysis is based on comparisons with sequences from the model plant for dicots, Arabidopsis thaliana. These set of results suggest that some members of the E2F family of rice are involved specifically with responses to DNA damage and allowed the proposition of a possible mechanism of action.

Devido ao constante ataque à camada de ozônio, as plantas, nos próximos anos, terão que lidar cada vez mais com uma maior quantidade de luz UV atingindo a atmosfera terrestre. O arroz é considerado uma planta modelo para as monocotiledôneas por possuir um genoma relativamente pequeno (aproximadamente 390 Mb) e devido a sua grande sintenia com outros cereais. Recentemente, as proteínas E2F foram descritas, especialmente em vertebrados, como fatores transcricionais que podem estar envolvidos com a resposta ao dano de DNA. Tendo como objetivo principal estudar como a família de fatores transcricionais E2F responde ao dano genotóxico em arroz, experimentos com luz UV-B foram conduzidos para avaliar o envolvimento destes com as respostas ao dano de DNA. Além disso, foram realizadas análises filogenéticas dessa família gênica com representantes de plantas. Em arroz, estudos prévios de nosso grupo identificaram seis genes pertencentes à família E2F, sendo quatro E2F típicos e dois E2F atípicos. Em resposta à luz UV, dois dos quatro genes que codificam E2F típicos e os dois genes de E2F atípicos, tiveram a expressão relativa aumentada após o estresse em relação a plantas mantidas em condição controle. Nesse experimento, além dos genes E2F e dos genes de reparo, também foram avaliados os níveis de transcritos de genes sabidamente envolvidos com ciclo celular e apoptose, permitindo-se verificar se o aumento de expressão dos genes E2F em resposta ao estresse está efetivamente relacionado com a resposta a danos no DNA e não a estes dois outros processos celulares. As análises filogenéticas revelaram que um desses dois E2F típicos, que apresentou sua expressão diferencial nas condições testadas, provavelmente atue como um repressor de transcrição. Esta afirmação está baseada em estudos comparativos com sequências da planta modelo para as dicotiledôneas, Arabidopsis thaliana. O conjunto de resultados obtidos sugere que alguns membros da família E2F de arroz estão envolvidos especificamente com as repostas ao dano ao DNA, além de permitir a proposição de um possível mecanismo de ação. / Due to the constant attack to the ozone layer, the plants, in the coming years, will have to deal with an increasing amount of UV light reaching the earth's atmosphere. Rice is considered a model plant for monocots due to its relatively small genome (approximately 390 Mb) and because its high synteny with other cereals. E2F proteins have recently been reported, especially in vertebrates, as transcriptional factors involved in the response to DNA damage. To study how the family of transcription factors E2F responds to genotoxic damage in rice, experiments with UV-B were conducted to evaluate their involvement with the responses to DNA damage. In addition, phylogenetic analyzes of this gene family in plants were performed. In rice, previous studies of our group identified six genes belonging to the E2F family, four typical and two atypical E2F. In response to UV light, two of four genes encoding typical E2F and the two atypical E2F genes increased their relative expression after stress compared to the plants grown in the control condition. In this experiment, in addition to the E2F gene and repair genes, we have also analyzed the transcriptional level of genes known to be involved with cell cycle and apoptosis, in order to verify if the increases in E2F gene expression, in response to stress, are actually related to the response to DNA damage, rather than to other two cellular processes. Phylogenetic analysis revealed that one of these two typical E2F, which showed differential expression under the conditions tested, probably acts as a transcriptional repressor. This analysis is based on comparisons with sequences from the model plant for dicots, Arabidopsis thaliana. These set of results suggest that some members of the E2F family of rice are involved specifically with responses to DNA damage and allowed the proposition of a possible mechanism of action.

As proteínas Dof (ligação ao DNA com um dedo, do inglês, DNA binding with One Finger) compreendem uma família de fatores de transcrição exclusiva de plantas, caracterizadas pela presença de um domínio de ligação ao DNA semelhante ao domínio ‘dedo-de-zinco’. Estas proteínas estão associadas a diferentes processos biológicos vegetais como germinação, florescimento e outros. O objetivo principal do presente trabalho foi a caracterização funcional de três fatores de transcrição Dof de Eucalyptus grandis a fim de avaliar a função dos mesmos na biogênese do sistema vascular desta planta. Baseado em resultados prévios do nosso grupo, foram escolhidos três genes (EgD01698, EgD00607 e EgK00405) que apresentaram um perfil de expressão significativo em tecidos vasculares de caules de E. grandis e, também, alta homologia a genes Dof previamente caracterizados em tecidos vasculares de outros vegetais. As regiões codificadoras desses genes foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Por recombinação, os genes foram transferidos para o vetor pH7WG2D (VIB) para expressão em Arabidopsis thaliana. Os genes Dof também foram clonados no vetor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) para a expressão heteróloga em Escherichia coli Plantas de A. thaliana foram transformadas com os vetores binários pelo método de imersão floral e as sementes foram selecionadas com o antibiótico higromicina. Apenas duas plantas para o gene D00607 e duas para o gene K00405 foram obtidas. As plantas transgênicas estão atualmente sob cultivo para serem geradas linhagens homozigotas e, assim, caracterizadas molecularmente. Além disso, a localização subcelular foi verificada pela expressão transiente de Dof::GFP em folhas de Nicotiana benthamiana. A expressão de GFP foi detectada difusa no citoplasma e no núcleo. Entretanto, esses ensaios deverão ser repetidos para confirmação dos resultados. Em paralelo, células de E. coli BL21 (DE3) pT-GroE foram transformadas com os vetores pGEX-4T-1-D01698 e pGEX-4T-1-D00607. A expressão gênica foi induzida durante 20 h a 20oC com 1 mM IPTG. As proteínas foram detectadas na fração solúvel por SDS-PAGE e western blot e, posteriormente, purificadas por cromatografia de afinidade. A expressão bem sucedida das proteínas Dof em E. coli permitirá a produção dessas proteínas para futuros estudos de caracterização funcional. / DNA binding with one finger (Dof) proteins comprehend a family of plant exclusive transcription factors characterized by the presence of the Dof DNA binding domain whose structure is similar to the zinc finger domain. They are associated with diverse biological plant processes such as germination, flowering and many others. The aim of this work was to functionally characterize three Dof genes from Eucalyptus grandis in order to evaluate their role in the biogenesis of vascular system. Based on previous results related to the E. grandis Dof gene family studies obtained by our group, we chose three genes (D01698, D00607 and K00405) with higher expression profile in vascular tissues of E. grandis stalk, as well as with higher homology to Dof genes previously characterized as critical to the genesis of vascular tissues. The CDS of these genes were amplified by PCR and cloned into pENTR/D-TOPO entry vector (Invitrogen). Via recombination, Dof genes were then transferred to the pH7WG2D binary vector (VIB) for the expression in Arabidopsis thaliana. They were also cloned into the pGEX-4T-1 vector (GE Healthcare) for Escherichia coli recombinant gene expression. A. thaliana plants were genetically transformed with recombinant binary plasmids by the floral dip method and seeds were selected by hygromycin resistance Only two plants for the D00607 gene and two plants for the K00405 gene were obtained. Plants are being cultivated in order to obtain homozygous individuals and they will be molecularly characterized. Additionally, subcellular localization was verified by transient expression of Dof::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the cytoplasm and nucleus. However, these assays need to be repeated in order to confirm the previous results. In parallel, E. coli BL21 (DE3) pT-GroE cells were transformed with pGEX-4T-1- D01698 and pGEX-4T-1-D00607. Gene expression was induced for 20 h at 20 oC with 1 mM IPTG for protein production. Proteins were detected in the soluble fraction by SDS-PAGE and western blot analysis and then were purified by affinity chromatography. The successful expression of Dof proteins in E. coli provides a way to produce these proteins for future functional characterization studies.

O eucalipto é a arbórea mais cultivada no mundo para a exploração comercial de madeira. No Brasil, a principal espécie do gênero Eucalyptus utilizada é E. grandis, cujo cultivo, principalmente de híbridos com outras espécies, é voltado para a produção de celulose e papel. A relevância econômica do eucalipto para o Brasil e para vários países do mundo tem estimulado avanços científicos e tecnológicos, desde a área de biologia molecular até a silvicultura e a indústria de processamento da madeira. Entre os tópicos de interesse em biologia molecular estão genes e proteínas responsáveis pelo crescimento, pela qualidade da madeira e pela resposta vegetal a estresses ambientais. A família de proteínas Dof (DNA binding with one finger) compreende fatores de transcrição exclusivos de plantas, caracterizados pela presença do domínio Dof de ligação ao DNA, que contém uma estrutura semelhante ao domínio “dedo-de-zinco”. Esses fatores estão relacionados à ativação e à inibição de promotores de genes envolvidos nos mais variados fenômenos metabólicos das plantas tais como desenvolvimento do endosperma, metabolismo de carboidratos, germinação de sementes, desenvolvimento vascular e resposta a fitormônios. Pelo presente trabalho, visou-se caracterizar os fatores de transcrição Dof de E. grandis realizando-se análises filogenéticas com ferramentas de bioinformática, além de ensaios de RT-qPCR para se determinar perfis de expressão relativa dos genes Dof de E. grandis em folhas, caules e raízes de plantas sob diferentes tratamentos bióticos e abióticos que incluíram ABA, NAA, KIN, NaCl e seca. As análises filogenéticas permitiram a identificação de dez pares de genes parálogos no genoma de E. grandis, além de 13 grandes clados e nove pequenos grupos de genes ortólogos entre E. grandis, Arabidopsis thaliana e Populus trichocarpa. Os resultados permitiram-nos sugerir funções aos fatores de transcrição Dof de E. grandis. Os perfis de expressão relativa exibidos levaram-nos a concluir que os genes Dof são expressos em diversos órgãos e apresentam diferentes graus de acúmulo de mRNAs sob diferentes tratamentos. / Eucalypt is the most widely cultivated tree in the world for commercial logging. In Brazil, the main species of the Eucalyptus genus used is E. grandis, whose cultivation, mainly done with hybrids, is geared primarily for the production of pulp and paper. The economic relevance of eucalypts in Brazil and many countries worldwide has stimulated scientific and technological advances, from molecular biology to forestry and wood processing industry. Among the topics of interest in molecular biology are genes and proteins responsible for growth, the quality of wood and the plant response to environmental stress. The Dof (DNA binding with one finger) family of proteins comprehends plant exclusive transcription factors characterized by the presence of the DNA binding Dof domain, which is similar to the zinc finger domain. Dof transcription factors are related to the activation and inhibition of the promoters of genes involved in various plant metabolisms such as endosperm development, carbohydrate metabolism, seed germination, vascular development and response to phytohormones. In this study, we aimed to characterize the Dof transcription factors of E. grandis through phylogenetic analyzes using bioinformatic tools, in addition to RT-qPCR assays to determine the relative expression profiles of E. grandis Dof genes in leaves, stalks and roots of plants under different biotic and abiotic treatments that included ABA, NAA, KIN, NaCl and drought. Phylogenetic analysis allowed the identification of 10 pairs of paralogous genes in the genome of E. grandis, in addition to 13 major clusters and 9 small groups of orthologous genes between E. grandis, Arabidopsis thaliana and Populus trichocarpa, which allowed us to suggest functions for the E. grandis Dof transcription factors. The relative expression profiles showed that the Dof genes are expressed in various organs and display different degrees of mRNA accumulation under different treatments.

O eucalipto é a arbórea mais cultivada no mundo para a exploração comercial de madeira. No Brasil, a principal espécie do gênero Eucalyptus utilizada é E. grandis, cujo cultivo, principalmente de híbridos com outras espécies, é voltado para a produção de celulose e papel. A relevância econômica do eucalipto para o Brasil e para vários países do mundo tem estimulado avanços científicos e tecnológicos, desde a área de biologia molecular até a silvicultura e a indústria de processamento da madeira. Entre os tópicos de interesse em biologia molecular estão genes e proteínas responsáveis pelo crescimento, pela qualidade da madeira e pela resposta vegetal a estresses ambientais. A família de proteínas Dof (DNA binding with one finger) compreende fatores de transcrição exclusivos de plantas, caracterizados pela presença do domínio Dof de ligação ao DNA, que contém uma estrutura semelhante ao domínio “dedo-de-zinco”. Esses fatores estão relacionados à ativação e à inibição de promotores de genes envolvidos nos mais variados fenômenos metabólicos das plantas tais como desenvolvimento do endosperma, metabolismo de carboidratos, germinação de sementes, desenvolvimento vascular e resposta a fitormônios. Pelo presente trabalho, visou-se caracterizar os fatores de transcrição Dof de E. grandis realizando-se análises filogenéticas com ferramentas de bioinformática, além de ensaios de RT-qPCR para se determinar perfis de expressão relativa dos genes Dof de E. grandis em folhas, caules e raízes de plantas sob diferentes tratamentos bióticos e abióticos que incluíram ABA, NAA, KIN, NaCl e seca. As análises filogenéticas permitiram a identificação de dez pares de genes parálogos no genoma de E. grandis, além de 13 grandes clados e nove pequenos grupos de genes ortólogos entre E. grandis, Arabidopsis thaliana e Populus trichocarpa. Os resultados permitiram-nos sugerir funções aos fatores de transcrição Dof de E. grandis. Os perfis de expressão relativa exibidos levaram-nos a concluir que os genes Dof são expressos em diversos órgãos e apresentam diferentes graus de acúmulo de mRNAs sob diferentes tratamentos. / Eucalypt is the most widely cultivated tree in the world for commercial logging. In Brazil, the main species of the Eucalyptus genus used is E. grandis, whose cultivation, mainly done with hybrids, is geared primarily for the production of pulp and paper. The economic relevance of eucalypts in Brazil and many countries worldwide has stimulated scientific and technological advances, from molecular biology to forestry and wood processing industry. Among the topics of interest in molecular biology are genes and proteins responsible for growth, the quality of wood and the plant response to environmental stress. The Dof (DNA binding with one finger) family of proteins comprehends plant exclusive transcription factors characterized by the presence of the DNA binding Dof domain, which is similar to the zinc finger domain. Dof transcription factors are related to the activation and inhibition of the promoters of genes involved in various plant metabolisms such as endosperm development, carbohydrate metabolism, seed germination, vascular development and response to phytohormones. In this study, we aimed to characterize the Dof transcription factors of E. grandis through phylogenetic analyzes using bioinformatic tools, in addition to RT-qPCR assays to determine the relative expression profiles of E. grandis Dof genes in leaves, stalks and roots of plants under different biotic and abiotic treatments that included ABA, NAA, KIN, NaCl and drought. Phylogenetic analysis allowed the identification of 10 pairs of paralogous genes in the genome of E. grandis, in addition to 13 major clusters and 9 small groups of orthologous genes between E. grandis, Arabidopsis thaliana and Populus trichocarpa, which allowed us to suggest functions for the E. grandis Dof transcription factors. The relative expression profiles showed that the Dof genes are expressed in various organs and display different degrees of mRNA accumulation under different treatments.

Orientador : Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T20:11:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arantes_VanessaCristina_M.pdf: 2202517 bytes, checksum: 96df5e7928eb9ee77b90e029f2b8e569 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Em animais, a desnutrição intra-uterina exerce efeitos marcantes sobre o desenvolvimento fetal e pós-natal. Além disso, baixo peso ao nascer está associado à secreção alterada de insulina, resistência à insulina e área diminuída da ilhota pancreática. Neste trabalho, verificamos a expressão do fator de transcrição PD X-I, a área da ilhota e a secreção de insulina em ilhotas de ratos neonatos e recém-desmamados (28 dias de vida), mantidos durante o período fetal e da lactação com uma dieta normoprotéica (17% de proteína) ou hipoprotéica (6% de proteína). Esses parâmetros também foram avaliados em ratos com 28 dias, recuperados da desnutrição intra-uterina. Após o desmame, a secreção de insulina em ilhotas isoladas em resposta 2,8 e 16,7 mmol/L de glicose foi reduzida em ratos desnutridos. Ao nascer e após 28 dias, a área da ilhota e a expressão protéica do PDX-1 também foram diminuídas, enquanto os níveis de mRNA em ilhotas de ratos desnutridos recém desmamados foram semelhantes aos níveis encontrados em ratos controles. A expressão protéica do PDX-1 e a área da ilhota, bem como a secreção de insulina, foram restauradas em ratos recuperados, enquanto o mRNA do PDX-l foi maior do que em ratos controles. Esses resultados sugerem associação entre expressão protéica do PDX-l diminuída, redução no tamanho da ilhota e secreção diminuída de insulina em ratos desnutridos. A reintrodução de dieta normal, logo após o nascimento, restaurou todos os parâmetros avaliados / Abstract: Intra-uterine and early postnatal malnutrition has profound consequences on fetal and postnatal development, both in humans and animals. In addition, low birth weight has been reported to be associated with impaired insulin secretion, insulin resistance and diminished area of pancreatic islets. To assess the expression of the transcription factor pancreatic and duodenal homeobox gene 1 (PDX-l) in pancreatic B-cells, and to examine the islet area and glucose-induced insulin secretion by islets from rats maintained on a low protein diet. PDX-l expression and islet area were assessed in rats maintained on a low (6%) or normal (17%) protein diet during fetal life. PDX-I protein and rnRNA levels, as well as insulin secretion and islet area were also measured after 28 days of life in normal, 10w protein, and recovered rats which received a normal protein diet after birth. Insulin secretion by isolated islets in response to 2.8 and 16.7 mmol glucose/L was reduced in 28-day-old low protein rats (P < 0.0001). At birth and after 28 days of life, the islet area and PDX-l protein expression were also reduced (P < 0.01). In contrast, PDX-l rnRNA levels in islets from 28-day-old low protein rats was similar to normal rats. PDX-l protein expression in B cells, the area of islets and insulin secretion were restored in recovered rats, whereas PDX-l rnRNA was higher than normal rats (P < 0.05). These results suggest a link between diminished PDX-l protein expression, a reduction in islet area and impaired insulin secretion in low protein rats. The reintroduction of a normal diet early in life restored islet area and cell physiology / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular