OBJETIVO: Fructosa 1,6-bisfosfat (F1,6BP) protege los órganos contra gran número de procesos que provocan inflamación. Hipotetizamos que el efecto primario de la F1,6BP es el de prevenir la activación de los macrófagos y la secreción de citoquinas. Nuestra intención fue determinar las dianas tisulares y celulares de este azucar bifosforilado e investigar en profundidad su mecanismo de acción. INTERVENCIONES: La acción protectora de F1,6BP fue analizada en ratas Sprague-Dawley (de entre 200 y 250 gramos de peso corporal) a las cuales se les había inducido hepatitis mediante la inyección de galactosamina (GalN). Los efectos in vivo de la F1,6BP fueron evaluados mediante la determinación de la actividad transaminasa en plasma, la determinación de endotoxinas en plasma y la determinación del factor necrótico de tumoración alfa (TNF-alfa) en plasma y en hígado total en ratas tratadas con GalN. Las dianas de la F1,6BP para reducir la respuesta de los macrófagos al lipopolisacárido (LPS) fueron determinadas mediante el estudio de la correlación entre los cambios en la producción de TNF-alfa y los flujos de potasio a través de la membrana celular en cultivos primarios de células de Kupffer.DETERMINACIONES Y PRINCIPALES RESULTADOS : Los resultados obtenidos in vivo indican que el tratamiento con F1,6BP previene el daño causado por la administración de GalN en células del parénquima hepático. Esta protección se ha asociado principalmente a la reducción en la respuesta inflamatoria. F1,6BP previene la endotoxemia inducida por GalN en rata y ésta correlaciona con la inhibición de la secreción de histamina por parte de los mastocitos peritoneales, evento que precede al incremento de endotoxinas en plasma y de la producción hepática de TNF-alfa. Por otro lado, el tratamiento con F1,6BP reduce la sensibilidad de los macrófagos al LPS, cosa que provoca un descenso en la producción de TNF-alfa. Los resultados in vitro muestran que la F1,6BP inhibe la respuesta y la secreción de TNF-alfa por parte de las células de Kupffer a las que se ha administrado LPS. La F1,6BP previene estos efectos mediante la inhibición de la activación de los canales de potasio por LPS en este modelo celular.CONCLUSIONES: El efecto modulador de los canales de potasio en la adición exógena de F1,6BP explica sus efectos como antihistamínico y antiinflamatorio, cosa que incrementa enormemente el interés terapéutico de este compuesto bifosforilado.

Malgrat els esforços dedicats a investigar la pancreatitis aguda (PA), segueixen sense resposta la major part de les preguntes plantejades fa anys. En particular, encara no es coneixen tots els mecanismes pels que una lesió localitzada en el pàncrees pot induir una afecció en òrgans distants, com el pulmó. Durant els últims anys s’ha pogut establir que l’activació de les cèl•lules inflamatòries juga un paper central en el desenvolupament d’aquesta malaltia. Per una altra banda, els macròfags poden presentar diferents fenotips en funció del tipus d’activació a la que es veuen sotmesos, destacant l’activació clàssica (induïda per INFγ) i l’alternativa (induïda per citocines com IL4, IL13, IL10, glucocorticoids..). Aquests tipus d’activació podrien condicionar la progressió de la pancreatitis cap a formes lleus o severes. En aquesta tesi s’ha avaluat el tipus d’activació que presenten diferents poblacions de macròfags i la seva relació amb la severitat del procés (lleu, moderada o severa). El treball s’ha realitzat a nivell experimental in vivo, utilitzant un model de PA per infusió de sals biliars. També s’ha analitzat la resposta de les diferents poblacions de macròfags als estímuls generats durant la pancreatitis i s’ha treballat sobre aquests macròfags amb la finalitat de modificar la via d’activació que presenten i ,amb això, modular el procés inflamatori sistèmic associat a la PA. La hipòtesi de partida és que el tipus d’activació de les diferents poblacions de macròfags implicats en la pancreatitis aguda condiciona l’evolució i la severitat de la malaltia. Actuant sobre el tipus d’activació de diferents poblacions de macròfags es podria modificar el curs de la malaltia de severa a lleu. Així doncs els objectius concrets d’aquest treball serien: 1. Obtenir i caracteritzar el tipus d’activació presentat per els macròfags peritoneals i pulmonars durant el desenvolupament de la pancreatitis aguda. Correlacionar el tipus d’activació de les diferents poblacions de macròfags amb el grau de severitat de la patologia. 2. Avaluar el paper de les diferents vies de senyalització intracel•lular implicades en el fenotip dels macròfags. 3. Determinar els possibles mediadors implicats en l’activació dels macròfags durant la pancreatitis aguda.

El objetivo de esta Tesis ha consistido en estudiar diversos aspectos de la biología de los macrófagos, células clave en el desarrollo de la respuesta inmunitaria. Los macrófagos se caracterizan por ser células que en los tejidos se encuentran proliferando y manteniendo su viabilidad gracias a la presencia de factores de crecimiento. Sin embargo, cuando reciben un estímulo activador, ya sea el IFN-gamma, principal activador endógeno de los macrófagos o bien el LPS, componente de las bacterias Gram negativas, dejan de proliferar y pasan a activarse y a desarrollar sus funciones características, como son la expresión de citocinas proinflamatorias (como el TNF-alfa Il-1beta, IL-6), la producción de NO o bien la expresión de las moléculas del MHC II. En algunos casos, por ejemplo en ausencia de factores de crecimiento o bien estimulados con LPS, los macrófagos experimentan apoptosis o muerte celular. Este trabajo se ha centrado en estudiar las diferentes vías de señalización que participan en las distintas respuestas de los macrófagos (como proliferación, activación, supervivencia y apoptosis). En este sentido se ha demostrado que la vía de señalización de MEK/ERK es esencial para los procesos de proliferación y activación, aunque lo hace con una cinética distinta. Mientras que estímulos proliferativos generan un pico corto y rápido de activación, estímulos que inducen la activación de los macrófagos como por ejemplo el LPS, la cinética de activación de estas quinasas es más tardía. Esta cinética de activación de ERK diferencial nos permite discernir entre estímulos proliferativos y activadores. Además se ha demostrado que el IFN-gamma, aunque no activa a las quinasas ERK, induce un alargamiento en el tiempo de la activación de estas quinasas a través de la inhibición de la expresión de MKP-1 inducida por factores de crecimiento. El alargamiento de actividad de ERK, inhibe la expresión de c-myc, proteína indispensable para la progresión del ciclo celular y por tanto inhibe la proliferación de los macrófagos. Por otro lado, hemos demostrado que la vía de señalización de PI-3K/AKT es la responsable de la expresión de p21Waf1 y responsable de la respuesta de supervivencia de los macrófagos debida a factores de crecimiento y otros agentes. También hemos visto que la ciclosporina, un inmunosupresor ampliamente utilizado para evitar el rechazo de los transplantes, inhibe la actividad de ERK inducida por el M-CSF lo que produce un bloqueo de la proliferación. Este efecto es independiente de la fosfatasa Calcineurina, principal diana de la ciclosporina.Además, también se ha analizado como el entorno celular puede afectar a las respuestas de proliferación y activación de los macrófagos. Se ha demostrado que un aumento de adhesión producido por la decorina y fibronectina inhibe la proliferación de los macrófagos a través de la expresión de p27Kip1 y la prolongación de la actividad ERK. La decorina aumenta la activación de los macrófagos a través del secuestro del TGF-beta? producido de forma endógena por estas células. Por ultimo el LPS, aunque es un buen activador de los macrófagos, induce apoptosis en determinadas situaciones, por ejemplo cuando dicha estimulación se produce de forma incorrecta, es decir, en ausencia de IFN-gamma o bien debido a dosis elevadas de LPS, responsables del shock séptico. La apoptosis inducida por el LPS se produce a través de dos vías de señalización independientes. Una primera vía mas temprana debida a la secreción autocrina de TNF-alfa y una segunda vía mas tardía, basada en la producción de NO. La apoptosis de los macrófagos inducida por el LPS se da principalmente a través de la producción de TNF-alfa que esta regulada mayoritariamente por PKC-epsilon a través de la modulación de la actividad JNK.

Los macrófagos son células fagocíticas pertenecientes al sistema inmunitario que participan tanto en la respuesta innata como en la adaptativa. En presencia de M-CSF, su estímulo mitogénico específico, proliferan, mientras que el tratamiento con estímulos activadores como el IFN-γ o el LPS hace que detengan su proliferación, se activen y pasen así a ejercer sus funciones específicas. En este contexto, existen dos tipos de citocinas con capacidad de activar al macrófago, las llamadas citocinas de tipo Th1 y las de tipo Th2. Las citocinas de tipo Th1 como el IFN-γ inducen en los macrófagos un patrón de activación llamado "clásico" cuya finalidad es provocar una respuesta de tipo proinflamatoria que acabará por eliminar la presencia de agentes patógenos. Por el contrario, las citocinas de tipo Th2 como la IL-4 inducen una activación "alternativa" en los macrófagos, cuya finalidad es la de llevar a cabo la reparación y remodelación tisular tras la respuesta proinflamatoria. En este estudio hemos observado, por primera vez, que la activación alternativa del macrófago cumple también la dicotomía proliferación/activación observada bajo estímulos clásicos e inhibe la proliferación del macrófago en el umbral entre las fases G1 y S del ciclo celular. En este sentido, hemos visto que tanto el IFN-γ como la IL-4 inducen un alargamiento en el tiempo de la cinética de activación de la MAPK ERK-1/2, encargada de regular la proliferación del macrófago en respuesta al M-CSF. Esta MAPK es regulada por la fosfatasa MKP-,1 quien se encarga de defosforilarla. Así, en presencia del M-CSF, MKP-1 se induce para regular a ERK-1/2 mientras que el IFN-γ y la IL-4 bloquean su expresión de forma dependiente de STAT. La inhibición directa de MKP-1 mediante tecnología de RNA de interferencia induce también un alargamiento de la actividad de ERK-1/2 y, en consecuencia, una parada de la proliferación, corroborando así los resultados obtenidos previamente. También hemos analizado el estado de activación de los complejos cdk2/cicE, encargados de la progresión del ciclo celular entre las fases G1 y S. Hemos visto que, mientras que el M-CSF induce la expresión de la ciclina E y, en consecuencia, la activación del complejo cdk2/cicE, tanto el IFN-γ como la IL-4 inhiben a ambos, explicando así el mecanismo utilizado por estas citocinas para mantener la parada en G1. Este bloqueo de la actividad cdk2/cicE es llevado a cabo gracias a la acción del inhibidor de cdk p21Waf1. Sin embargo, aunque ambas citocinas inducen la expresión de esta proteína, utilizando células knockout para p21Waf1 hemos demostrado que sólo la parada inducida por la IL-4 es dependiente de esta proteína, lo cual sugiere que el IFN-γ y la IL-4 utilizan vías de señalización distintas para ejercer funciones celulares similares. Por otro lado, hemos analizado también la implicación de la vía de las MAPK en la activación alternativa del macrófago. En este aspecto hemos demostrado que, aunque la expresión de los principales genes responsables de dicha activación es dependiente de STAT6, la acción de JNK1 ejerce un efecto sinérgico sobre su inducción, ya que la inhibición de esta quinasa resulta en una disminución de la expresión de dichos genes. El mecanismo mediante el cual JNK1 ejerce esta función no está aún del todo claro. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante ensayos de inmunoprecipitacion de cromatina sugieren que JNK1 podría estar fosforilando a determinados cofactores en las zonas promotoras de algunos genes, colaborando así con la actividad del factor de transcripción STAT6. / Macrophages play a crucial role as regulators of immune response. They are originated from bone marrow stem cells and, in response of growth factors and particularly to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), they proliferate and differentiate. We have previously observed that activation of extracellularly regulated kinase (ERK) 1/2 is required for macrophage proliferation in response to growth factors. A short and early pattern of ERK activity correlated with the proliferative response. In contrast, slightly prolonged patterns of activity of these kinases were induced by signals that lead to macrophage activation and growth arrest. IFN-γ is the main endogenous Th1 type macrophage activator and IL-4 is the main Th2 type one. While M-CSF withdrawal arrested the cell cycle at early G1, treatment of macrophages with IFN-γ or IL-4 stopped the cell cycle later, at the G1/S boundary. IFN-γ and IL-4 induced the expression of the Cdk inhibitor p21Waf1. Using knockout mice and siRNA experiments, we found that p21Waf1 is required for IL-4- but not for IFN-γ-dependent inhibition of proliferation. Moreover, both IFN-γ and IL-4 elongate the activity pattern of the MAPK ERK-1/2 through the inhibition of the phosphatase MKP-1, which in fact results in a decrease of proliferation. Moreover, inhibition of MKP-1 expression using siRNA technology or synthetic inhibitors also led to elongated ERK activity and significant blockage of M-CSF-dependent proliferation. On the other hand, we have also analyzed the relationship between IL-4 and the MAPK pathway on the context of the alternative activation of macrophages. The IL-4 signaling pathway involves activation of STAT-6. However, IL-4 has also the capability to activate members of the MAPK family. In primary bone marrow-derived macrophages, we have observed strong activation of JNK-1 at early time points of IL-4 stimulation, whereas weak activation of ERK-1/2 and p38 were detected at a more delayed stage. By using selective inhibitors and knockout models, we have explored the contributions of MAPK activation to the macrophage response to IL-4. Our findings indicate that JNK-1 regulate IL-4-mediated expression of genes typically involved in alternative activation such as arginase 1.

Con frecuencia, la evolución de la cirrosis hepática está asociada a la aparición de transtornos cardiovasculares, caracterizados por la presencia de hipertensión portal, aumento del gasto cardíaco, disminución de la presión arterial media, hiperemia y disminución de las resistencias vasculares periféricas, siendo este último hecho especialmente marcado en el área esplácnica. La aparición de estas alteraciones vasculares tiene como consecuencia la acumulación de líquido ascítico en la cavidad peritoneal. La aparición de ascitis en la cirrosis está asociada a un mal pronóstico, debido tanto a que su aparición implica una mayor desestabilización de la hemodinámica esplácnica y sistémica, como a la facilidad con que es colonizada por bacterias en ausencia de fuentes de infección aparentes, dando lugar a peritonitis bacteriana espontánea (PBE), o a alteraciones en la función pulmonar y oxigenación tisular. Los macrófagos son células especialmente reactivas a estímulos como la presencia de bacterias y sus derivados, a citoquinas proinflamatorias, o a la hipoxia, en respuesta a los cuales pueden producir sustancias con capacidad vasoactiva. Por esta razón, la hipótesis de esta tesis es que los macrófagos residentes en la cavidad esplácnica de los pacientes cirróticos podrían estar produciendo sustancias vasoactivas que actuarían en la vasculatura esplácnica contribuyendo a las alteraciones circulatorias que tienen lugar en esta zona en la cirrosis hepática. El estudio se realizó en macrófagos peritoneales aislados a partir de líquido ascítico de pacientes cirróticos. Estas células fueron mantenidas en condiciones estándar de cultivo durante 48 horas, y en ellas se determinó la síntesis de los factores vasoactivos factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), adrenomedulina (ADM) y endotelina (ET), a nivel de RNA y de proteína, de manera constitutiva y tras la estimulación con las citoquinas proinflamatorias TNF-alfa e IL1-beta, y LPS, o hipoxia (5% O2), así como en macrófagos de pacientes con PBE.Los resultados indican que los macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos sintetizan de manera constitutiva los factores vasodilatadores y proangiogénicos VEGF y ADM, pero no ET (vasoconstrictor), y que esta síntesis es característica de células residentes, ya que no tiene lugar en monocitos de pacientes cirróticos o individuos sanos. Además, la síntesis de VEGF puede ser estimulada in vitro tras la incubación con TNF-alfa, IL1-beta o LPS -solos o en combinación-, mediante un incremento en la transcripción génica de VEGF y en la estabilidad del RNA mensajero. Como las concentraciones de TNF-alfa, IL1-beta y LPS aumentan de manera local en la cavidad esplácnica durante la PBE, a continuación comparamos la síntesis de VEGF por macrófagos aislados de líquido ascítico de pacientes con y sin PBE. De manera espontánea, los macrófagos de pacientes con PBE sintetizan más VEGF que los de pacientes sin infección. Por otro lado, la hipoxia incrementa el RNA mensajero y la síntesis de VEGF y ADM, pero no de ET, por macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos. Este incremento podría estar mediado por el factor de transcripción inducible por hipoxia 1 (HIF1), que es estabilizado en macrófagos en la tensión de oxígeno utilizada (5% O2). Por último, la síntesis de estos mediadores vasoactivos por macrófagos causa proliferación y producción de óxido nítrico en cultivos de células endoteliales, lo que de manera conjunta a la detección de RNA mensajero de los receptores tirosina quinasa de VEGF (KDR y Flt1) en biopsias peritoneales de pacientes cirróticos, sugiere que la síntesis de mediadores vasoactivos por macrófagos peritoneales de pacientes cirróticos podría tener efectos in vivo, contribuyendo de manera local a las alteraciones circulatorias que tienen lugar en la vasculatura esplácnica.

The focus of this work was to functionally characterize the CD300e receptor expressed in human monocytes and myeloid dendritic cells and investigate the implications that receptor engagement has on their biology. We provide evidence formally supporting that CD300e functions as an activating receptor capable of regulating the innate immune response by triggering various pro- inflammatory functions including intracellular calcium mobilization, superoxide anion production, pro-inflammatory cytokine release and up-regulation of co-stimulatory molecules in myeloid cells. We also report that ligation of CD300e on the surface of monocytes results in their differentiation to functional MΦ2-like macrophages by an autocrine mechanism that involves M-CSF and its receptor (CD115). / L'objectiu d'aquest treball ha estat caracteritzar funcionalment el receptor CD300e expressat en monòcits i cèl·lules dendrítiques mieloides humanes, així com investigar les implicacions que l'activació d'aquest receptor pot tenir en la seva biologia. Demostrem formalment que el receptor CD300e funciona com un receptor activador capaç de regular la resposta immune innata activant diverses funcions proinflamatòries, incloent la mobilització de calci intracel·lular, la producció d'anió superòxid, la secreció de citocines proinflamatòries i la inducció de molècules coestimuladores en cèl·lules mieloides. També descrivim que l'activació del receptor CD300e a la superfície dels monòcits provoca la seva diferenciació cap a macròfags funcionals del tipus MΦ2 gràcies a un mecanisme autocrí que funciona a través del M-CSF i el seu receptor (CD115).