INTRODUCTION Carnitine palmitoyltransferase I, which is expressed in the pancreas as the liver isoform (LCPTI), catalyzes the rate-limiting step in the transport of fatty acids into the mitochondria for their oxidation. To directly examine whether the availability of long-chain fatty acyl-CoA affects the regulation of insulin secretion in the Beta-cell, we infected INS(832/13) cells and rat islets with an adenovirus encoding a mutant form of LCPTI (Ad-LCPTI M593S) that is insensitive to its inhibitor malonyl-CoA. C75 is described as a potential drug for treatment of obesity and type 2 diabetes. First known as a synthetic inhibitor of fatty acid synthase, it has been also described as an activator of CPTI, increasing peripheral energy utilization and fatty acid oxidation in mice. To further investigate the C75/CPTI interaction, we have characterized the effects of C75 on CPTI in vitro and in vivo.OBJECTIVES 1) Study of the malonyl-CoA/CPTI interaction in the pancreatic Beta-cell and its involvement in glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). 2) Construction of an INS stable cell line overexpressing LCPTI wt and LCPTI M593S. 3) Determine the effect of C75 on the CPTI activity and palmitate oxidation in pancreatic Beta-cells. RESULTS. In Ad-LCPTI M593S infected INS(832/13) cells LCPTI activity increased six-fold. This was associated with enhanced fatty acid oxidation, at any glucose concentration, and a 60% suppression of GSIS. In isolated rat islets in which LCPTI M593S was overexpressed, GSIS decreased 40%. At high glucose concentration, overexpression of LCPTI M593S reduced partitioning of exogenous palmitate into lipid esterification products, and decreased PKC activation. Moreover, LCPTI M593S expression impaired KATP channel-independent GSIS in INS(832/13) cells. INS-1 stable clones of LCPTIwt and LCPTImut were constructed, however none of them resulted in an increase in LCPTI protein expression compared to endogenous LCPTI nor in CPTI activity. Therefore, slight basal overexpression of LCPTI could probably be toxic for the cells, as a result of which only those cells that do not contain the LCPTI plasmids survived throughout cell passages. When INS(823/13) cells are incubated with C75, CPTI activity is inhibited, as is fatty acid oxidation. In vivo, a single intraperitoneal injection of C75 to mice produces a short-term inhibition of CPTI activity in mitochondria from liver and pancreas.DISCUSSION. The results with LCPTImut provide direct support for the hypothesis proposing that the malonyl-CoA/CPTI interaction is a component of a metabolic signalling network that controls insulin secretion. Overall, the findings with C75 provide compelling evidence that the drug is a potent inhibitor of CPTI.

El objetivo principal de esta memoria de tesis es evaluar la interacción entre ácidos grasos poliinsaturados y vitamina E dietéticos sobre la deposición corporal de ácidos grasos y -tocoferol en pollos broiler. Se diseñaron dos experimentos que basados en niveles crecientes de acetato de -tocoferol (0, 100, 200 y 400 mg/kg) y ácidos grasos poliinsaturados en los piensos. En la primera prueba, el gradiente de poliinsaturación se obtuvo mezclando una grasa saturada (sebo) con una mezcla de aceites insaturados (aceites de linaza y pescado), manteniendo el nivel de inclusión de la grasa constante (9%). En la segunda prueba, el gradiente se creó incrementando el nivel de inclusión de la grasa añadida (2, 4, 6 y 8%), utilizando aceites de linaza y pescado. Se realizaron 2 balances para determinar la energía metabolizable aparente, la absorción aparente de la materia orgánica, la grasa bruta, los ácidos grasos y el -tocoferol, y el porcentaje de hidrólisis del acetato de -tocoferol. Al final de cada estudio (44 y 40 días de edad), la mitad de los animales fueron sacrificados mediante inyección letal y la otra mitad en un matadero. Los primeros se conservaron enteros y los últimos se despiezaron, obteniéndose la grasa abdominal y el hígado. Se cuantificaron los ácidos grasos y el -tocoferol en el cuerpo entero. -tocoferol también se determinó en el hígado. También se analizó la composición química y el contenido en energía bruta del pollo entero. La poliinsaturación dietética manteniendo el nivel de grasa constante (prueba 1) tuvo efecto sobre la energía metabolizable aparente de los piensos. Los animales que ingirieron el pienso más saturado tuvieron una menor absorción aparente de la materia orgánica, disminuyendo así la energía metabolizable aparente de este pienso. A pesar de esto, los animales alimentados con 9% de sebo tuvieron un mayor contenido en grasa y energía en el cuerpo. Por el contrario, incrementar la poliinsaturación dietética mediante el aumento del nivel de inclusión de grasa (prueba 2) no tuvo ningún efecto sobre la composición química ni el contenido en energía del pollo. El aumento de la ingestión de ácidos grasos poliinsaturados resultó en incrementos lineales de su concentración en los pollos en ambos experimentos. La contribución de la síntesis endógena a la concentración corporal de ácidos grasos saturados y monoinsaturados se estimó utilizando los datos combinados de las dos pruebas. Ésta varia entre 17.7% (10% de grasa en el pienso) a 35.3% (0% de grasa) en el caso de los ácidos grasos saturados; y entre un 7.0% y 52.7% en el caso de los monoinsaturados. La inclusión de acetato de -tocoferol no tuvo efectos marcados sobre el contenido de ácidos grasos del pollo. Los valores de absorción aparente del -tocoferol variaron entre 11 y 50%, con un valor medio de 42.1% bajo nuestras condiciones experimentales. No hubo diferencias al comparar las dos edades (20 y 39 días de edad). La inclusión de sebo al 9% en el pienso afectó negativamente a la absorción aparente del -tocoferol y el porcentaje de hidrólisis de acetato de -tocoferol. Por otra parte, incrementos en el nivel de inclusión de la grasa añadida rica en ácidos grasos poliinsaturados no tuvieron efecto sobre estos parámetros. Niveles elevados de ácidos grasos poliinsaturados en la dieta no afectaron la absorción aparente de -tocoferol, pero redujeron la concentración de -tocoferol libre en heces, sugiriéndose un gasto en el tracto gastrointestinal previa absorción. El depósito de -tocoferol en el hígado fue menor en los animales alimentados con los piensos más insaturados comparados con los animales alimentados con el pienso saturado (prueba 1) y a los animales alimentados con el pienso bajo en grasa. / The main objective of this PhD dissertation is to evaluate the interaction between dietary poliunsaturated fatty acids and vitamin E on body deposition of fatty acids and -tocopherol in broiler chickens. Two experiments were designed based on -tocopheryl acetate supplementation (0, 100, 200 and 400 mg/kg) and a gradient of dietary poliunsaturation. In trial 1, this gradient was achieved blending tallow (rich in saturated fatty acids) with linseed and fish oil (unsaturated oils), keeping added fat constant (9%). In trial 2, the gradient was made increasing the inclusion level of dietary fat (2, 4, 6 and 8%), a blend of linseed and fish oil. Two balance studies were made in order to measure apparent metabolizable energy, apparent absorption of organic matter, crude fat, fatty acids and -tocopherol, and also -tocopheryl acetate percentage of hydrolysis. At the end of each trial (40 and 44 days of age), half of the animals were killed by lethal injection and the other half were killed in a slaughterhouse. The former were kept whole and the latter were quartered and the liver and absdominal fat pad were obtained. Fatty acids and -tocopherol were quantified in the whole body, and -tocopherol was also measured in the liver. Aslo, the chemical composition (Weende) and energy content of the whole body was analyzed. Dietary poliunsaturation, keeping added fat constant, had effect upon apparent metabolizable energy content of the diets. The animals fed the more saturated diet had lower apparent absorption of organic matter, resulting in a lower apparent metabolizable energy of this diet. However, the animals fed this saturated diet had higher energy and fat content in the whole body. On the other hand, increasing dietary poliunsaturation by means of increasing added fat inclusion level had no effect whatsoever upon chemical and energy content of the chickens. The increase in polyunsaturated fatty acids intake resulted in a linear increase in their body deposition in both trials. The contribution of endogenous synthesis to fatty acid composition of the body was estimated using the combined data of both trials. This contribution varies between 17.7% (10% of dietary fat) and 35.3% (0% dietary fat) for the saturated fatty acids; and between 7.0% and 52.7% for the monounsaturated ones. Vitamin E inclusion had no marked effects upon fatty acid content in the whole body. Apparent absorption coefficients for vitamin E varied between 10 and 50%, with an average value of 42.1% under our experimental conditions. There were no differences in this variable when comparing between the two ages (20 and 39 days of age). The inclusion of 9% of tallow affected negatively -tocopherol apparent absorption and -tocopheryl acetate % of hydrolysis. On the other hand, increases in added fat inclusion level had no effect on these parameters. High dietary poliunsaturation levels did not affect vitamin E apparent absorption but resulted in lower free -tocopherol excretion, suggesting a gastrointestinal waste by lipid oxidation previous to its absorption. -tocopherol deposition in the liver was lower in the animals fed the more unsaturated diets compared to the ones fed the saturated (trial 1) or the low-fat ones (trial 2).

El ácido docosahexaenoico, un PUFA omega-3, se ha relacionado con efectos inmunosupresores en linfocitos, monolitos y macrófagos pero no existían estudios sobre sus efectos en las células dendríticas (DCs). Por ello se diferenciaron en presencia de DHA monocitos hacia DCs. Las células tratadas con el ácido graso mostraron cambios fenotípicos divergentes en función del estadio de madurez de las mismas. Así, en estadio inmaduro, se produjeron incrementos de expresión de CD83, CD86, HLA-DR y CD36 y disminución de CD1a y CD80. Sin embargo, en estadio maduro, CD83, CD86 y HLA-DR sufrieron descensos en su expresión con respecto a los controles. CD80 y CD1a de nuevo presentaban una expresión disminuida y la de CD36 se encontraba aumentada. Al medir la capacidad de activación de la proliferación linfocitaria de estas células se encontró que esta se encontraba disminuida. La secreción de IL-10 e IL-12 también había disminuido. Este conjunto de efectos era dependiente de la concentración de DHA. El DHA era capaz de desarrollar algún tipo de efecto inmunosupresor en las DCs.Se realizaron experimentos similares con otros ácidos grasos: EPA, ácido linoleico (LA) y ácido oleico. Con EPA y LA se obtuvieron resultados similares a los mostrados por el DHA cualitativamente pero no cuantitativamente. El DHA era el ácido graso más potente y afectaba tanto al fenotipo como a la capacidad secretora de citocinas y activadora de la proliferación linfocitaria en DCs.Estos resultados eran similares a los obtenidos por otros autores en los tratamientos de DCs con activadores de PPARγ lo cual sugería para el DHA una posible actuación a través de este receptor nuclear. Sin embargo, el hecho de que el DHA sea un activador de PPARγ pobre en comparación con EPA, LA o Rosiglitazona sugirió la presencia de otras vías de activación. En concreto, RXR, con el cual se ha demostrado que el DHA es capaz de interactuar.Se trataron DCs con concentraciones en el rango nanomolar de 9cRA, un activador de RXR, obteniéndose que este retinoide era capaz de interferir en la maduración normal de la DC de forma que se obtenía resultados fenotípicos extraordinariamente similares a los producidos por el DHA. También la capacidad de estimulación de la proliferación linfocitaria estaba disminuida. En cambio, las DCs tratadas con 9cRA mostraron una secreción disminuida de IL-12 y normal de IL-10. La activación de PPARγ:RXR simultáneamente a través de ambos monómeros ha sido relacionada con efectos aditivos, sinérgicos o complementarios en muchos tipos celulares. Se cree que esto es debido a la unión de moléculas coactivadoras complementarias al heterodímero. La adición simultánea de Rosiglitazona y 9cRA a las DCs mostró efectos fenotípicos aditivos indicando que probablemente 9cRa estaba actuando a través del heterodímero. Se realizaron experimentos similares combinando el DHA con 9cRA y el DHA con la Rosiglitazona. La combinación con Rosiglitazona mostró cambios mucho más importantes lo cual sugería que el DHA actuaba principalmente uniéndose a RXR en el heterodímero. Finalmente se añadió un inhibidor específico de PPARγ a las células dendríticas: GW9662; el cual fue capaz de bloquear los efectos producidos por el DHA, la Rosiglitazona y el 9cRA. Además, el inhibidor por sí mismo alteraba por completo el proceso de maduración de las células dendríticas implicando que PPARγ debe desarrollar un papel indispensable en el proceso de maduración de la DC y no solo actuar como un activador de la inmunosupresión y también que el DHA, probablemente, actúe a través del monómero RXR del heterodímero PPARγ:RXR en las DCs. / Docosahexaenoic Acid (DHA), an omega-3 PUFA, has been associated with immunosuppressive effects in lymphocytes, monocytes and macrophages, but there were no studies about its effects on dendritic cells (DCs). So human monocytes were differentiated to DCs in presence of growing concentrations of DHA. These cells displayed divergent changes in their phenotypes depending on the maturation stage, downregulating both their lymphoproliferative stimulation capacity and IL-12 and IL-10 secretion levels in mature stage. All these effects were DHA concentration dependent.We performed then similar experiments with other fatty acids: EPA, Linoleic Acid (LA), and Oleic Acid. With EPA and LA the results were similar to that shown by DHA in a qualitative manner but DHA was the most potent fatty acid affecting DC phenotype, lymphoproliferation activation capacity and cytokine secretion.The results obtained with DHA were similar to those obtained in DCs with PPARγ ligands although DHA is considered a poor PPARγ ligand compared to EPA, LA or Rosiglitazone. By the other side, theoretically, the PPARγ heterodimer can be activated both by RXR and PPARγ ligands. 9cRA, an RXR ligand, was tested at low concentrations in DCs. The results obtained were similar in phenotype and lymphoproliferative stimulation capacity to those shown by DHA treatments. However, mature 9cRA treated DCs secreted normally IL-10 with IL-12 inhibited. The simultaneous addition of 9cRA and Rosiglitazone on DCs displayed additive effects on DCs phenotype indicating that 9cRA was probably acting through PPARγ:RXR. When DHA and 9cRA or Rosiglitazone were combined, the phenotypic changes were much more additive for Rosiglitazone with DHA than for 9cRA with DHA. This was strongly suggesting that DHA could act mainly activating RXR in the PPARγ heterodimer.Finally, GW9662, an specific inhibitor of PPARγ, blocked the effects unleashed by DHA, Rosiglitazone and 9cRA. Moreover, GW9662 by himself altered normal maturation phenotype on DCs implying that PPARγ must fulfil a significant role in the DC maturation process moreover than the immunosuppression of the DC response and that DHA, probably, was acting through the RXR monomer of PPARγ heterodimer in DCs.

Les alteracions en el metabolisme dels àcids grassos estan implicades tant en l'aparició de la hipertròfia cardíaca com de la resistència a la insulina, encara que els mecanismes responsables són poc coneguts. Per aquesta raó, l'objectiu general d'aquesta tesi doctoral ha estat aprofundir en el coneixement dels mecanismes responsables de l'aparició d'aquestes dues patologies, així com els efectes de diferents fàrmacs sobre la hipertròfia cardíaca i la resistència a la insulina. Per a la consecució d'aquest objectiu general s'han realitzat una sèrie d'estudis amb els següents objectius específics: I. Determinar els efectes que produeix l'activació de NF-kappaB durant la hipertròfia cardíaca sobre l'expressió dels gens implicats en el metabolisme dels àcids grassos i l'efecte produit pels inhibidors d'aquest factor de transcripció.II. Avaluar si l'activador de PPAR-beta/delta, L-165041, és capaç de revertir la hipertròfia cardíaca en cardiomiòcits neonatals, i en cas que així sigui, determinar el mecanisme responsable.III. Examinar nous mecanismes potencials a través dels quals l'activació de NF-kappaB afecta l'acció dels PPARs en un model de rates amb constricció de la aorta abdominal que desenvolupen hipertròfia cardíaca i determinar l'efecte del tractament amb estatines en aquest model.IV. Estudiar l'efecte de les estatines sobre l'activitat de PPAR-beta/delta en cèl·lules H9c2 estimulades amb LPS i la possible participació del cofactor PGC-1 en aquest procés. V. Determinar si el tractament amb inhibidors de NF-kappaB afecta a la via Akt-GSK3-beta implicada en l'aparició de la hipertròfia cardíaca.VI. Examinar els efectes de l'HTB sobre la hipertròfia induïda per fenilefrina en cardiomiòcits neonatals i del triflusal en un model de rates amb constricció de la aorta abdominal.VII. Estudiar com el tractament amb troglitazona afecta a l'expressió de l'Akt i a l'activitat d'AMPK al múscul esquelètic i la seva implicació en els efectes d'aquest fàrmac sobre el metabolisme dels àcids grassos i la glucosa. Els resultats obtinguts semblen indicar que l'activació del factor NF-kappaB durant la hipertròfia cardíaca redueix l'activitat de PPAR-beta/delta tant in vivo com in vitro, a través d'un mecanisme que implica la interacció entre la subunitat p65 de NF-kappa-B i PPARbeta/delta. D'altra banda l'activació de PPARbeta/delta amb un agonista selectiu inhibeix la hipertròfia cardíaca induïda per fenilefrina en cardiomiòcits neonatals. Aquest tractament també inhibeix l'activació de NF-kappaB induïda per LPS a través d'un mecanisme que implica la interacció física entre aquest subtipus de PPAR i la subunitat p65 de NF-kappaB. Pel que fa al tractament amb atorvastatina, podem concloure que la reducció de l'oxidació dels àcids grassos observada durant la hipertròfia cardíaca, sembla ser el resultat de la reducció tant dels nivells de PPAR-alfa com de PPAR-beta/delta i de la interacció dels dos subtipus de PPAR i p65. Aquests canvis es reverteixen després del tractament amb atorvastatina. A més, l'activació de NF-kappaB induïda per LPS redueix l'expressió de la PGC-1. Aquest fet disminueix la interacció d'aquest coactivador i PPAR-beta/delta provocant un descens en l'expressió dels gens implicats en l'oxidació dels àcids grassos. Aquests canvis es reverteixen en presència d'inhibidors de NF-kappaB com l'atorvastatina i el partenolide. Finalment, l'atorvastatina inhibeix l'activació de la via Akt/GSK3-beta per estímuls hipertròfics, a través d'un mecanisme que implica la supressió de l'activitat NF-kappaB.Finalment, el triflusal, i el seu metabòlit actiu HTB, eviten la hipertròfia cardíaca tant in vitro com in vivo a través de la inhibició de NF-kappaB. En els resultats de resistència a la insulina, sembla que el tractament amb troglitazona incrementa l'expressió de la proteïna Akt en múscul esquelètic, a través de la reducció dels nivells intracel·lulars de ceramides. / Cardiac hypertrophy is a response of the heart to a wide range of extrinsic stimuli, such as arterial hypertension, valvular heart disease, myocardial infarction, and cardiomyopathy. Although this process is initially compensatory for an increase workload, its prolongation frequently results in congestive heart failure, arrhythmia, and sudden death. Among the signal transduction pathways involved in the hypertrophic growth of the myocardium, the nuclear factor (NF)-kappaB signaling pathway plays a pivotal role, since it has been shown that NF-kappaB inhibition blocks or attenuates the hypertrophic response of cultured cardiac myocytes. In addition, cardiac hypertrophy is associated with an increase in glucose utilization and a decrease in fatty acid oxidation, which is characteristic of fetal heart. Defects in mitochondrial fatty acid oxidation enzymes cause childhood hypertrophic cardiomyopathy, and perturbation of fatty acid oxidation in animal models causes cardiac hypertrophy, demonstrating that substrate utilization is important in the pathogenesis of hypertrophy.In this work we demonstrate that activation of PPARbeta/delta by the specific ligand L-165041, atorvastatin and triflusal inhibits cardiac hypertrophy.On the other hand, insulin resistance is a common metabolic abnormality associated with obesity, hypertension and type 2 diabetes mellitus. Skeletal muscle accounts for the majority of insulin-stimulated glucose utilization and is, therefore, the major site of insulin resistance. During the development of insulin resistance in skeletal muscle an impairment of glucose utilization and insulin sensitivity has been related to the presence of increased availability of certain lipid-derived second messengers, such as ceramides, which can attenuate several insulin signaling pathways leading to insulin resistance. Thiazolidinediones (ciglitazone, pioglitazone, rosiglitazone and troglitazone) are oral antidiabetic agents that improve insulin sensitivity and glucose homeostasis in type 2 diabetic patients as well as in various animal models of diabetes and obesity. The findings obtained implicate ceramide as an important intermediate in the regulation of Akt after troglitazone treatment and suggest that prior thiazolidinedione treatment may preserve or delay the onset of insulin resistance by increasing Akt in skeletal muscle.

Nombroses evidències mostren l'important paper dels receptors nuclears PPAR en el control de l'homeòstasi energètica a través de les seves accions reguladores sobre el metabolisme lipídic i glucídic, a més de la seva implicació en processos inflamatoris, tumorals i en la reproducció i el desenvolupament embrionari. La falta de lligands específics de PPARβ/δ fins fa relativament poc ha fet que els efectes fisiològics d'aquest subtipus hagin estat poc estudiats en relació als altres subtipus de PPAR, PPARα i PPARγ. Actualment però, la disponibilitat d'agonistes selectius de PPARβ/δ com GW501516, ha ajudat a conèixer i entendre l'important paper fisiològic que juga aquest receptor com regulador de múltiples funcions cel·lulars, especialment en la regulació del metabolisme i la resposta inflamatòria. Encara, però, resta per determinar els mecanismes moleculars responsables d'aquets efectes provocats per l'administració d'aquests fàrmacs, ja que només han estat parcialment estudiats. Els objectius d'aquesta tesi doctoral han estat:1. Establir els mecanismes responsables de l'efecte hipotrigliceremiant de l'agonista de PPARβ/δ GW501516 en ratolins alimentats amb una dieta rica en greixos (HFD).2. Establir els mecanismes responsables pels quals l'activador de PPARβ/δ GW501516 és capaç d'inhibir la resposta inflamatòria en queratinòcits humans estimulats amb TNF-α.Respecte el primer objectiu els resultats obtinguts indiquen que l'agonista PPARβ/δ GW501516 podria reduir els nivells de triglicèrids en plasma en un model animal de hipertrigliceridèmia evitant la reducció de l'AMPK i activant la via PGC1-α-Lipin 1-PPARα. D'altra banda, respecte el segon objectiu els resultats també demostren que GW501516 pot evitar la inflamació induïda per TNF-α en queratinòcits humans reduint l'activació del factor de transcripció pro-inflamatori NF-κB per l'activació de l'AMPK i SIRT1. / The effects of PPARβ/δ subtype and its role in the metabolic syndrome and the inflammatory diseases has been elucidated in the last years, in part, by the availability of PPARβ/δ agonist GW501516, althought the mechanism involved is still unkonwn. In this study we examined the effects of PPARβ/δ activator GW501516 on high-fat diet (HFD)-induced hypertriglyceridemia. Our results showed that the hipertrigliceridemia caused by the HFD was reduced by the drug treatment. Also the PPARβ/δ activation prevented the reduction in the AMPK-Lipin1-PGC-1α pathway caused by the HFD, leading to an increase in hepatic fatty acid oxidation. This effect, together with increased hepatic expression in VLDL-receptor might be responsible for the hypotriglyceridemic effect of GW501516.Moreover, the PPARβ/δ activation by GW501516 also prevented TNF-α-induced NF-κB activation in human HaCaT cells by reducing p65 acetylation through AMPK and SIRT1.

La present Tesi Doctoral s’emmarca en una línia d’investigació del Departament de Producció Animal de la Universitat de Lleida, dedicada a la millora genètica de la qualitat de la carn en bestiar porcí, en particular del contingut i composició del greix intramuscular. La Tesi es composa de quatre estudis, centrant-se el primer d’ells en el desenvolupament d’un mètode per a determinar el contingut i composició del greix intramuscular a partir de biòpsies i mostres post-mortem petites amb les que després es puguin portar a terme estudis en disseny longitudinal. La metodologia proposada ha resultat útil, demostrant-se que, especialment per al contingut de greix intramuscular, els espècimens petits del múscul objectiu són tan informatius com mostres grans d’altres músculs. En el segon estudi s’ha investigat, mitjançant un experiment amb dades longitudinals obtingudes segons la metodologia descrita anteriorment, l’efecte de l’edat sobre el contingut i composició del greix intramuscular i subcutani al llarg del cicle d’engreix en porcs de raça Duroc. Es conclou que un retard en l’edat de sacrifici implica un augment del contingut de greix intramuscular i d’àcid oleic, tot i que això s’aconsegueix a expenses de disminuir la velocitat de creixement magre. Per altra part es demostra que el greix intramuscular i el greix subcutani tenen comportaments diferents de creixement i composició i que la quantitat de greix per si mateix també influeix en la seva composició. El que un porc sigui més gras de l’esperat a una edat determinada és degut, en el cas del greix intramuscular, a que ha augmentat el contingut de greix monoinsaturat, en especial d’olèic, mentre que, en el del greix subcutani a que s’ha incrementat el contingut de saturat. En els dos últims estudis s’examina si la variació al·lèlica en els gens IGF-1 (insulin-like growth factor-1) i LEP (leptina), així com la concentració de IGF-1 i leptina en plasma, s’associen amb el contingut i la composició del greix intramuscular i, en cas que així fos, si aquesta associació és funció de l’edat. Es posa en evidència que els polimorfismes moleculars estudiats no són neutrals en relació al contingut de greix intramuscular, però també que els seus efectes no són constants al llarg del període de creixement. En aquest sentit, tant l’edat com l’estat d’engrassament poden modificar-los. / La presente Tesis Doctoral se emmarca en una línea de investigación del Departamento de Producción Animal de la Universidad de Lleida dedicada a la mejora genética de la calidad de la carne en porcino, en particular del contenido y la composición de la grasa intramuscular. La Tesis se compone de cuatro estudios, centrándose el primero de ellos en el desarrollo de un método para determinar el contenido y la composición de la grasa intramuscular a partir de biopsias y muestras post-mortem pequeñas con las que luego poder realizar estudios mediante diseños longitudinales. La metodología propuesta ha resultado útil, demostrándose que, especialmente para el contenido de grasa intramuscular, los especímenes pequeños del músculo objetivo son tan informativos como muestras grandes de otros músculos. En el segundo estudio se ha investigado mediante un experimento con datos longitudinales, obtenidos según la metodología descrita anteriormente, el efecto de la edad sobre el contenido y la composición de la grasa intramuscular y subcutánea durante el engorde de cerdos Duroc. Se concluye que un retraso en la edad de sacrificio comporta un aumento del contenido de grasa intramuscular y de ácido oleico, aunque ello se consigue a costa de disminuir la velocidad de crecimiento magro. Por otra parte, se demuestra que la grasa intramuscular y la grasa subcutánea tienen patrones distintos de crecimiento y composición y que la cantidad de grasa por sí misma influye en su composición. El que un cerdo sea más graso de lo esperado a una edad determinada es debido, en el caso de la grasa intramuscular, a que ha aumentado el contenido de grasa monoinsaturada, en especial de oleico, mientras que, en el de la subcutánea, a que se ha incrementado el de la saturada. En los dos últimos estudios se examina si la variación alélica en los genes IGF-1 (insulin-like growth factor-1) y LEP (leptina), así como la concentración de IGF-1 y leptina en plasma, se asocian con el contenido y la composición de la grasa intramuscular y, en caso de que así fuera, si tal asociación es función de la edad. Se constata que los polimorfismos moleculares estudiados no son neutrales respecto al contenido de grasa intramuscular, pero, también, que sus efectos no son constantes a lo largo del crecimiento. En este sentido, tanto la edad como el estado de engrasamiento pueden modificarlos. / This PhD is part of a line of research conducted in the Department of Animal Production of the Universitat de Lleida dedicated to the genetic improvement of pig meat quality, with particular reference to intramuscular fat content and composition. The PhD comprises four studies, with the first one focusing on the development of a method to jointly determine the content and composition of intramuscular fat from biopsies and small post-mortem samples and, in this way, to carry out studies with longitudinal data. It has been found that this particular methodology is useful and, in for intramuscular fat, small specimens of the target muscle are as informative as large samples of other muscles. In the second study the effect of age on the content and composition of the intramuscular and subcutaneous fat in the fattening period in Duroc pigs was investigated by an experiment using longitudinal data obtained following the methodology described above. It was concluded that a delay in the age of slaughter of the pig leads to an increase in intramuscular fat and oleic acid, although this comes at the cost of reducing the rate of lean growth. Moreover, it was proved that intramuscular and subcutaneous fat behaved differently in terms of fat accretion and composition and that the amount of fat itself affected composition. Whereas, for the intramuscular fat, values above the expected at a given age were because of increased monounsaturated fatty acid content, especially oleic acid, for the subcutaneous fat, they were due to the increased saturated fatty acid content. The final two studies considered whether allelic variation at the IGF-1 (insuline-like growth factor-1) and LEP (leptin) genes, as well as the concentration of IGF-1 and leptin in plasma, are associated to intramuscular fat content and composition and, if so, whether this is a function of age. It can be seen that the molecular polymorphisms studied are not neutral with regard to the content of intramuscular fat, but that their effects are not constant throughout the growing period. In this sense, both age and fatness can modify them.

La resistencia a la insulina es un estado patológico que se define como la incapacidad del organismo de responder normalmente a las acciones de la insulina. Este estado está ligado a la obesidad, al estilo sedentario de vida y es responsable en gran medida de la aparición de la diabetes de tipo 2. Aunque tradicionalmente el estudio de esta patología se había centrado en el metabolismo de carbohidratos, en las últimas décadas se ha producido un cambio hacia el estudio del metabolismo de ácidos grasos como principal promotor de esta enfermedad. De este modo, se ha demostrado una correlación entre la acumulación de lípidos en tejidos periféricos (hígado y músculo principalmente) y la aparición de resistencia a la insulina.El músculo es el responsable de la mayor parte del metabolismo de la glucosa en situaciones de estimulación por insulina. Esto confiere al músculo una vital importancia en el desarrollo de la resistencia a la insulina así como para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Numerosos estudios han descrito que la acumulación de especies derivadas de ácidos grasos en músculo, ya sea debido a un aporte excesivo de lípidos o a un fallo en su oxidación, conducen a una resistencia a la insulina. Estas especies derivadas de ácidos grasos actúan interfiriendo en la señalización de la insulina mediante la activación de una serie de proteínas, conduciendo a una desensibilización del músculo a las acciones de la insulina.En esta tesis se ha estudiado si un aumento en la oxidación de ácidos grasos en músculo es capaz de impedir la acumulación de sus derivados lipídicos y por lo tanto evitar la resistencia a la insulina ocasionada por ellos. Con este objetivo se han usado dos aproximaciones experimentales. En primer lugar, se ha evaluado el efecto de la sobreexpresión de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I), que es la enzima responsable del control del transporte de ácidos grasos a la mitocondria, donde serán oxidados, y en segundo lugar, se ha estudiado el efecto del C75, un activador de la CPT I recientemente descrito. Además, también se ha estudiado el papel de otra proteína recientemente involucrada en el control de la oxidación de ácidos grasos en músculo, la FAT/CD36. Todo esto se ha llevado a cabo usando como modelo de estudio células de músculo esquelético de rata L6E9.Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la sobreexpresión de CPT I ha resultado efectiva en el aumento de la oxidación de ácidos grasos, impidiendo su acumulación y por lo tanto protegiendo a la célula de la resistencia a la insulina. En cambio, se ha demostrado que el C75, a través de su activación a C75-CoA, se comporta como un inhibidor de la CPT I y por lo tanto de la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. Por último, no se ha podido demostrar que FAT/CD36 juegue un papel importante en la oxidación de ácidos grasos en las condiciones de estudio utilizadas. Estos resultados confirman la importancia del metabolismo lipídico en la resistencia a la insulina en músculo y describen la CPT I como una posible diana farmacológica para el tratamiento de la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2. Por otro lado describen una nueva acción del C75 sobre la actividad CPT I y sugieren la necesidad de realizar más estudios para esclarecer el papel de FAT/CD36 en la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. / Skeletal muscle is responsible for 70-80% of whole-body insulin-stimulated glucose uptake and is therefore generally considered the most important site of insulin resistance. Insulin resistance in skeletal muscle plays a major role in the pathogenesis of type 2 diabetes although the mechanism responsible remains unclear. Intramuscular lipid accumulation is evident in a wide set of experimental models, including humans, rodents and muscle cells in culture. These observations have promoted the so-called lipotoxic model of skeletal muscle insulin resistance, which proposes that high plasma fatty-acid levels observed in the obese or insulin-resistant state lead to muscle lipid accumulation, which in turn causes a predisposition towards decreased insulin sensitivity and worsening of the disease.In this thesis we have tested the hypothesis that increases in fatty-acid oxidation should protect from fatty acid induced-insulin resistance by reducing lipid accumulation in the muscle cell. For this purpose we have used two experimental approaches: a) the overexpression of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I), the rate-limiting enzyme in fatty acid import into mitochondria for oxidation, and b) study the effect of C75, a recently described CPT I agonist, in fatty-acid oxidation in muscle cells. Moreover we have studied the role of FAT/CD36, a protein recently described to be involved in beta-oxidation in muscle, in the rat skeletal muscle cultured cell line L6E9.Overexpression of LCPT I in L6E9 myotubes increased CPT I activity and palmitate oxidation, preventing lipid accumulation. As a result insulin sensitivity was completely restored. In contrast, C75 acted as an inhibitor of CPT I activity and palmitate oxidation, instead of an activator, both in muscle cells and in mice muscle in vivo. Finally, FAT/CD36 had not an important role in the control of fatty-acid oxidation in L6E9 myoutbes under our experimental conditions. These data confirm the importance of lipid metabolism in muscle insulin resistance and describe CPT I as a possible pharmacologic target for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes. Moreover, we describe a new role of C75 over CPT I activity and fatty-acid oxidation in skeletal muscle.

En la natura, la comunicació entre espècies o individus d'una mateixa espècie es produeix per l'emissió i captació per part dels diferents individus de compostos específics. Aquests compostos químics poden provocar diferents comportaments. Els compostos químics implicats en la comunicació sexual entre individus de la mateixa espècie s'anomenen feromones. La diversitat molecular dels components de les feromones sorgeix de variacions en un petit nombre d'etapes enzimàtiques conservades. La dessaturació dels èsters de coenzim A dels àcids grassos saturats és una reacció típica en les vies biosintètiques dels lepidòpters.Es pot definir la dessaturació com una reacció oxidativa que utilitza oxigen de forma molecular. Aquesta reacció està catalitzada per les dessaturases, que son enzims que contenen ferro no hemo. El complex funcional de la dessaturasa està format per tres proteïnes: la dessaturasa, el citocrom b5 i la citocrom b5 reductasa. En aquest complex la dessaturasa es considera que constitueix el pas més lent de la seqüència de reacció.La dessaturasa juga un paper essencial en la síntesi dels àcids grassos monoinsaturats que formen part de les membranes cel·lulars. Les glàndules feromonals dels lepidòpters contenen una família inusual de dessaturases que introdueixen dobles enllaços amb diferents estereoquímiques en diverses posicions. L'estudi de les dessaturases dut a terme en el grup de treball havia permès la identificació de les dessaturases implicades en la biosíntesi de la majoria de components de la feromona sexual de l'espècie Spodoptera littoralis. També s'havia estudiat la ruta de biosíntesi de les feromones de les processionàries del pi i del roure. El treball realitzat ha consistit en l'estudi de l'expressió de les dessaturases de les espècies plaga Trichoplusia ni i Spodoptera littoralis en un sistema heteròleg en llevat utilitzant vectors: constitutiu YEpOLEX i induïble pYEXTHS-BN. Es van introduir en aquests plasmidis els cDNAs que codifiquen per les dessaturases de les espècies T. ni i S. littoralis així com la proteïna quimèrica formada per la dessaturasa de T. ni fusionada a un domini homòleg a citocrom b5 de la dessaturasa de llevat i la pròpia dessaturasa de llevat en el vector constitutiu YEpOLEX. Les construccions corresponents es van expressar en una soca de llevat deficient en desaturases i elongases pròpies. De les soques resultants es va estudiar el perfil d'àcids grassos que es troben en les seves membranes quan aquests llevats creixen en diferents condicions de cultiu. El canvi del doble enllaç de la posició 9 (la natural pel llevat) a la posició 11 (que generen les dessaturases d'insecte) produeix diferències de comportament entre els llevats de manera que no tenen la mateixa capacitat d'adaptació als canvis ambientals que pateixen. L'estudi dels extractes lipídics per CG-EM dels llevats que expressen la delta-11 dessaturasa de S. littoralis ha permès detectar els compostos diènics E10,E12-tetradecadienoat de metil i E10,Z12-hexadecadienoat de metil, el primer compost és un component principal de la feromona de l'insecte del que no es coneixia l'enzim responsable de la seva biosíntesi. L'aparició d'aquest compost en els extractes permet dir que la dessaturasa de S. littoralis és un enzim bifuncional. També s'ha abordat la identificació i el clonatge de les dessaturases implicades en la biosíntesi de la feromona sexual de la processionària del pi. S'ha aconseguit identificar un fragment de DNA que codificaria per una proteïna que podria ésser una acil-CoA dessaturasa. Assaigs d'activitat posteriors han permès identificar aquesta proteïna com una delta-11 acil-CoA dessaturasa. Aquest enzim a més és capaç d'introduir un triple enllaç en la posició 11 de la cadena de l'àcid gras i de donar lloc a un compost diènic amb dobles enllaços en les posicions 11 i 13. / In nature, communication between species or individuals of the same species is produced by the emission and perception of different specific chemicals. The chemicals implied in the sex communication between individuals of the same species are called pheromones.The molecular diversity of pheromone compounds appears to arise from little changes in a few conserved enzymatic steps. Desaturation of saturated fatty acyl coenzyme A esters is a typical reaction in the lepidopteran biosynthetic pathways.Desaturase functional complex is formed for three proteins: the desaturase, a cythochrome b5 reductase and a cytochrome b5. We have studied the expression of fatty acid desaturases in the pests "Trichoplusia ni" and "Spodoptera littoralis" in an heterologous expression system in yeast using two plasmids: constitutive YEpOLEX and inducible pYEXTHS-BN. In these plasmids we have introduced the cDNAs for the fatty acid desaturases from S. littoralis, T. ni and this last one fused to a domain homologous to the cytochrome b5 from yeast desaturase. We also have worked with the yeast desaturase in the constitutive plasmid YEpOLEX.The constructs were introduced in a yeast strain desaturase and elongase deficient ("delta-eloI_delta-oleI"). From the resultant yeast strains we have studied the fatty acid profile which is found in their membranes when this yeast strains have been cultured in different conditions. Changing the position of the double bound from the 9th carbon to the 11th produces variations in yeast growth. The analysis of fatty acid profile from yeasts with "S. littoralis" delta-11 desaturase allowed to detect methyl E10, E12-tetradecadienoate and methyl E10, E12-hexadecadienoate. The first one is a compound of the insect pheromonal blend for which the enzyme responsible for its biosynthesis was not known. In this work we also have tackled identification and cloning of desaturases involved in the sex pheromone biosynthesis from pine processionary moth. We have isolated one DNA fragment which codifies for a acyl-CoA desaturase like protein. Subsequent activity assays have demonstrated this protein has delta-11 desaturase activity. We also could see that "T. pityocampa" is a trifunctional enzyme since it has delta-11 desaturase, acetylenase and delta-13 desaturase activities.

La obesidad y la diabetes tipo 2 son patologias en las cuales se ha demostrado una desregulación del metabolismo de ácidos grasos. Una acumulación de lípidos en otros tejidos distintos del tejido adiposo, entre los que sobresalen el músculo, páncreas e hígado conduce a la aparición de la resistencia a la insulina en el músculo, una secreción incontrolada de insulina en el páncreas y al desarollo de una esteatosis hepática. Estas enfermedades apuntan a la importancia del metabolismo de los ácidos grasos.Los ácidos grasos se oxidan mayoritariamente en mitocondrias y peroxisomas y este paso está facilitado por las carnitina acitransferasas. En esta tesis estudiaremos un miembro de esta familia, la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). CPT1 es un enzima que facilita el transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial, donde serán oxidados. Este proceso esta regulado por malonil-CoA, el inhibidor fisiológico de CPT1. El objetivo de este trabajo es identificar mediante análisis bioinformáticos y cinéticos la ubicación del malonil-CoA en las isoformas hepática y muscular de CPT1 (CPT1A y CPT1B). Con un buen modelo malonil-CoA/CPT1 se podrían diseñar fármacos para regular la β-oxidación de algunos ácidos grasos como palmitato y oleato, ya que sus niveles están estrechamente relacionados con patologías como la obesidad y la diabetes tipo 2.Aún no se ha resuelto el cristal de CPT1, posiblemente por ser una proteína integral de membrana. Por ello hemos recurrido a una aproximación bioinformática y análisis de "Docking" in silico, como método predictivo de las posibles interacciones de malonil-CoA con CPT1. El modelo 3D obtenido presenta dos sitios de unión de malonil-CoA, situados de forma opuesta en el canal catalítico, sitio A y sitio O. La validez de este modelo de "Docking" ha sido confirmada mediante estudio cinético de competición del inhibidor con los sustratos de CPT1A, carnitina y palmitoil-CoA y también mediante análisis de mutantes de CPT1A. Malonil-CoA es un inhibidor competitivo de CPT1 respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor mixto lineal de CPT1A respecto a la carnitina. Estos datos están de acuerdo con el modelo 3D propuesto de interacción de malonil-CoA, carnitina y palmitoil-CoA.En este trabajo proponemos por vez primera un modelo 3D de la isoforma muscular, CPT1B que ha resultado muy similar, como era de esperar, al de la isoforma hepática. Mediante estudios de mutagénesis dirigida hemos confirmado la ubicación de los residuos catalíticos y de un residuo implicado en la sensibilidad a malonil-CoA.Diversos estudios presentan al enzima CPT1 como potencial diana para el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. También el enzima ácido graso sintasa (FAS) se ha propuesto como diana para el tratamiento de la obesidad. En este trabajo hemos demostrado que C75, una lactona ciclica de origen sintético, no solo actúa sobre FAS sino también sobre CPT1 y hemos aportado nueva información sobre el mecanismo de acción de esta molécula sobre la actividad CPT1 in vitro e in vivo. Los análisis por MALDI-TOF y HPLC-MS/MS y los estudios cinéticos y estructurales confirman que C75 es transformado in vitro e in vivo en su derivado CoA, el C75-CoA y bajo esta forma actúa como un inhibidor potente y reversible de CPT1. Además C75-CoA es un inhibidor competitivo respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor competitivo mixto respecto al sustrato carnitina. Los resultados del análisis de Docking de una molécula de C75-CoA en CPT1A confirman los resultados cinéticos obtenidos. Este estudio abre las puertas para el diseño de nuevos fármacos basados en la molécula de C75. / Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) is an ezyme that facilitates the transport of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix for their oxidation. This process is regulated by malonyl-CoA, the physiological inhibitor of CPT1. The aim of this work is to identify by biocomputing and kinetic analyses the location of malonyl-CoA in the hepatic and muscular isoforms of CPT1 (CPT1A and CPT1B). The use of a good structural model of malonyl-CoA/CPT1 interaction might be useful for the design of drugs to control the regulation of β-oxidation of some fatty acids as palmitate and oleate, since their levels are closly linked whith pathologies such as obesity and diabetes type 2.Herein we propose a 3D model for CPT1 that presents two different binding sites for malonyl-CoA, situated in opposite sides in the catalytic channel, as shown by molecular Docking analisis. The validity of this Docking has been confirmed by competition kinetics studies of malonyl-CoA with both CPT1A substrates, carnitine and palmitoyl-CoA and also by analysis of specific CPT1A mutants. Malonil-CoA is a competitive inhibitor and a mixed linear inhibitor of CPT1 with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. These data are in accordance with the 3D model proposed for the interactions of these molecules with CPT1.Several studies reported that CPT1 is a potential target for the treatment of obesity and type 2 diabetes. Here we show that C75, a synthetic inhibitor of the fatty acid synthase (FAS) not only acts on this enzyme but also on CPT1. We have given new information about the mechanism of action of C75 on CPT1 activity in vitro and in vivo. MALDI-TOF and HPLC-MS/MS analyses and kinetic and structural studies confirm that C75 is transformed in vitro and in vivo in its CoA derivative, C75-CoA and under this form acts as a powerful and reversible inhibitor of CPT1. Also, C75-CoA is a competitive inhibitor and a competitive mixed inhibitor with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. The Docking analysis of C75-CoA in CPT1A confirm the kinetic results obtained. This study gives more informations for the design of new medicines based on the C75 molecule.

La arteriosclerosis es una enfermedad de origen multifactorial, principal causa de deterioro en la calidad de vida o de mortalidad precoz en los países industrializados, debido a que desemboca con frecuencia en accidentes vasculares como el infarto agudo de miocardio. Entre los factores de riesgo cuya corrección puede conducir a la prevención del desarrollo de la arteriosclerosis destacan las hiperlipoproteinemias. Los fibratos son fármacos hipolipemiantes eficaces en el tratamiento de las hiperlipoproteinemias tipo IIa, Hb, III y IV.El mecanismo por el cual los fibratos ejercen la acción hipolipemiante, así como las bases bioquímicas de esta acción, no están totalmente clarificados. Se sabe que la composición en ácidos grasos de las lipoproteínas plasmáticas puede afectar enormemente el metabolismo de las mismas, de modo que cualquier modificación en los enzimas de síntesis y modificación de los ácidos grasos podría estar relacionada con el efecto hipolipemiante de estos farmacos. Por ello, resulta de gran interés el estudio de la acción de los fibratos sobre dichos enzimas. En concreto, en este trabajo se ha estudiado el efecto de la administración de clofibrato (CFB), bezafibrato (BFB) y gemfibrozilo (GFB) en rata sobre los siguientes enzimas: palmitoil-CoA sintetasa, palmitoil-CoA hidrolasa, elongasas microsomales, desaturasas microsomales y cadenas de transporte electrónico microsomal.Por otro lado, no debe olvidarse que los fibratos son fármacos cuya administración produce, principalmente en roedores, proliferación peroxisómica. Por ello, se ha realizado un estudio temporal de cada una de las actividades enzimáticas antes nombradas, junta con la beta-oxidación peroxisómica, marcador de la proliferación de este orgánulo. Asimismo, se ha realizado un estudio paralelo en cobayas, especie refractaria a la inducción peroxisómica.El tratamiento de los animales se ha realizado administrando los fármacos conjuntamente con la dieta a dosis equimolares calculadas en función de la dosis habitual de CFB (0.3 % p/p).El tratamiento de ratas con CFB, BFB y GFB produce un marcado incremento en la actividad beta-oxidación peroxisómica y en el tamaño relativo del hígado, hechos que indican la acción proliferadora peroxisómica de los fibratos, que se manifiesta con un orden de potencia BFB>CFB>GFB. Se ha encontrado una correlación positiva entre ambos fenómenos en rata. En cobayas, especie refractaria, ninguno de los dos parámetros se incrementa.La evolución ponderal de las ratas control y tratadas es prácticamente idéntica durante la primera semana de tratamiento, mientras que a partir del día 7 (BFB) o 8-9 (CFB y GFB) de tratamiento, se observa un peso superior en el grupo control respecto a los grupos tratados con CFB, BFB y GFB. Ello contrasta con un mayor consumo diario de alimento en los grupos tratados con BFB y GFB.Los tres fármacos estudiados se han mostrado efectivos en cuanto a la reducción de los niveles de colesterol y triglicéridos plasmáticos en ratas y en cobayas normolipidémicos. Se han encontrado correlaciones inversas entre la actividad beta-oxidación peroxisómica y los niveles de colesterol o triglicéridos plasmáticos, cuyos coeficientes de determinación indican que la proliferación peroxisómica únicamente contribuiría alrededor de un 30 % al efecto hipolipemiante.Antes de iniciar la determinación de las actividades enzimáticas en animales control y tratados, se comprobó que el tratamiento con fibratos ni alteraba el patrón de distribución celular hepático ni afectaba la concentración proteica en el hígado.Si bien las actividades palmitoil-CoA hidrolasa de localización mitocondrial no resultaron significativamente modificadas, el tratamiento con fibratos produce un marcado incremento en la actividad palmitoil-CoA hidrolasa microsomal y, sobre todo, citosólica. El tratamiento de cobayas con GFB no ha modificado ninguna de estas actividades. Existe una correlación positiva entre las actividades S-oxidación peroxisómica y palmitoil-CoA hidrolasa citosólica que refleja una contribución alrededor de un 50 % de la proliferación peroxisómica al incremento de actividad hidrolasa.La actividad palmitoil-CoA sintetasa microsomal resulta enormemente inducida has la administración de fibratos a ratas, con un orden de potencia BFB>CFB>GFB. Se ha encontrado una correlación positiva entre las actividades de beta-oxidación peroxisómica y palmitoil-CoA sintetasa que permite suponer que alrededor de un 50 % del incremento de esta actividad enzimática es consecuencia del fenómeno de inducción peroxisómica, dependencia que resulta confirmada por el hecho de que no se produce incremento de la actividad sintetasa en cobayas tratados con GFB. El incremento en la actividad sintetasa parece constituir una respuesta compensatoria del organismo al aumento de la actividad hidrolasa, con el fin de mantener un equilibrio entre ambas.El tratamiento de ratas con fibratos produce un marcado incremento en la actividad de elongación de ácidos grasos saturados, mientras que únicamente el GFB es capaz de incrementar la de substratos saturados, y ninguna de ellos resulta efectivo respecto al incremento de la elongación de substratos poliinsaturados; ello apoya la hipótesis acerca de la existencia de tres sistemas de elongación distintos para cada uno de estos substratos. En cambio, la elongación de ácidos grasos experimenta un incremento en cobayas tratados con GFB sea cual sea el substrato utilizado. Los incrementos detectados en las actividades de elongación parecen ser prácticamente independientes de la proliferación peroxisómica, y podrían explicarse como una respuesta compensatoria del organismo a la inhibición "in situ" de los enzimas, o bien como consecuencia de una mayor demanda de substrato para la delta·9 desaturación.El tratamiento de ratas con fibratos produce un apreciable incremento en las actividades delta-9 desturasa y delta-5 desaturasa, bien correlacionado con la proliferación peroxisómica, y con un orden de potencia BFB>CFB=GFB. Al menos en parte, la sobrecarga de substrato producida por el incremento en la elongaci6n de ácidos grasos saturados puede contribuir al efecto sobre la delta-9 desaturasa. A diferencia de los casos anteriores, el incremento en la actividad delta-6 desaturasa es independiente de la proliferación peroxisómica, y es máximo en las ratas tratadas con GFB. Es posible que la disminución en la actividad producida por los fármacos "in situ" provoque una respuesta compensatoria del animal, responsable del incremento detectado "in vivo".Respecto a las cadenas de transporte electrónico, cabe destacar que la actividad NADH citocromo b(s) reductasa no resulta modificada tras el tratamiento de ratas con ninguno de los fibratos estudiados. En cambio, la actividad NADH citocromo c reductasa sufre una notable disminución, tanto en rata como en cobaya, que es independiente de la proliferación peroxisómica. La reducci6n en la actividad NADH citocromo c reductasa podría ser debida al predominio del impedimento del transporte electrónico desde la reductasa al citocromo b(s).Por último, la actividad NADPH citocromo e reductasa resulta incrementada en ratas tratadas con fibratos, con un orden de potencia paralelo al descrito para la proliferación peroxisómica (BFB>CFB>GFB), mientras que no se produce modificaci6n en esta actividad tras el tratamiento de cobayas con GFB. Sin embargo, la inducción peroxisómica contribuye únicamente alrededor de un 30 % al incremento en la actividad NADPH citocromo e reductasa, ya que éste estaría ligado a la inducción del citocromo P450 y, por tanto la relación con el fenómeno de la proliferación peroxisómica seria indirecta.Como conclusiones derivadas de los resultados expuestos, puede destacarse:- De los parámetros no enzimáticos, únicamente la hepatomegalia depende mayoritariamente del fenómeno de la inducción peroxisómica, por lo que no se produce en la especie humana. Tampoco parecen producirse en el hombre los efectos detectados en rata sobre la evolución ponderal y el consumo de alimentos, aunque parecen ser independientes de la inducción peroxisómica. Los efectos sobre los lípidos plasmáticos tampoco dependen de la proliferación peroxisómica, por lo que se producen en especies refractarias como los humanos.- Ninguna de las actividades enzimáticas cuya modificación depende en gran medida de la proliferación peroxisómica es esperable en humanos ni parece estar relacionada con el efecto hipolipemiante de los fibratos. En cambio, las modificaciones en la actividad NADH citocromo c reductasa, palmitoi]-CoA hidrolasa microsomal, delta-6 desaturasa, y elongasa, al ser mayoritariamente independientes de la proliferaci6n peroxisómica, pueden producirse también en especies refractarias a este fen6meno, y, por tanto podrían contribuir en alguna medida al efecto hipolipemiante de los fibratos en humanos. / The effect in vivo of c10fibrate (CFB), bezafibrate (BFB) and gemfibrozil (GFB) on some hepatic enzyme activities related to fatty acid biosynthesis in rats and guinea-pig has been studied. The animals were distributed randomly into four groups, which were fed, respectively, a control diet or a diet containing 0.3 % CFB, 0.45 % BFB and 0.3 % GFB (equimolar doses).A 15-days treatment of rats with CFB, BFB, and CFB caused a significant reduction in the increase of body weight accompanied with an increase in food intake in groups treated with BFB and GFB. The administration of the three drugs produced gross hepatomegaly and increase in peroxisomal beta-oxidation, being both parameters strongly correlated.Plasma cholesterol and triglyceride levels were reduced in treated animals. There is an inverse correlation between these parameters and peroxisomal beta-oxidation.The enzyme activities studied could be distributed in three groups:1. Those non-modified after treatment of rats with fibrates: mitochondrial palmitoyl-CoA hydrolase, NADH cytochrome b(s) reductase and elongation or polyunsaturated fatty acids.2. Those whose activity was modified in treated rats in correlation with peroxisomal proliferation: cytosolic palmitoyl-CoA hydrolase, microsomal palmitoyl-CoA synthetase, delta-9 and delta-5 desaturation of ratty acids, and NADPH cytochrome c reductase. Due to the relation with peroxisomal induction, none of these activities was modified in CFB-treated guinea-pigs, and no modification is expected in humans after fibrate therapy.3. Activities modified by fibrate treatment in rats independently from peroxisomal induction: microsomal palmitoyl-CoA hydrolase, elongation of saturated and monounsaturated fatty acids, NADH cytochrome c reductase and delta-6 desaturase. Elongation and NADH cytocrome c reductase activities are also modified in a species refractary to peroxisomal proliferation, as guinea-pig, after GFB treatment. According to the absence or correlation with the proliferation of peroxisomes, one could expect modifications in these activities in humans treated with fibrates; for this reason they could be related to the hypolipidemic effect of these drugs in man.