L'aterosclerosi és una malaltia progressiva que es caracteritza per una acumulació de lípids en el subentoteli vascular. Evidències observacionals suggereixen que la peroxidació lipídica, la resposta inflamatòria i els processos trombogènics tenen un paper important en la patogènesi de l'aterosclerosi i les seves complicacions clíniques. Diversos estudis han demostrat l'existència de LDL oxidades, d'alguns dels seus components oxidats, de nivells elevats de citocines proinflamatòries i del principal inductor de la trombosi, el factor tissular, en plasma de pacients d'alt risc cardiovascular i en plaques ateroscleròtiques humanes on també s'ha observat acumulació de cèl·lules inflamatòries. Malgrat aquests coneixements no es disposa d'evidències directes que relacionin la peroxidació lipídica amb la inflamació. Un fet remarcable en aquest àmbit és el potencial del PPAR en l'aterosclerosi. El PPAR és un receptor nuclear diana de les tiazolidinadiones, fàrmacs utilitzats en el tractament de la diabetis mellitus tipus 2. Aquests fàrmacs mostren un efecte global antiateroscleròtic en models animals d'aterosclerosi i en estudis clínics amb humans. A nivell in vitro s'ha demostrat que aquests fàrmacs poden tenir un paper antiinflamatori important. A més, PPAR s'expressa de forma elevada en plaques ateroscleròtiques on colocalitza amb lípids oxidats. Recentment s'ha suggerit que la LDL oxidada podria ser una font de lligands endògens del PPAR tot i que encara no s'han establert. Els estudis que es presenten en aquesta tesi doctoral engloben nous coneixements de la peroxidació lipídica en la patogènesi de l'aterosclerosi i en concret en la inflamació i la trombosi. I donen suport a la teoria que la modificació oxidativa dels lípids té un paper important en la progressió de la malaltia aterotrombòtica. Els resultats que s'exposen en aquesta tesi doctoral demostren que el 2,4-decadienal, un aldehid apolar producte final de l'oxidació dels àcids grassos poliinsaturats majoritaris de les LDL, contribueix a la coneguda citotoxicitat de la LDL oxidada en cèl·lules musculars llises humanes. L'efecte citotòxic observat no és promogut per apoptosi cel·lular donat que no es produeix la fragmentació del DNA característica d'un estat apoptòtic. El 2,4-decadienal i l'hexanal, un altre aldehid apolar, a concentracions no citotòxiques aturen el creixement cel·lular i disminueixen els nivells de mRNA dels gens p53 i c-myc que estan involucrats en la regulació de l'apoptosi. Aquests resultats suggereixen que la citotoxicitat dels aldehids podria explicar-se per un fenomen de necrosi cel·lular. D'altra banda ambdós aldehids augmenten els nivells de mRNA i de proteïna del factor tissular. Nosaltres suggerim que aquest efecte podria ser a través de l'activació del factor de transcripció AP-1 format pel complex cFos-cJun prèvia síntesi de novo de c-Fos. Aquest efecte es reverteix amb un tractament previ amb simvastatina, un fàrmac hipolipemiant amb propietats antioxidants i antitrombòtiques. Pel que fa a la implicació de PPAR en l'aterosclerosi, 1) hem identificat dos elements de resposta PPAR en el promotor del gen del TNF humà que suggereixen una implicació directa de PPAR en la inflamació. Aquest estudi aporta més dades al coneixement del mecanisme d'acció de les tiazolidinadiones i descriu una nova via de modulació de l'expressió del TNF; 2) proposem el 2,4-decadienal com a candidat a mediador de PPAR en la placa d'ateroma donat que els resultats obtinguts demostren que activa PPAR. Augmenta la translocació de PPAR del citosol al nucli i augmenta la transcripció regulada per PPAR; 3) aportem evidències que descartarien l'efecte proateroscleròtic (augment de CD36) no desitjable de les tiazolidinadiones en pacients diabètics tipus 2. Aquests pacients tenen nivells elevats d'àcids grassos lliures circulants i les dades obtingudes demostren que la darglitazona, una tiazolidinadiona, en presència d'àcids grassos lliures no altera l'expressió de CD36 ni en monòcits ni en macròfags humans i no modifica el contingut lipídic dels macròfags. / Atherosclerosis is a progressive disease characterized by an accumulation of lipids in the subendothelial wall. Experimental evidence suggest that lipid peroxidation, inflammatory response and thrombogenic processes play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis and its clinical complications. Oxidized LDL particles, some of their oxidative compounds, elevated levels of proinflammatory cytokines and tissue factor (the main inducer of thrombosis) have been detected in plasma of patients with high cardiovascular risk. It has also been reported the presence of all these components in human atherosclerotic plaques where also has been observed an accumulation of inflammatory cells. However, no direct evidence exist about a direct relation between lipid peroxidation and inflammation. A recent interesting finding is the possible role of PPAR in atherosclerosis. PPAR is the nuclear receptor target of thiazolidinediones, drugs used in the treatment of non insulin dependent diabetes mellitus. These drugs have shown a net antiatherosclerotic effect in animal models and in clinical studies in humans. In vitro experiments have shown that thiazolidinediones may have an important antiinflammatory action. PPAR is overexpressed in atherosclerotic plaques where colocalizes with oxidized lipids. Recently, oxidized LDL has been pointed as an important source of PPAR ligands.The work presented in this thesis shows new knowledge of the lipid peroxidation role in the pathogenesis of atherosclerosis emphasized in the action on inflammation and thrombosis. In summary, the obtained results support the theory that lipid oxidative modification plays an important role in the progression of atherothrombotic disease.Results show that the apolar aldehyde 2,4-decadienal, an end product of the oxidation of the main polyunsaturated fatty acids present in LDL, contributes to the well-known toxicity of oxidized LDL in human smooth muscle cells. The cytotoxic effect observed may not be promoted by an apoptotic state because the characteristic DNA ladder is not induced. 2,4-decadienal and hexanal, another apolar aldehyde, at non cytotoxic concentrations produce cell growth arrest and decrease p53 and c-myc mRNA levels, genes involved in the regulation of apoptosis. These results suggest that the cytotoxicity of aldehydes may be explained by cell necrosis.On the other hand, both aldehydes increase tissue factor mRNA and protein levels. We suggest that this effect may be produced through the activation of the transcription factor AP-1 formed by the complex cFos-cJun and by previous synthesis of c-Fos. This effect is prevented by a pretreatment with simvastatin, a hypolipidemic drug with antioxidant and antithrombotic properties.Concerning PPAR implication in atherosclerosis, 1) we have identified two PPAR response like elements in the human TNF promoter which suggest a direct link between PPAR and inflammation. This study adds more data in the knowledge of the mechanism of action of thiazolidinediones and describes a new pathway to modulate TNFexpression; 2) we propose that 2,4-decadienal may be a PPAR mediator in the atheromatous plaque based on our results that show PPAR activation by 2,4-decadienal. 2,4-decadienal increases PPAR translocation from the citosol to the nucleus and increases the transcription regulated by PPAR; 3) we also show evidence that the non desirable proatherosclerotic effect (CD36 induction) of thiazolidinediones would not be produced in type 2 diabetic patients. These patients have high levels of circulating fatty acids and our results show that darglitazone, a thiazolidinedione, in the presence of fatty acids neither alters CD36 expression in human monocytes and macrophages nor modifies macrophage lipid content.

La resposta inflamatòria consisteix en l'activació de mecanismes humorals i cel·lulars en resposta a un estímul, amb l'objectiu de limitar-ne els potencials efectes nocius. Quan l'estímul que desencadena la resposta és la presència d'un microorganisme viable o bé els seus productes, els mecanismes de defensa poden autolimitar-ne els efectes i confinar la infecció a un òrgan o fins i tot eradicar-la o bé, si falla aquesta contenció, pot persistir i evolucionar donant lloc a l'alliberament de múltiples mitjancers al torrent circulatori, produint una resposta inflamatòria sistèmica i fallida orgànica. En la inflamació intervenen factors dependents del microorganisme i factors dependents de l'hostatger, donant lloc a les diverses manifestacions clíniques. Disposar de marcadors que permetin mesurar el grau de resposta inflamatòria ha de permetre instaurar les mesures terapèutiques més adequades a cada situació, amb especial èmfasi al desenvolupament de tractaments immunomoduladors, actuant de forma complementària a l'administració d'agents antimicrobians i mesures de suport. Els objectius d'aquesta Tesi han estat, d'una banda, avaluar la utilitat de la determinació de diversos marcadors d'inflamació per al diagnòstic i monitorització de diverses síndromes clíniques d'origen infecciós. D'altra banda, des del punt de vista del microorganisme, es descriuen dues noves molècules amb funcions antiinflamatòries d'origen estafilocòccic, que actuen interferint en la resposta immunitària innata. Els resultats mostren que els marcadors reflecteixen el grau de resposta inflamatòria i varien en funció de l'etiologia, l'edat, la severitat i el temps d'evolució de la infecció. Cal contextualitzar la utilitat de cada marcador a la localització de la infecció, la situació clínica i la presència de comorbilitats. La procalcitonina (PCT) es mostra superior a la proteïna C reactiva (PCR) per distingir entre infecció bacteriana i infecció vírica, i també entre infeccions bacterianes i causes no infeccioses d'inflamació, aportant informació sobre l'etiologia però també sobre la resposta inflamatòria de l'hostatger. Com a limitacions, la PCT no augmenta, o només discretament, quan la infecció es troba confinada a un òrgan, sense manifestacions sistèmiques. En aquesta situació, la PCR aportaria més informació. Tampoc no és útil en la monitorització de les infeccions víriques. En aquests casos, la neopterina i/o la PCR podrien resultar complementàries. L'ús de marcadors no ha de substituir mai un correcte diagnòstic i seguiment clínic i microbiològic, però pot aportar una més completa informació diagnòstica i pronòstica obrint fins i tot noves opcions terapèutiques quant a la utilització de tractaments immunomoduladors. És probable que l'òptima rendibilitat s'obtingui amb l'adequada combinació de marcadors, tenint en compte els avantatges i limitacions de cadascun, a més de la utilització de determinacions seriades en funció de la seva cinètica. D'altra banda s'han caracteritzat dues noves molècules estafilocòcciques que presenten cert grau d'homologia amb la prèviament descrita CHIPS (Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus). Els resultats obtinguts mostren que la proteïna excretada FPR-like 1 Inhibitory protein (FLIPr) actua bloquejant el receptor de pèptids formilats FPRL1. La troballa de FLIPr com a antagonista d'aquest receptor és de gran importància clínica per la seva potencial intervenció en la patogènesi de la malaltia estafilocòccica. FPRL1 és, a més, el receptor de diverses molècules implicades en la resposta inflamatòria i en processos patològics de la importància de l'amiloidosi sistèmica, la malaltia d'Alzheimer o la malaltia priònica. La segona proteïna, que s'ha anomenat FLIPr-like, actua bloquejant tant FPR com FPRL1. El millor coneixement dels mecanismes d'evasió del sistema immunitari a càrrec de microorganismes prototipus com Staphylococcus aureus ha de permetre un també millor coneixement dels fonaments de la patogenicitat bacteriana, la immunitat innata i les possibles vies d'intervenció. L'estudi coordinat de factors dependents del microorganisme i la resposta inflamatòria generada per l'hostatger ha de donar lloc a la major comprensió de les complexes interaccions entre ambdós que donen lloc a la malaltia infecciosa i en condicionen les seves manifestacions i pronòstic. / Inflammatory response involves the activation of multiple humoral and cellular mechanisms in response to a stimulus, with the objective of limiting its noxious effects. When the inflammatory response is stimulated by a viable microorganism or its products, the immune system may limit its effects and confine the infection to an organ or even eradicate it. If the contention falls, the response may persist and evolve to systemic inflammation and organ failure by the liberation of multiple mediators to the circulatory system. Inflammatory response involves factors depending of the microorganism and factors depending of the host, leading to several clinical symptoms. The measurement of biomarkers should allow to measure the degree of inflammatory response. The knowledge of the inflammatory "status" should allow the development and use of immunomodulatory therapies, complementary to antimicrobial agents and supportive therapy. The aims of this Thesis were, first of all, to evaluate the utility of the measurement of several inflammatory mediators for the diagnosis and follow-up of several infectious clinical syndromes. On the other hand, from the point of view of the microorganism, two new antiinflamatory molecules secreted by Staphylococcus aureus are described. Both molecules interfere with innate immune response. The results show that the evaluated biomarkers reflect the degree of inflammatory response and vary depending on etiology, age, severity and time of evolution of the infection. The utility of every biomarker has to be contextualized depending on the localization of infection, the clinical setting and the presence of comorbidities. Procalcitonin (PCT) shows better sensitivity and specificity than C reactive protein (CRP) in distinguishing between bacterial and viral infection and also between bacterial infection and inflammation of non infectious origin, giving information about the inflammatory response of the host. As limitations, PCT does not increase, or only slightly, when the infection is confined to an organ, without systemic involvement. In this situation, CRP may give more information. PCT is also not useful in the follow-up of viral infections. In those cases, CRP and/or neopterin may be complementary. The use of inflammatory markers does not aim to substitute an adequate clinical and microbiological diagnosis but may offer a more complete diagnostic and prognostic information, leading to the development of new therapeutical options such as immunomodulatory treatments. The optimal reliability may be obtained by the right combination of biomarkers, taking in account the advantages and limitations of each. The measurement of seriated samples according to the kinetics of every biomarker is also useful. On the other hand, two new staphylococcal molecules have been characterized. They both have some homology with the previously described CHIPS (Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus). The obtained results show that the excreted protein FPR-like 1 Inhibitory protein (FLIPr) acts blockading the formylated peptide receptor FPRL1. The finding of FLIPr as an antagonist of this receptor is of clinical importance because of its potential intervention in the pathogenesis of staphylococcal diseases. Furthermore, FPRL1 is the receptor of several molecules involved in the inflammatory response and in pathological processes as important as systemic amiloidosis, Alzheimer disease or prion diseases. The second protein, that has been called FLIPr-like, acts blockading both FPR and FPRL1. The better knowledge of immune evasion mechanisms by prototype microorganisms such as Staphylococcus aureus has to allow a better knowledge of the basis of bacterial pathogenicity, innate immunity and the potential ways of intervention. The coordinate study of factors depending of the microorganism and the inflammatory response generated by the host should lead to a better understanding of the complex interactions between a pathogen and its host, that lead to an infectious disease and condition its clinical presentation and prognosis.

El síndrome de Cushing (SC) endógeno es una entidad muy rara ocasionada por un incremento en las concentraciones sanguíneas de cortisol. Es bien conocido que en la fase activa de la enfermedad existe una composición corporal anómala, con un aumento de la grasa principalmente de distribución central y disminución de la masa ósea, y componentes del llamado síndrome metabólico, como hipertensión arterial, dislipemia, diabetes o intolerancia a la glucosa, componentes todos ellos que se asocian con un incremento del riesgo cardiovascular. En un estudio relativamente reciente se muestra que, a pesar de la curación del hipercorticismo, puede persistir un aumento del riesgo cardiovascular hasta 5 años después de la curación. Pero poco se conoce sobre la composición corporal y el riesgo cardiovascular en pacientes con SC tras curación a largo plazo. Los estudios que conforman esta tesis demuestran que, a pesar de una media de 11 años de curación hormonal, los pacientes con SC persisten con una serie de alteraciones similares a las de la fase activa de la enfermedad: a) Persistencia de una composición corporal anómala, con aumento de la masa grasa principalmente abdominal y disminución de la masa y densidad mineral óseas; b) Persistencia de un patrón anómalo en la secreción de adipoquinas, con un aumento de moléculas con actividad inflamatoria como la IL-6 y el TNFα, y una disminución de la adiponectina, molécula de actividad antiinflamatoria; este perfil desfavorable condicionaría una situación de inflamación crónica de bajo grado, que provocaría daño vascular, aterosclerosis y enfermedad cardiovascular; c) Persistencia de alteraciones metabólicas, como la hipertensión arterial, insulinoresistencia y aumento de los niveles de aproproteína B; d) No sólo el hipercortisolismo endógeno tiene efectos negativos sobre la composición corporal, sino también el tratamiento sustitutivo con glucocorticoides exógenos (en concreto, efectos negativos sobre el hueso), tratamiento que en muchas ocasiones se debe administrar a estos pacientes cuando la cirugía ha sido un éxito. Todos estos hallazgos hacen que tengamos que considerar al SC, aunque curado, como una situación de elevado riesgo cardiovascular. / Endogenous Cushing´s síndrome (CS) is a rare endocrine disease due to cortisol hypersecretion. Abnormal body composition (increased total and trunk fat mass and reduced bone mass) is characteristic of active CS, as well as hypertension, dyslipidemia, diabetes and impaired glucose tolerance. All are criteria of the metabolic syndrome which is associated with an increased cardiovascular risk. Persistence of increased cardiovascular risk has been reported in patients with CS after 5 years of cure. However, little is known about body composition and cardiovascular risk after long-term recovery of CS. The studies of this thesis have shown that, despite 11 years of hormonal cure, patients with CS persisted with morbidity, as in the active phase of the disease: a) Persistence of abnormal body composition, favoring central fat accumulation and reducing bone mass and bone mineral density; b) Persistence of an unfavorable adipokine profile, including elevated plasma IL-6 and TNFα and low adiponectin, leading to a state of low-grade inflammation; this "inflammatory state" may determine vascular damage which may contribute to atherosclerosis and cardiovascular disease in patients with long-term cured CS; c) Persistence of hypertension, insulin resistance and elevation of apoprotein B; d) Duration of both endogenous hypercortisolism and exogenous glucocorticoid replacement therapy after successful surgery have been shown to negatively affect bone. In conclusion, having suffered CS, even if hypercortisolism is controlled confers an increase in cardiovascular risk.

El objetivo de esta tesis ha sido estudiar y analizar las modificaciones estructurales, mecánicas y funcionales que se producen en un proceso inflamatorio en general y en concreto en un episodio de isquemia cerebral.El trabajo realizado se compone de dos partes: i) estudio del efecto de un proceso de isquemia-reperfusión sobre las propiedades estructurales, mecánicas y miogénicas en la arteria cerebral media de rata. ii) estudio mediante un modelo "in vitro" de inflamación que consiste en la incubación de las arterias en medio de cultivo con una de las citoquinas (IL-1ß) que se sobrexpresan después de un período de isquemia-reperfusión, sobre las propiedades estructurales, mecánicas y funcionales de la arteria mesentérica de resistencia de rata.El proceso de isquemia (90 minutos)-reperfusión (24 horas) produjo los siguientes cambios en la arteria cerebral media: 1) disminución importante del tono miogénico acompañado por un aumento en la producción de aniones superóxido 2) incremento en el tamaño de la pared vascular debido al aumento en el número de células adventicias 3) aumento en el tamaño de las fenestras de la lámina elástica interna, hecho que podría asociarse al aumento en la elasticidad intrínseca observado en estas arterias 4) disminución del estrés de la pared como consecuencia del aumento en el tamaño de la misma 5) este proceso también modificó aunque con menor intensidad, algunos de los parámetros estructurales analizados en arterias del lado contralateral . Estos cambios, se deban probablemente a alteraciones sistémicas consecuencia de la isquemia focal.La incubación de las arterias mesentéricas de resistencia en medio de cultivo con IL-1ß durante 14 horas: 1) no modificó ni la estructura ni la mecánica de la pared arterial 2) empeoró las relajaciones dependientes de óxido nítrico sin afectar a la capacidad vasorelajadora general del vaso. El empeoramiento de la relajación parece ser debido, al menos en parte, a una disminución en la biodisponibilidad del óxido nítrico 3) aumentó la producción de anión superóxido en la pared vascular que parecería estar sintetizado principalmente por la xantina oxidasa. Los aniones superóxido producidos por acción de la xantina oxidasa serían los principales responsables de la disminución en la biodisponibilidad del óxido nítrico, que a su vez sería el responsable de la disminución de las respuestas relajantes mediadas por óxido nítrico.Estos resultados indicarían que la arteria cerebral media sufre una serie de cambios provocados por el proceso de isquemia-reperfusión que permitirían a estas arterias adaptarse a los cambios en el flujo sanguíneo necesarios para reducir el daño neuronal, mejorando la irrigación del cerebro después de un episodio de isquemia-reperfusión. El efecto de las citoquinas durante este período podría también afectar a las respuestas funcionales de las arterias debido al aumento en la producción de anión superóxido observado en esta patología. Las aportaciones de estos estudios podrían en un futuro abrir líneas de investigación que podrían contribuir al diseño de nuevos fármacos con capacidad para prevenir episodios de isquemia cerebral. / The aim of the present study has been to analyse the structural, mechanical and functional alterations that take place in an inflammatory process as cerebral ischaemia.Our results are divided in two parts: i) a study of the effect of ischaemia-reperfusion on structural, mechanical and myogenic properties of rat middle cerebral artery and ii) to analyze, using an in vitro model of inflammation, the effect of incubation with IL-1ß, one of several cytokines that is overexpressed after a period of ischemia-reperfusion, on structural mechanical and functional properties of rat mesenteric resistance arteries. The occlusion of the right middle cerebral artery (90 minuts) following 24 hours of reperfusion produced: 1) a decrease of myogenic tone together with an increase in superoxide anion production 2) an enlargement of the vascular wall due to the increase in the total number of adventitial cells 3) an enlargement of fenestrae area of the internal elastic lamina that was associated with the increase on intrinsic elasticity observed in these arteries 4) a diminished wall stress as a result of the increase in the wall thickness 5) ischaemia-reperfusion also modified although to a lesser degree, some of the structural parameters in arteries from the contralateral side of ischemia. These changes observed in the contralateral side could likely be associated to systemic alterations produced as a consequence of focal ischaemia. Fourteen hours incubation of mesenteric resistance arteries in culture medium with IL-1ß: 1) did not modify either the structure or the mechanics of the arterial wall; 2) impaired nitric oxide dependent relaxation without affecting the vasodilatation capacity of the arteries. The impairment of nitric oxide induced relaxation by IL-1ß could be due to a decrease on nitric oxide availability; 3) increased superoxide anion production in the vascular wall that seems to be mainly synthesized by xanthine oxidase. The superoxide anion produced by xanthine oxidase would play a role in decreasing nitric oxide availability, which in turn would diminish vasodilatation mediated by nitric oxide. These results suggest that the middle cerebral artery undergoes multiple changes caused by ischaemia-reperfusion that will allow these arteries to adapt to the blood flow alterations needed to reduce the neural damage, improving brain blood flow. Cytokines could affect functional responses of the arteries due to the increase in superoxide anion production observed in this pathology. In the future, this study could open new research that could contribute to the design of new drugs with potential interest to prevent cerebral ischaemia episodes.

Los opioides se utilizan en el tratamiento del dolor osteoarticular crónico, pero se desconocen las características de aparición de tolerancia a sus efectos durante estos procesos. Postulamos que la inflamación puede alterar la aparición / desarrollo de tolerancia opioide ya que se inducen cambios en la transmisión nociceptiva y en la expresión de receptores opioides. METODOLOGÍA: En un modelo de monoartritis producida por adyuvante de Freund (CFA) en ratones control y tolerantes (con la implantación de un comprimido s.c. de morfina), se evaluaron: peso corporal, diámetro de la articulación, respuesta nociceptiva a estímulos térmicos (plantar test) y mecánicos (Randall y Selitto, Von Frey), extravasación de plasma y tránsito intestinal. También se estudiaron los efectos de la administración sistémica de morfina y la reversión por naloxona y naloxona metiodada. Finalmente se estudió la expresión de receptores opioides m en tejidos periféricos (plantar, ganglios de la raíz dorsal y médula espinal) mediante Western Blot.RESULTADOS: El CFA indujo una inflamación localizada, cuantificable entre las 4 horas y los 14 días. El efecto anti-nociceptivo y anti-inflamatorio de la morfina fue significativamente mayor en presencia de inflamación (x2), sin modificar el efecto anti-alodínico. La implantación de un comprimido de morfina produjo una disminución de la sensibilidad nociceptiva a los estímulos térmicos y mecánicos, induciendo tolerancia opioide a los efectos anti-nociceptivos y anti-inflamatorios de la morfina. Asimismo en presencia de inflamación el desarrollo de tolerancia fue mayor. Los resultados de conducta obtenidos se relacionaron con los obtenidos a nivel molecular. La inflamación periférica aumentó la expresión de receptores opioides, y en presencia de tolerancia a la morfina los resultados sugirieron la no-funcionalidad de estos receptores. / Opioids are clinically used in the management of chronic osteoarticular pains, but tolerance to analgesia has not been reported. The aim of our study was to characterise morphine tolerance in a mice model of monoarthritis that mimics the clinical condition. We postulate that inflammation could alter the development of opioid tolerance, because of the changes induced in the nociceptive transmission and opioid-receptor expression.METHODS: Inflammation was induced by the subplantar injection of Freund's adjuvant (CFA) in control and tolerant mice (tolerance was induced by the subcutaneous implantation of a 75-mg morphine pellet). We assessed changes in body weight, paw diametre, nocicpetive response to thermic (plantar test) and mechanic (Randall & Selitto, Von Frey) estimoulous, plasma extravasation and gastrointestinal transit. We also studied the anti-hyperalgesic (thermal, mechanical), anti-allodynic and anti-extravasation effects of morphine and its reversibility with morphine antagonists (naloxone), and the expression of m opioid receptors (western blot) in paw tissue, dorsal root ganglia and spinal cord. RESULTS: CFA-inflammation induced a localised inflammation, from 4 hours to 14 days since the injection of CFA. Inflammation increased the anti-nociceptive and anti-inflammatory effects of acute morphine (x2), without modify the anti-allodynic effects. The implantation of a morphine pellet decreased nociceptive sensibility, inducing tolerance to anti-nociceptive and anti-inflammatory effects, demonstrating tolerance. Inflammation and sustained exposure (pellet) to morphine, each individually, similarly increased m opioid receptor levels in all tissues tested; in the paw, opioid receptors expression was further enhanced in the presence of inflammation plus tolerance. The results suggested an up-regulation of non-functional m opioid receptors in tolerant mice, with and without inflammation.

OBJETIVO: Fructosa 1,6-bisfosfat (F1,6BP) protege los órganos contra gran número de procesos que provocan inflamación. Hipotetizamos que el efecto primario de la F1,6BP es el de prevenir la activación de los macrófagos y la secreción de citoquinas. Nuestra intención fue determinar las dianas tisulares y celulares de este azucar bifosforilado e investigar en profundidad su mecanismo de acción. INTERVENCIONES: La acción protectora de F1,6BP fue analizada en ratas Sprague-Dawley (de entre 200 y 250 gramos de peso corporal) a las cuales se les había inducido hepatitis mediante la inyección de galactosamina (GalN). Los efectos in vivo de la F1,6BP fueron evaluados mediante la determinación de la actividad transaminasa en plasma, la determinación de endotoxinas en plasma y la determinación del factor necrótico de tumoración alfa (TNF-alfa) en plasma y en hígado total en ratas tratadas con GalN. Las dianas de la F1,6BP para reducir la respuesta de los macrófagos al lipopolisacárido (LPS) fueron determinadas mediante el estudio de la correlación entre los cambios en la producción de TNF-alfa y los flujos de potasio a través de la membrana celular en cultivos primarios de células de Kupffer.DETERMINACIONES Y PRINCIPALES RESULTADOS : Los resultados obtenidos in vivo indican que el tratamiento con F1,6BP previene el daño causado por la administración de GalN en células del parénquima hepático. Esta protección se ha asociado principalmente a la reducción en la respuesta inflamatoria. F1,6BP previene la endotoxemia inducida por GalN en rata y ésta correlaciona con la inhibición de la secreción de histamina por parte de los mastocitos peritoneales, evento que precede al incremento de endotoxinas en plasma y de la producción hepática de TNF-alfa. Por otro lado, el tratamiento con F1,6BP reduce la sensibilidad de los macrófagos al LPS, cosa que provoca un descenso en la producción de TNF-alfa. Los resultados in vitro muestran que la F1,6BP inhibe la respuesta y la secreción de TNF-alfa por parte de las células de Kupffer a las que se ha administrado LPS. La F1,6BP previene estos efectos mediante la inhibición de la activación de los canales de potasio por LPS en este modelo celular.CONCLUSIONES: El efecto modulador de los canales de potasio en la adición exógena de F1,6BP explica sus efectos como antihistamínico y antiinflamatorio, cosa que incrementa enormemente el interés terapéutico de este compuesto bifosforilado.

L'aterosclerosi, és una malaltia inflamatòria. S'ha demostrat que una inflamació crònica, tal com la malaltia periodontal, el lupus eritomatòs, l'artritis reumatoide o la bronquitis crònica contribueixen a una major mortalitat i morbiditat per malaltia cardiovascular. Malgrat aquests coneixements no es disposa de cap dada que demostri els efectes a llarg termini d'un procés inflamatori crònic així com quin paper podrien tindre determinats agents antiinflamatoris en el desenvolupament i progressió de l'aterosclerosi. Diversos estudis suggereixen que l'ús de determinats fàrmacs antiinflamatoris podria constituïr una eina eficaç per al tractament de l'aterosclerosi. De fet, els resultats d'estudis previs han demostrat la utilitat de l'aspirina com a antiagregant plaquetari en l'infart de miocardi i en l'angina de pit. En pacients amb aquests problemes, l'aspirina disminueix la incidència d'episodis isquèmics i la mortalitat. Aquests efectes beneficiosos s'observen amb dosis baixes d'aspirina i resultant en una disminució en la quantitat de tromboxà produït a nivell de les plaquetes i per tant, inhibint l'agregació plaquetària. Tanmateix, dosis elevades d'àcid acetilsalicílic inhibeixen l'activitat de la COX-1 i de la COX-2 i per tant, s'inhibeix també la síntesi de les prostaglandines i prostaciclina, molècules amb una elevada activitat proinflamatòria. Estudis previs han demostrat que l'administració d'altes dosis d'aspirina tenen un efecte beneficiós en l'aterogènesi a curt termini en el ratolí deficient en apo E. Malgrat aquests resultats, no hi ha cap dada que evidencii els efectes de l'administració d'altes dosis d'aspirina en el ratolí deficient en apo E a llarg termini. Els resultats que s'exposen en aquesta tesi doctoral demostren que l'administració d'altes dosis d'aspirina no té cap efecte significatiu a llarg termini sobre l'aterogènesi en el ratolí deficient en apolipoproteïna E. D'altra banda s'observa que la mida de les lesions ateroscleròtiques avaluades en el sinus aòrtic d'aquests animals està significativament correlacionada amb les concentracions plasmàtiques de colesterol, suggerint que l'administració continuada d'aspirina facilita l'aterogènesi. Nosaltres suggerim que aquest efecte observat no és degut a l'administració de l'apirina 'per se', sinó que podria ser degut a la presència d'un o varis factors presents en el nostre model que no controlem i que ens està afectant els nostres resultats. Per tant, hem de concloure que el nostre model no està lliure d'artefactes i proposem que la dieta amb la que els ratolins s'han alimentat (una dieta hipercalòrica) podria constituïr un factor que complica la intepretació dels resultats obtinguts en aquest model animal. En l'estudi 2 d'aquesta tesi doctoral hem demostrat que els ratolins apo E-deficients alimentats amb una dieta amb un alt contingut en greix i colesterol desenvolupen alteracions hepàtiques greus que consisteixen en el cúmul de greix, proliferació de macròfags i la presència de cèl·lules inflamatòries. A més, hem observat l'existència d'una relació cronològica i quantitativa entre la mida de les lesions ateroscleròtiques i el grau d'alteració del teixit hepàtic. Aquests resultats semblen indicar que el colesterol de la dieta pot produïr lesions significatives en el fetge d'aquests animals, dificultant-nos així la interpretació dels resultats obtinguts en aquest model animal. Els nostres resultats suggereixen que els ratolins apo E-deficients poden constituir un bon model animal per a l'estudi de l' esteatohepatitis no alcohòlica.Finalment, hem trobat que l'administració repetida de turpentina, produeix una resposta inflamatoria molt similar a determinats processos infamatoris crònics, i sembla ser que no està afectada per l'administració d'aspirina. Els ratolins tractats amb turpentina van presentar una disminució significativa de les concentracions plasmàtiques de colesterol, del tamany de les lesions aterosleròtiques així com de l'expressió hepàtica del gen multiple- drug resistance (mdr1b) en relació amb els ratolins control. Nosaltres suggerim que mdr1b pot jugar un paper important en la regulació de les concentracions plasmàtiques de colesterol i/o en la progressió de l'aterosclerosi. / Atherosclerosis, the main cause of coronary artery disease (CAD), is an inflammatory disease. It is commonly accepted that chronic inflammation, as observed in periodontal disease,lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, or chronic bronchitis, contributes to higher mortality and morbidity from cardiovascular disease. However, experiments are needed to ascertain the long-term effects of chronic inflammation and the effect of anti-inflammatory agents onthe development and progression of atherosclerosis. It has been suggested that the use of antiinflamatory drugs could offer new opportunities for the prevention and treatment of CAD.Previous studies indicate the efficacy of aspirin and other antiplatelet drugs in reducing the risk of a serious vascular event, such as nonfatal myocardial infarction, nonfatal stroke or death from vascular diseases. These effects have been demonstrated using low-dose aspirin resulting in the permanent inactivation of a key platelet enzyme, cyclooxygenase 1 (COX-1) that mainly catalyzes the conversion of arachidonic acid into tromboxane A2 (TXA2), resulting in lower levels of TXA2, thus inhibits platelet aggregation. Higher levels of aspirin are needed to inhibit COX-2 than to inhibit COX-1. Vascular prostacyclin (PGI2) is derived predominantly from COX-2 and is less susceptible to inhibition by low doses of aspirin. Previous studies have shown that short-term administration of high doses of aspirin reduces the atherosclerotic lesion size in apolipoprotein E-deficient mice. However, to date it has not been studied the effect of long-term administration of high doses of aspirin in the apolipoprotein E-deficient mice.The results presented in this thesis show that long-term administration of high doses of aspirin does not attenuate the progression of atheosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Moreover, the extent of atherosclerosis was significantly correlated with plasma cholesterol concentrations in our animal model, suggesting that apparently, the continous administration of aspirin was facilitating atherogenesis. However, we hypothesized that this effect was not produced by the administration of aspirin 'per se'. It may be produced by any factor present in our model which was affecting our results. We especulate that a high-fat, high-cholesterol diet could be a complicating factor. This was further exemplified by the results from study 2, which indicate that mice given high fat/high cholesterol diets developed an impairment of liver histology consisting of fat accumulation, macrophage proliferation, and inflammation. We also found a chronological and quantitative relationship between liver impairment and the formation of atheromatous lesions, indicating that feeding these mice with high-fat/cholesterol diets could be a complicating factor. Our findings, also suggest that apo E-KO mice may provide an experimental model for the effect of Western diet on the development of steatohepatitis. Finally, we have found that a repeated injection of turpentine over such a protractedperiod of time, which was not modified by the use of aspirin, closely resembled the characteristic pattern of inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease. In mice with turpentine-induced inflammation, the plasma cholesterol levels, atherosclerotic lesions and the hepatic expression of the multiple- drug resistance gene (mdr1b) were lower than in controls. We suggest that mdr1b could play an important role in regulation of plasma cholesterol and/or the progression of atherosclerosis.

Four cellular models have been developed to implement and standardise in vitro methodology to monitor the effect of food compounds or extracts on anti-inflammatory system, on endothelial function and on anti-thrombotic response: 1. Induction of inflammation: Monocytes THP-1 cells challenged with Lipopolysaccharides and tumour necrosis factor-alpha (TNF-) protein release and mRNA expression were assessed. 2. Induction of endothelial dysfunction: HAEC challenged with TNF-α and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) protein release and mRNA expression were determined. 3. Assessment of endothelial function: HAEC were incubated with TNF- and Insulin and mRNA expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was determined. 4. Study of thrombotic effects: HAEC were pre-incubated with resveratrol and then, challenged with TNF-α to assess the tissue factor (TF) protein and mRNA expression. Thus, these in vitro cellular models are valid systems for the study of compounds or food extracts on mechanisms involved in the pathogenesis of atherosclerosis. / S'han desenvolupat 4 models per estandarditzar metodologia in vitro per supervisar l'efecte de compostos o extractes d'aliments en un sistema antiinflamatori, en funció endotelial i resposta antitrombòtica. 1. Inducció de la inflamació: Es van estimular monòcits THP-1 amb Lipopolisacàrids i avaluar l'expressió proteica i del mRNA del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-). Inducció de disfunció endotelial: Van estimular-se HAEC amb TNF- i determinar l'expressió proteica i del mRNA de la mol·lècula d'adhesió vascular cel·lular (VCAM-1). Avaluació de la funció endotelial: Es van incubar HAEC amb TNF- o Insulina i determinar l'expressió del mRNA de la endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Estudi dels efectes trombòtics: Les HAEC van ser pre-incubades amb resveratrol i estimulades amb TNF-α per avaluar l'expressió proteica i del mRNA del factor tissular. Aquests models cel·lulars in vitro són vàlids per estudiar compostos o extractes d'aliments sobre mecanismes implicats en la patogènesi de l'aterosclerosi.

En els últims anys, s’ha estudiat com els agents antiinflamatoris presents en els aliments poden modular la inflamació relacionada amb diverses malalties. Les procianidines presents en fruites i vegetals i els àcids grassos poliinsaturats (PUFAs) presents en peix i els olis derivats d’ells són compostos que tenen diferents propietats antiinflamatòries en front de diverses malalties com l’obesitat, la diabetis i malalties cardiovasculars. L’objectiu del nostre estudi va ser investigar diferents aspectes i mecanismes relacionats amb l’eficàcia d’un extracte de procianidines de pinyol de raïm (GSPE) en front de l’estat inflamatori crònic en rates Zucker fa/fa genèticament obeses, i d’un estat inflamatori agut activat per la injecció de lipopolisacàrids (LPS) en rates Wistar. Una dosi moderada de 35 mg/kg per dia de GSPE durant 10 setmanes va produir efectes antiinflamatoris sobre l’expressió gènica en teixit adipós mesentèric en les rates Zucker fa/fa. Tot i així, no es van trobar efectes significatius en la inflamació sistèmica. A més, el GSPE va tenir efectes antiinflamatoris a nivell sistèmic i en l’expressió gènica quan es va administrar durant 15 dies previs a la inducció de la inflamació per LPS en rates Wistar. La dosi alta nutricional de 75 mg/kg per dia i la dosi alta farmacològica de 200 mg/kg per dia de GSPE van ser les més efectives en prevenir aquesta inflamació. Per altra banda, diferents molècules bioactives com els flavonoides resveratrol (RES), epigal•locatequina gal•lat, i les procianidines dimèriques B1-B4, i els PUFAs EPA i DHA van ser administrats en combinació per analitzar els efectes antiinflamatoris sinèrgics, additius o antagònics en macròfags estimulats amb LPS. Les combinacions de B3 més EPA i RES més EPA van mostrar efectes antiinflamatoris sinèrgics disminuint els nivells d’òxid nítric, els nivells d’expressió de gens proinflamatoris i relacionats amb l’estrès oxidatiu, i modulant la fosforilació de diferents proteïnes involucrades en l’activació de les vies proinflamatòries senyalitzadores de l’NF-κB i de l’AP-1. / The study of how anti-inflammatory agents found in food can mediate in various diseases in which inflammation is involved has become relevant in recent years. Procyanidins present in fruits and vegetables and polyunsaturated fatty acids (PUFAs) present in fish and fish oils are compounds that have anti-inflammatory properties against several diseases such as obesity, diabetes and cardiovascular disease. The goal of this study was to investigate some aspects and mechanisms related to the reported efficacy of grape seed procyanidin extract (GSPE) against the inflammatory state in the genetically obese Zucker fa/fa rat model with low-chronic inflammation and a model of acute inflammation triggered by the injection of lipopolysaccharide (LPS) into Wistar rats. A moderate dose of 35 mg/kg*day of GSPE for 10 weeks had anti-inflammatory effects at the gene expression level in mesenteric adipose tissue in Zucker fa/fa rats. However, no significant effects on systemic inflammation were found. In contrast, GSPE had anti-inflammatory effects at the systemic and gene expression levels when administered for 15 days prior to LPS-induced inflammation in Wistar rats. The moderate-high dose of 75 mg/kg*day and the high dose of 200 mg/kg*day of GSPE were the most effective doses in preventing acute inflammation. In addition, several pure bioactive flavonoids such as resveratrol (RES), epigallocatechin gallate, B1-B4 dimeric procyanidins, and PUFAs such as EPA and DHA were administered in various combinations to assess any potential synergistic, additive or antagonistic anti-inflammatory effects that may exist between these flavonoids and PUFAs in LPS-stimulated murine macrophages. Importantly, the combinations of B3 plus EPA and RES plus EPA had strong synergistic anti-inflammatory effects manifested by a decrease in nitric oxide levels, a decrease in the expression of proinflammatory and oxidative stress-related genes and the modulation of the phosphorylation status of various proteins involved in the activation of the NF-κB and AP-1 proinflammatory pathways. / En los últimos años, se ha estudiado como los agentes antinflamatorios presentes en los alimentos pueden modular la inflamación relacionada con diversas enfermedades. Las procianidinas presentes en frutas y vegetales y los ácidos grasos polinsaturados (PUFAs) presentes en el pescado y los aceites derivados de ellos son compuestos que tienen diferentes propiedades antinflamatorias frente a varias enfermedades como la obesidad, la diabetes y enfermedades cardiovasculares. El objetivo de nuestro estudio fue investigar diferentes aspectos y mecanismos relacionados con la eficacia de un extracto de procianidinas de pepita de uva (GSPE) frente al estado inflamatorio crónico en ratas Zucker fa/fa genéticamente obesas, y de un estado inflamatorio agudo activado por la inyección de lipopolisacáridos (LPS) en ratas Wistar. Una dosis moderada de 35 mg/kg por día de GSPE durante 10 semanas produjo efectos antinflamatorios sobre la expresión génica en tejido adiposo mesentérico en las ratas Zucker fa/fa. Aún así, no se encontraron efectos significativos en la inflamación sistémica. Además, el GSPE tuvo efectos antinflamatorios a nivel sistémico y en la expresión génica cuando fue administrado durante 15 días previos a la inducción de la inflamación por LPS en ratas Wistar. La dosis alta nutricional de 75 mg/kg por día y la dosis alta farmacológica de 200 mg/kg por día de GSPE fueron las más efectivas en prevenir esta inflamación. Por otro lado, diferentes moléculas bioactivas como los flavonoides resveratrol (RES), epigalocatequina galada, y las procianidinas diméricas B1-B4, y los PUFAs EPA y DHA fueron administrados en combinación para analizar los efectos antinflamatorios sinérgicos, aditivos o antagónicos en macrófagos estimulados con LPS. Las combinaciones de B3 más EPA y RES más EPA mostraron efectos antinflamatorios sinérgicos disminuyendo los niveles de óxido nítrico, los niveles de expresión de genes proinflamatorios y relacionados con el estrés oxidativo, y modulando la fosforilación de diferentes proteínas involucradas en la activación de las vías proinflamatorias señalizadoras del NF-κB y del AP-1.

Nombroses evidències mostren l'important paper dels receptors nuclears PPAR en el control de l'homeòstasi energètica a través de les seves accions reguladores sobre el metabolisme lipídic i glucídic, a més de la seva implicació en processos inflamatoris, tumorals i en la reproducció i el desenvolupament embrionari. La falta de lligands específics de PPARβ/δ fins fa relativament poc ha fet que els efectes fisiològics d'aquest subtipus hagin estat poc estudiats en relació als altres subtipus de PPAR, PPARα i PPARγ. Actualment però, la disponibilitat d'agonistes selectius de PPARβ/δ com GW501516, ha ajudat a conèixer i entendre l'important paper fisiològic que juga aquest receptor com regulador de múltiples funcions cel·lulars, especialment en la regulació del metabolisme i la resposta inflamatòria. Encara, però, resta per determinar els mecanismes moleculars responsables d'aquets efectes provocats per l'administració d'aquests fàrmacs, ja que només han estat parcialment estudiats. Els objectius d'aquesta tesi doctoral han estat:1. Establir els mecanismes responsables de l'efecte hipotrigliceremiant de l'agonista de PPARβ/δ GW501516 en ratolins alimentats amb una dieta rica en greixos (HFD).2. Establir els mecanismes responsables pels quals l'activador de PPARβ/δ GW501516 és capaç d'inhibir la resposta inflamatòria en queratinòcits humans estimulats amb TNF-α.Respecte el primer objectiu els resultats obtinguts indiquen que l'agonista PPARβ/δ GW501516 podria reduir els nivells de triglicèrids en plasma en un model animal de hipertrigliceridèmia evitant la reducció de l'AMPK i activant la via PGC1-α-Lipin 1-PPARα. D'altra banda, respecte el segon objectiu els resultats també demostren que GW501516 pot evitar la inflamació induïda per TNF-α en queratinòcits humans reduint l'activació del factor de transcripció pro-inflamatori NF-κB per l'activació de l'AMPK i SIRT1. / The effects of PPARβ/δ subtype and its role in the metabolic syndrome and the inflammatory diseases has been elucidated in the last years, in part, by the availability of PPARβ/δ agonist GW501516, althought the mechanism involved is still unkonwn. In this study we examined the effects of PPARβ/δ activator GW501516 on high-fat diet (HFD)-induced hypertriglyceridemia. Our results showed that the hipertrigliceridemia caused by the HFD was reduced by the drug treatment. Also the PPARβ/δ activation prevented the reduction in the AMPK-Lipin1-PGC-1α pathway caused by the HFD, leading to an increase in hepatic fatty acid oxidation. This effect, together with increased hepatic expression in VLDL-receptor might be responsible for the hypotriglyceridemic effect of GW501516.Moreover, the PPARβ/δ activation by GW501516 also prevented TNF-α-induced NF-κB activation in human HaCaT cells by reducing p65 acetylation through AMPK and SIRT1.