El comportament reproductor en moltes espècies d'insectes implica l'alliberament per part de la femella d'una sèrie de compostos químics volàtils, anomenats feromones, els quals són detectats de forma molt específica, a gran distància i en concentracions ínfimes pel mascle, permetent la còpula, que condueix a la reproducció de l'insecte. Gran part de les feromones identificades semblen estar relacionades amb els àcids grassos més comuns en la natura, però amb algunes diferències importants, tot fent aquestes estructures relativament fàcils de sintetitzar. Shorey va demostrar que aquests compostos podien ser utilitzats per reduir de forma dràstica la població d'una espècie plaga, mitjançant la inhibició de la seva comunicació sexual, essent això el primer indici d'un control de plagues per mètodes no tòxics. Una de les característiques més importants d'aquests semioquímics és la presència de dobles enllaços, en diferents posicions de la cadena i de diversa configuració. Els enzims encarregats d'aquesta biotransformació són les acil-CoA dessaturases. Són enzims lligats a la membrana del reticle endoplasmàtic, dependents d'oxigen i d'una cadena de transport electrònic, que contenen ferro en el seu centre catalític actiu, però de tipus no-hemo. Bloomfield i Bloch van mostrar que en aquesta conversió d'un enllaç simple a un de doble no s'introdueix cap molècula d'oxigen. La mescla feromonal de l'espècie plaga Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae) és un exemple molt interessant de l'activitat d'aquests enzims donat que presenta una delta-11 dessaturasa que transforma l'àcid palmític en l'àcid (Z)-11-hexadecenoic i l'àcid mirístic en els àcids (E) i (Z)-11-tetradecenoics; una delta-9 dessaturasa que forneix l'àcid (Z,E)-9,11-tetradecadienoic a partir de l'isòmer E i una dessaturasa especial, una 1,4-dessaturasa, que transforma l'àcid (Z)-11-tetradecenoic en l'(E,E)-10,12-tetradecadienoic . El present treball intenta aprofundir en l'estudi químic d'aquesta important família d'enzims, tant a nivell de criptoregioquímica (lloc inicial d'oxidació) com d'estereoquímica, mitjançant la síntesi de precursors deuterats adequats, ensems de realitzar estudis d'inhibició amb derivats ciclopropènics, tant alcohols com àcids grassos. Al mateix temps, es pretén dur a terme el clonatge i expressió funcional del cDNA que les codifica. Aquests estudis intentaran discernir si la 1,4-dessaturasa és la mateixa delta-9 dessaturasa o si es tracta de dos enzims totalment diferents.Per altra banda es tracta d'aprofitar la delta-9 dessaturasa present al llevat S. cerevisiae per tal de produir d'una forma eficient i econòmica àcids grassos diènics conjugats d'alt valor afegit, com és el cas de l'àcid (Z,E)-9,11-octadecadienoic, el qual està descrit que posseeix una destacada activitat antitumoral en cultius cel·lulars. A més, d'optimitzar-se aquest sistema, també es podrien obtenir diverses estructures dièniques o eníniques presents en diferents complexos feromonals d'insectes plaga.Un altre punt de la Tesi tracta de l'optimització d'un procediment sintètic de formació de derivats del coenzim A tot utilitzant la fase sòlida i la reacció de transtioesterificació. Finalment, es pretén estudiar les característiques bioquímiques de les diferències fenotípiques trobades en les espécies plaga Thaumetopoea pityocampa (o processionària del pi) i Thaumetopoea processionea (o processionària del roure). La mescla feromonal d'ambdues espécies difereix únicament en la presència d'una acetilenasa i d'una reductasa altament específica en l'espécie parasitària del pi.

Diferents estudis assenyalen que el consum de peix, a través dels àcids grassos poliinsaturats omega-3 (AGPI omega-3), pot prevenir malalties vasculars lligades a l'aterosclerosi. Els AGPI omega -3 són altament insaturats, la qual cosa els fa especialment susceptibles a l'atac oxidatiu. Com que la lipoperoxidació de les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) és un dels esdeveniments clau en les etapes inicials de la formació de la placa d'ateroma, això faria d'una suplementació amb oli de peix de la dieta un factor potencialment pro-aterogènic. Així doncs, hi ha d'haver altres mecanismes que contrarestin l'efecte pro-oxidant dels AGPI omega-3 i que expliquin les seves propietats antiaterogèniques. A partir dels AGPI omega-6 i omega-3, se sintetitzen dues sèries diferents d'eicosanoids. Generalment, els primers presenten una activitat biològica més gran que els segons. Les dues sèries d'eicosanoids constitueixen un element clau en les accions diferenciades dels AGPI omega-3 respecte dels AGPI omega -6. Entre les accions del AGPI omega -3, i pel que fa a l'aterogènesi, hipotetitzem la modulació de la producció de radicals lliures com l'òxid nítric (·NO), sintetitzat per l'enzim eNOS en l'endoteli vascular, i d'efecte relaxador, i l'anió superòxid, d'efecte vasoconstrictor.Per tal d'estudiar els efectes d'una suplementació amb AGPI omega-6 i amb AGPI omega -3 en vasos i en lipoproteïnes, s'alimentaren rates Sprague-Dawley, amb una dieta rica o bé en oli de blat de moro (5%, ric en AGPI omega -6), o bé en oli de peix (5%, ric en AGPI omega-3) durant 8 setmanes. Part dels animals, a més, reberen una suplementació addicional de L-arginina lliure, substrat de l'eNOS. Després del període d'alimentació, els animals eren sacrificats i se n'extreia l'aorta (per fer estudis vasculars) i la sang (per obtenir-ne les lipoproteïnes de molt baixa densitat (VLDL) i les LDL).Els estudis en bany d'òrgans van permetre d'observar un augment en la relaxació induïda per acetilcolina i mediada per ·NO en les rates suplementades amb oli de peix. L'augment d'aquestes relaxacions no era degut ni a una menor producció de superòxid (O2·-, principal agent limitador de la biodisponibilitat vascular de ·NO), ni a una major resposta del vas al ·NO (no hi havia diferències en les relaxacions induïdes per nitroprussiat sòdic, un donador de ·NO).D'altra banda, també augmentava, en les rates suplementades amb oli de peix, la producció basal de ·NO (avaluada per ressonància de spin electrònic), fenomen vinculat, a més, a l'estimulació de l'expressió del ARNm i de la proteïna d'eNOS. Això s'acompanyava d'una davallada del contingut de L-arginina lliure del teixit i d'un augment del GMPc. Quant a la suplementació de L-arginina en les dietes, aquesta produïa també un augment, en tots dos tipus d'olis, de la producció vascular de ·NO.Pel que fa a la fracció de VLDL+LDL, no s'hi observaven canvis deguts a la dieta en la mobilitat electroforètica, que és un indicador del grau d'oxidació nadiu d'aquestes. En canvi, la suplementació amb oli de peix davallava les reserves d'alfa-tocoferol de les lipoproteïnes. En consonància amb això, davant un atac oxidatiu ex vivo induït per Cu2+, les lipoproteïnes de les rates suplementades amb oli de peix, iniciaven l'oxidació abans, però alhora s'hi propagava menys ràpidament i el nivell màxim de diens conjugats era més baix.L'augment de la producció vascular de ·NO generat per la suplementació amb oli de peix, és un mecanisme potencialment antiaterogènic, a través del manteniment del to vascular mitjançant l'activitat vasorelaxadora del ·NO. A banda d'això, el ·NO, d'acord amb diversos estudis in vitro, actua com a antioxidant en lipoproteïnes que podria interferir en la propagació de l'oxidació in vivo i explicar la paradoxa de l'oli de peix en la prevenció de l'aterosclerosi.

La cetogènesi és el procés mitocondrial pel qual es sintetitzen els cossos cetònics (acetoacetat, 3-hidroxibutirat i acetona) a partir de l’acetil-CoA provinent de la degradació dels àcids grassos. És un procés mitocondrial i l’enzim clau de la via és la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa mitocondrial (HMGCS2). La regulació de l’HMGCS2 ha estat àmpliament estudiada i es coneixen les hormones (glucagó, insulina, dexametasona), situacions metabòliques (dieta grassa, dejuni-realimentació, lactància, exercici perllongat) o patològiques (diabetis) que la regulen. Durant la darrera dècada s’atribueix als cossos cetònics un paper com a molècules senyalitzadores. Per tal d’aprofundir en l’estudi d’aquest paper, en la present tesi doctoral ens hem plantejat estudiar les conseqüències de la modificació de l’expressió del gen HMGCS2. Amb aquest objectiu, hem realitzat experiments en cèl·lules HepG2 de sobreexpressió i disminució de l’expressió del gen HMGCS2 que ens han permès demostrar que l’HMGCS2 és necessària per la inducció de l’oxidació d’àcids grassos mitjançada per PPARα. També hem demostrat que l’HMGCS2 regula positivament l’expressió d’FGF21, un gen diana de PPARα implicat en l’homeòstasi energètica per un mecanisme que implica la sirtuina SIRT1. D’altra banda, s’ha reduït l’expressió del gen HMGCS2 en ratolins de forma aguda mitjançant la injecció d’adenovirus codificants per shRNAs i se n’ha analitzat el fenotip. S’ha identificat, mitjançant un anàlisi massiu d’expressió gènica, el gen Fat specific protein 27 (Fsp27/CIDEC), una proteïna implicada en la formació de gotes lipídiques, com a potencial gen diana de l’HMGCS2. Finalment, s’ha aprofundit en els mecanismes de regulació del gen Fsp27/CIDEC demostrant que aquest s’indueix fortament durant el dejuni a nivell hepàtic. / Ketogenesis is a mitochodrial pathway by which ketone bodies (acetoacetat, 3-hydroxybutyrate and acetone) are syntesized from the acetyl- CoA comming from fatty acid oxidation. The key enzyme of this pathway is mitochondrial 3-hydroxy-3-metylglutaryl-CoA synthase (HMGCS2). The regulation of HMGCS2 has been widely studied: it is known that hormones (glucagon, insulin, dexamethasone), metabolic situations (dietary fat, fastfeeding, lactation, prolonged exercise) or pathologies (diabetes) regulate its expression. During the last decade, evidence is emerging that ketone bodies could act as signaling molecules. To further study this role, in this thesis we studied the consequences of the modification of HMGCS2 gene expression. To this end, we performed experiments in HepG2 cells by overexpression and down regulation of HMGCS2 gene, which allowed us to demonstrate that HMGCS2 is necessary for the induction of fatty acid oxidation mediated by PPARα. We have also shown that HMGCS2 positively regulates the expression of FGF21, a PPARα target gene involved in energy homeostasis by a mechanism that involves sirtuin SIRT1. On the other hand, we have down regulated HMGCS2 acutely in mice by injection of adenovirus encoding for shRNAs and we have analysed the phenotype of these mice. Through a massive analysis of gene expression, we have identified Fat specific protein 27 (Fsp27/CIDEC), a protein involved in the formation of lipid droplets, as a potential target of HMGCS2. Finally, we explored the mechanisms of Fsp27/CIDEC gene regulation demonstrating that it is strongly induced during fasting in liver.

L’enzim Carnitina palmitoïltransferasa 1 (CPT1) permet l’entrada dels àcids grassos de cadena llarga a la matriu mitocondrial per tal de ser degradats i utilitzats així com a substrat energètic. El malonil-CoA, primer intermediari en la síntesi d’àcids grassos, és un inhibidor al•lostèric de CPT1, fet que permet una regulació coordinada entre la síntesi i l’oxidació d’àcids grassos en un mateix teixit, evitant així que es donin ambdós processos alhora. Una inhibició específica de CPT1, doncs, és una bona aproximació farmacològica per al tractament de desordres metabòlics que impliquin acumulació d’àcids grassos i resistència a insulina, com la diabetis tipus 2 i l’obesitat. La present tesi doctoral s’ha centrat en l’estudi de la regulació per malonil-CoA dels isotips hepàtic (CPT1A) i muscular (CPT1B) de CPT1, així com en l’estudi de l’isotip més recentment descrit de la proteïna d’expressió en cervell, CPT1C. Per tal d’aprofundir en l’estudi de determinants moleculars de CPT1 que marquen el seu grau d’inhibició per malonil-CoA, s’han realitzat construccions mutants i delecionades dels enzims CPT1A i CPT1B i s’han expressat en el llevat “Pichia pastoris”. Mitjançant l’anàlisi del paràmetre IC50, hem demostrat que la regió aminoterminal de l’enzim CPT1A de rata (residus 1-18) exerceix un efecte dominant sobre les posicions Glu590 i Met593 en determinar la sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA. Paral•lament, s’han generat construccions amb la seqüència de l’enzim CPT1 de porc, que presenta una gran diferència en el seu comportament enzimàtic quan es compara amb l’enzim humà, tant l’isotip hepàtic com el muscular. En aquest treball s’ha identificat l’existència d’un determinant negatiu en la posició Glu17 que explica parcialment la menor sensibilitat d’aquest enzim a la inhibició pel malonil-CoA. A més a més, s’ha construït un model 3-D in silico de la CPT1B humana, que permet justificar observacions experimentals mostrades en aquest treball, tot i que no explica encara les diferències en el comportament cinètic entre els isotips hepàtics i musculars de la proteïna. CPT1C és l’isotip descrit més recentment, i encara avui se’n desconeix la seva funció, existeix controvèrsia respecte a la seva distribució subcel•lular i no se n’han descrit els mecanismes que en regulen l’expressió. Els resultats mostrats en aquest treball demostren que CPT1C és una proteïna sense activitat enzimàtica, independentment de la característica extensió C-terminal que presenta respecte els altres isotips. D’altra banda, el patró d’expressió observat del gen Cpt1c no és compatible amb el paper que se li ha atorgat sobre la regulació de la ingesta. A més a més, hem identificat l’expressió d’una isoforma soluble de CPT1C en cervell humà adult, que ofereix una eina útil per a l’obtenció d’un cristall de la regió C-terminal citosòlica de CPT1C. / STRUCTURE-FUNCTION RELATIONSHIP OF CPT1 PROTEINS CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1) enables the entry of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix, in order to be degraded and used as energetic substrate. Malonyl-CoA, the first intermediate in the synthesis of fatty acids, is an allosteric inhibitor of CPT1. Through CPT1 inhibition, it establishes a coordinated regulation between fatty acid synthesis and oxidation, thus preventing that both pathways coexist at the same time. A specific inhibition of CPT1 is therefore a good approximation or the pharmacological treatment of metabolic disorders involving accumulation of fatty acids and nsulin resistance, such as type-2 diabetes and obesity. This thesis has focused on the study of malonyl-CoA regulation of both CPT1A and CPT1B isotypes. In addition, we studied the more recently described isotype of the protein, CPT1C. To gain insight into the study of CPT1 molecular determinants of malonyl-CoA inhibition, mutants of both CPT1A and CPT1B enzymes were expressed in yeast Pichia pastoris. Analysis of the IC50 parameter, demonstrated that the aminoterminal region (residues 1-18) of the rat CPT1A enzyme has a dominant effect over Glu590 and Met593 positions in determining its sensitivity to malonyl-CoA inhibition. We also identified the existence of a negative determinant within the sequence of pig CPT1A (position Glu17), which partially explains the low sensitivity of this enzyme to malonyl-CoA inhibition. In addition, we designed an in silico 3-D model of human CPT1B, which still does not explain the kinetic differences between liver and muscle isotypes of the protein, but justifies some of our experimental data. CPT1C is the more recently described isotype of the protein. Its function still remains unknown, and controversy exists regarding its subcellular distribution and the mechanisms that regulate its expression. Here we show that CPT1C is a protein without enzymatic activity, regardless of its characteristic C-terminal extension, compared to the other isotypes. Moreover, the observed gene expression pattern is not compatible with its given role on the regulation of food intake. In addition, we identified the expression of a soluble isoform of CPT1C in human adult brain, providing a useful tool for obtaining a crystalline structure of the cytosolic C-terminal region of CPT1.

La tesi es compon de tres estudis que es van realitzar amb la finalitat de disminuir el cost analític que suposa la determinació rutinària de la greix intramuscular (GIM) i de l'àcid oleic, així com d’investigar els mecanismes biològics de la deposició del greix. En el primer estudi, es va desenvolupar un mètode analític d'alt rendiment per a la quantificació de l'àcid oleic en carn de porc, mitjançant un sistema d'anàlisi per injecció de flux basat en una espectrometria de masses amb ionització per electrosprai. El nou mètode, que permet una quantificació ràpida del contingut en àcid oleic en mostres petites, podria ser adequat per a la classificació de porcs i canals pel seu contingut en àcid oleic. El segon estudi, avalua l'ús d'indicadors lipídics en sèrum com biomarcadors precoços de la composició i contingut del GIM i del greix subcutani. Cap dels indicadors lipídics investigats es recomanen com un biomarcador precoç del greix. En l’últim estudi, es va examinar l'efecte de la selecció contra greix dorsal a GIM constant sobre el patró d'expressió proteica hepàtica i la composició d'àcids grassos en fetge, múscul i greix subcutani . Es conclou, que el patró d'expressió proteica hepàtica en porcs està afectat per la selecció contra greix dorsal / La tesis se compone de tres estudios que se realizaron con el fin de disminuir el coste analítico que supone la determinación rutinaria de la grasa intramuscular (GIM) y del ácido oleico, así cómo de investigar los mecanismos biológicos de la deposición de la grasa. En el primer estudio se desarrolló un método analítico de alto rendimiento para la cuantificación del ácido oleíco en carne de cerdo usando un sistema de análisis por inyección de flujo basado en una espectrometría de masas con ionización por electrospray. El nuevo método, el cual permite una cuantificación rápida del contenido en oleico en muestras pequeñas, podría ser adecuado para la clasificación de cerdos y canales por su contenido en oleico. El segundo estudio evalúa el uso de indicadores lipídicos en suero cómo biomarcadores de la composición y contenido de la GIM y la grasa subcutánea a edades tempranas. Ninguno de los indicadores lipídicos investigados se recomiendan que se usen cómo un biomarcador precoz de la grasa. El último estudio examinó el efecto de la selección contra grasa dorsal a constante GIM sobre la expresión proteíca hepática, y la composición de ácidos grasos en hígado, músculo y grasa subcutánea. Se concluye que el patrón de expresión proteíca hepática en cerdos es afectada por la selección contra grasa dorsal. / The thesis comprises of three studies, with the aim at decreasing the cost of routinely intramuscular fat (IMF) and acid oleic determinations, as well as investigating the biological mechanisms of fat deposition. In the first study, it was developed a high-throughput analytical method for oleic fatty acid quantification in pork using a flow injection analysis system based on electrospray ionisation mass spectrometry. The new method, which allows for a rapid quantification of oleic content in small pork samples, may be used as a suitable method for ranking pigs and carcasses by oleic content. The second study assesses the usefulness of serum lipid indicators as early biomarkers of IMF and subcutaneous fat content and composition. None of the serum lipid indicators investigated is recommended to be used as an early biomarker of fatness. The last study examined the effect of selection against backfat thickness at constant IMF on hepatic protein expression and fatty acid composition in liver, muscle, and subcutaneous fat. It is concluded that hepatic protein expression pattern in pigs is affected by selection for decreased backfat thickness.