Es coneix com a segment d’activació de la procarboxipeptidasa A (PCPA) al fragment proteic situat a l’extrem N-terminal de la molècula que és separat de l’enzim actiu mitjançant activació del zimogen per proteòlisi limitada. Aquest treball té el seu fonament en l’estudi de l’estructura primària i del procés de degradació d’aquest segment d’activació durant l’activació del zimogen.. El coneixement previ sobre aquests fragments o dominis proteics era escàs a l’inici del treball. La seva llargada – aproximadament 100 residus – li conferia un interès intrínsec donat que obligava a un procés de seqüenciació i a la prèvia posada a punt d’un mètode d’anàlisi d’aminoàcids que també constitueix part del cos d’aquesta tesi. Aquest mètode es basa en la derivatització pre-columna amb clorur de dabsil i permet l’anàlisi de tots els aminoàcids proteïnogènics amb elevada reproduïbilitat i en un temps d’anàlisi estàndard de 25 min. L’estructura primària del segment d’activació de 94 aminoàcids és altament homòloga amb la d’altres espècies ja seqüenciades i presenta una elevada proporció de residus acídics i hidrofòbics. Prediccions d’estructura secundària fetes a partir de la seqüència indiquen una estructura globular compacta amb elevada proporció d’hèlix α. La PCPA porcina es presenta en forma monomèrica i en forma de complex binari amb la proproteasa E (PPE). Es va comprovar que les dues formes de PCPA són idèntiques quant a pes molecular, llargada del segment d’activació, mapes peptídics dels mateixos i activació tríptica. Tanmateix, la subunitat PPE es comporta com un modest inhibidor de l’activitat CPA, el que es reflecteix en el procés d’activació. Així, en el cas del complex binari, es produeix una inhibició inicial seguida d’una acceleració en la generació d’activitat que és probablement la conseqüència de la pertorbació inicial i la col·laboració posterior de la PPE en el procés d’activació proteolítica. Tant en la proteïna monomèrica com en el complex l’aparició del segment d’activació primari és immediata a l’inici de l’activació tríptica. Per tant, les diferències en les cinètiques i corbes d’activació són explicables a partir d’interaccions diferencials amb el segment en procés de degradació. El seguiment del procés d’activació tríptica mitjançant tècniques de HPLC i electroforesi permet observar un clar paral·lelisme entre l’aparició d’activitat i la degradació del segment, la qual es produeix de manera gradual a partir del seu extrem C-terminal. Les nostres anàlisis permeten proposar la seqüencialitat dels talls tríptics i fer una aproximació sobre les zones accessibles a l’estructura terciària, demostrant a la vegada la col·laboració de la pròpia CPA en el seu procés d’activació. / Se denomina segmento de activación de la procarboxipeptidasa A (PCPA) al fragmento proteico situado en el extremo N-terminal de la molécula y que se separa de la enzima mediante activación del zimógeno por proteólisis limitada. Este trabajo se basa en el estudio de la estructura primaria y del proceso de degradación de este segmento de activación durante la activación del zimógeno. El conocimiento previo sobre estos fragmentos o dominios proteicos era escaso al inicio del trabajo. Su longitud – aproximadamente 100 residuos – le confería un interés intrínseco puesto que obligaba a un proceso de secuenciación y a la previa puesta a punto de un método de análisis de aminoácidos. Este método se basa en la derivatización pre-columna con cloruro de dabsilo y permite el análisis de todos los aminoácidos proteinogénicos con elevada reproducibilidad, en un tiempo de análisis estándar de 25 min. La estructura primaria del segmento de activación de 94 aminoácidos es altamente homóloga a la de otras especies ya secuenciadas y presenta una elevada proporción de residuos acídicos e hidrofóbicos. Predicciones de estructura secundaria hechas a partir de la secuencia indican una estructura globular compacta con elevada proporción de hélice α. La PCPA porcina se presenta en forma monomérica y en forma de complejo binario con la proproteasa E (PPE). Se comprobó que las dos formas de PCPA son idénticas en su peso molecular, longitud del segmento de activación, mapas peptídicos de los mismos y activación tríptica. La subunidad PPE se comporta como un modesto inhibidor de a actividad CPA, lo que se refleja en el proceso de activación. Así, en el caso del complejo binario, se produce una inhibición inicial seguida de una aceleración en la generación de actividad que es probablemente la consecuencia de la perturbación inicial y la colaboración posterior de la PPE en el proceso de activación proteolítica. Tanto en la proteína monomérica como en el complejo, la aparición del segmento de activación primario es inmediata al inicio de la activación tríptica. Por tanto, las diferencias en las cinéticas y curvas de activación son explicables a partir de interacciones diferenciales con el segmento en proceso de degradación. El seguimiento del proceso de activación tríptica mediante técnicas de HPLC y electroforesis permite observar un claro paralelismo entre la aparición de actividad y la degradación del segmento, la cual se produce de manera gradual a partir de su extremo C-terminal. Nuestros análisis permiten proponer la secuencialidad de los cortes trípticos y hacer una aproximación sobre les zonas accesibles en la estructura terciaria, demostrando a la vez la colaboración de la propia CPA en su proceso de activación. / The activation segment of procarboxypeptidase A (PCPA) is the fragment located at the molecule’s N-terminal which is severed from the enzyme by limited proteolysis. This work is aimed at the study of its primary structure and its degradation process during proenzyme activation. Previous knowledge on this type of fragments or domains was scarce until recently. Its length, approx. 100 residues, endowed it with an intrinsic interest both to elucidate its sequence and to work out a method of amino acid analysis not previously settled in our laboratory. This method is based on pre-column derivatization with dabsyl chloride and allows for the highly reproducible analysis of all proteinogenic amino acids in a standard time of 25 min. The primary structure of the 94-residue activation segment is highly homologous to those of other already sequenced species and displays a high proportion of acidic and hydrophobic residues. Secondary structure predictions indicate the presence of a compact globular structure with a considerable proportion of α helix. Porcine PCPA is found in monomeric and complex form; in the latter case as a binary complex with proprotease E (PPE). Both PCPA forms are identical in molecular weight, length and peptide maps of the activation segment and in their tryptic activation process. The PPE subunit behaves as a modest inhibitor of CPA activity which has a consequence on the activation process. Thus, in the case of the binary complex, an initial inhibition is followed by an acceleration of activity generation that is probably the consequence of both an initial perturbation and a later collaboration of PPE in the proteolytic activation process. Both in the monomeric and the complexed protein the release of the primary activation segment is immediate to the start up of the tryptic activation, indicating that the differences in the kinetics and activation curves may be regarded as the consequence of differential interactions with the dynamically degrading segment. The follow-up of the activation process by means of HPLC chromatography and electrophoresis allows for the observation of a clear correspondence between the increase in enzyme activity and the degradation of the activation segment, which is gradual from its C-terminus. Our analyses lead us to propose a sequence of events for the tryptic hydrolysis and a possible map of accessible areas in the tertiary structure, besides confirming the collaboration of CPA in its own activation process.

La síntesi de colesterol es veu regulada principalment per l'enzim 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzim A reductasa o HMG-CoA reductasa. L'HMG-CoA reductasa està sotmesa a nombrosos mecanismes que li'n regulen tant la quantitat com l'activitat. Aquests mecanismes es classifiquen en dos grups, els que actuen a llarg plaç regulant fonamentalment la quantitat de l'enzim i actuant a nivell de la síntesi i degradació d'aquest, i els que actuen a curt plaç controlant-ne l'activitat. El segon tipus de regulació a curt plaç es du a terme principalment a través d'un mecanisme de fosforilació i desfosforilació reversible.En l'esquema de regulació de l'HMG-CoA reductasa de molts altres sistemes interconvertibles per fosforilació, cada proteïna fosfatases en la regulació del sistema subjecte a vegada més, es dona una major importància al paper de les proteïna fosfatases en la regulación del sistema subjecte a interconversió. Aquest fet condueix al plantejament de l'existència d'altres proteïnes, com ho són les proteïnes inhibidores que regulen, a la vegada, l'actuació de les proteïna fosfatases.L'objectiu principal d'aquesta Memòria fou, per tant, aprofundir en el conêixement del control del procés d'activació per fosforilació covalent de l'HMG-CoA reductasa, mitjançant l'estudi dels Inhibidors de proteïna fosfatases.Des de l'any 1976, es coneix l'existència de dues proteïnes Inhibidores de fosfatasa tipus 1, l'inhibidor 1 i l'inhibidor 2. Tots aquests estudis han estat realitzats fonamentalment sobre el sistema fosforilasa fosfatasa, per tant ens plantejarem fer un estudi d'aquests inhibidors en el sistema reductasa fosfatasa ja que l'HMG-CoA reductasa és també un enzim regulable per un procés de fosforilació reversible.EIs resultats obtinguts d'aquest estudi demostren l'existència de dos inhibidors de proteïna fosfatases emprant HMG-CoA reductasa com a substrat. El primer d'ells, que inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 1, ha estat purificat a homogeneïtat a partir de citosol de fetge de rata. Aquest inhibidor te un pes molecular aparent d3 45 Kd determinat per filtració molecular en gel de 31 Kd determinat per electroforesi en gel d'acrilamida-SOS.L'estudl previ de la distrlbució subcel.lular d'aquest inhibidor de la fosfatasa tipus 1 i substrat HMG-CoA reductasa mostrà que el 90% de l'activitat inhibitòria total està localitzada en la fracció citosòlica. Aquest inhibidor presenta una gran reSsistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol. L'inhibidor de la fosfatasa 1 inhibeix a la fosfatasa de tipus 1 a concentracions nanomolars, mentre que inhibeix a la fosfatasa 2A a concentracions micromolars, tant si el substrat emprat és I'HMG-CoA reductasa com si es tracta de la glicogen fosforilasa. Aquest comportament cinètic és similar al que presenta l'inhibidor-2 de múscul esquelètic de conill.L'inhibidor de la fosfatasa 1 és capaç de formar complexes inactius d'alt pes molecular de fosfatasa tipus 1. Aquests complexes són reactivables quan se'ls incuba en presència de GSK-3 i ATP-Mg. Aquest inhibidor és fosforilable per acció de la proteïna quinasa dependent d'AMP cíclic i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+ i per l'acció de la GSK-3 i [gamma-(32)P]ATP i Mg(2)+.L'anàlisi del conjunt de resultats indica l'existència d'una gran similitud en el comportament cromatogràfic, electroforètic, cinètic, etc. entre l'inhibidor de la fosfatasa 1 I l'inhibldor-2 ja descrit de múscul esquelètic de conill, i ens permet afirmar que ambdos inhibidors són similars.El segon inhibidor purificat a homogenertat a partir de fetge de rata inhibeix l'activitat reductasa fosfatasa de la fosfatasa tipus 2A i presenta un pes molecular aparent de 30 Kd quan es determina per filtració en gel i de 20 Kd quan es determina per electroforesi en gel d'acrilamida-SDS.L'activitat inhibitòria sobre la fosfatasa tipus 2A està localitzada en la fracció citosòlica i presenta també una gran resistència al calor i a tractaments àcids, a la vegada que mostra una gran sensibilitat a la tripsina i a l'etanol.Aquest inhibidor inhibeix la fosfatasa 2A a concentracions nanomolars, mentre que no inhibeix la fosfatasa de tipus 1, quan el substrat emprat és l'HMG-CoA reductasa. Si el substrat és la glicogen fosforilasa cap d'ambdues activitats fosfatàsiques es veuen inhibides.L'inhibidor da la fosfatasa tipus 2A no és fosforilable ní per GSK-3 ni per la quinasa dependent d'AMP cíclic. L'anàiisi del conjunt de resultats indica que l'inhibidor de la fosfatasa 2A és un inhibidor especlfic de l'activitat reductasa fosfatasa no descrit fins ara. / A protein inhibitor of HMG-CoA reductase phosphatise 1 activity was purified to homogeneity from rat liver. The purified protein has a molecular mass of 31 kDa. This spontaneously active protein is thermostable and acid resistant. The protein inhibitor is phosphorylated by glycogen synthase kinase-3 and cAMP-dependent protein kinase without change in its inhibitory activity. The inhibition caused by this inhibitor on phosphatase and 2A is similar to that of inhibitor-2 from rabbit skeletal muscle using hydroxymethylglutaryl-CoA reductase as substrate.Another heat-stable protein inhibitor of the hydroxymethylt-glutaryl CoA reductase phosphatase 2A activity has been identified and purified to homogeneity. The apparent molecular mass was 20,000 Da. The protein lost its inhibitory properties when incubated with trypsin or treated with ethanol. The inhibitor protein does not inhibit type 1 phosphatase when either phosphorylase or hydroxymethylglutaryl-CoA reductase is the substrate but not when phosphorylase A is the substrate. In contrast, this protein inhibitor inhibits the rat liver type 2A phosphatase activity when hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase activity but also by the absence of (32)p release from (32)p- labeled hydroxymethylglutaryl-CoA reductase. The inhibition on the phosphatase activity is shown not only by the modified hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase. The inhibitor protein is not activated by incubation with ATP and cAMP-dependent protein kinase and it is not phosphorylated by glycogen synthase kinase-3. These results, together with those of the kinetic experiments, suggest that the reductase phosphatise inhibitor is distinct from protein phosphatase inhibitor-1 and inhibitor-2.

Durant la tesi doctoral s'ha comprovat que a partir de biosensors fabricats mitjançant una tecnología relativament senzilla i económica, com és la formació de matrius i la impressió serigràfica de tintes, es poden realitzar determinacions de diversos analits d'interès en l'àmbit alimentari no tan sols en solucions estàndard sinó també en mostres reals. Els resultats aconseguits suposen una important millora en l'abaratiment dels costos d'anàlisi i la reducció del temps necessari.El treball realitzar s'ha portat a terme en dues parts molt diferenciades; en una primera s'han desenvolupat biosensors screen-printing basats en resines epoxi per a l'anàlisi de pesticides i en una segona biosensors screen-printing basats en matrius de sílice (sol-gel) per a la determinació d'àcid màlic i làctic en vins.

La present tesi doctoral recull l'estudi de diverses modificacions químiques de sensors amperomètrics, adreçades cap a cercar solucions per als problemes típicament implícits en el desenvolupament de biosensors basats en enzims oxidoreductases, alhora que es busca la compatibilitat d'aquestes modificacions amb les estratègies d'immobilització enzimàtica emprades.La primera part del treball inclou el desenvolupament de quimiosensors reproduïbles i estables per a la determinació del cofactor NADH, del qual depenen els enzims deshidrogenases, i del compost peròxid d'hidrogen, obtingut com a producte de les reaccions en què participen gran part dels enzims oxidases. Els quimiosensors per a la determinació de NADH s'han basat en l'ús de diferents mediadors d'oxidació-reducció, mitjançant vàries estratègies d'incorporació als sistemes de detecció amperomètrica (en solució, per adsorció sobre la superfície electròdica o en membranes de Nafió, incorporats en matrius polimèriques de compòsits de grafit-epoxi, electropolimeritzats o immobilitzats en membranes de polisulfona). Els quimiosensors basats en membranes de polisulfona han mostrat nombrosos avantatges respecte la resta de quimiosensors desenvolupats. De fet, la polisulfona es presenta en aquest estudi com a un bon material polimèric per al desenvolupament de quimiosensors amperomètrics, atès que aconsegueix evitar els problemes de passivació de la superfície electròdica implícits en la determinació del cofactor NADH, i al mateix temps permet una retenció excel·lent dels mediadors immobilitzats al seu interior, amb una absència total de pèrdues d'aquestes espècies per dissolució. D'altra banda, en relació al desenvolupament de quimiosensors per a la determinació de peròxid d'hidrogen, s'han sintetitzat gels de sílice que incorporen diferents metalls que actuen com a catalitzadors dels processos d'oxidació i reducció del peròxid d'hidrogen. Aquests gels s'han dipositat com a mescles del corresponent xerogel amb acetat de cel·lulosa i polietilenglicol, a fi d'aconseguir membranes que minimitzen les limitacions d'aquest tipus de materials (formació d'esquerdes, absorció d'aigua,...). S'han emprat diferents tècniques d'anàlisi amb l'objectiu de dur a terme estudis de caracterització dels quimiosensors basats en membranes de polisulfona i en xerogels modificats amb metalls.La segona part del treball es va dedicar al desenvolupament de biosensors basats en diversos enzims oxidoreductases, mitjançant l'ús dels quimiosensors prèviament desenvolupats. Els quimiosensors per a NADH s'han adaptat per al desenvolupament de biosensors per a lactat, basats en la incorporació de l'enzim L-lactat deshidrogenasa en matrius de gels de sílice i en membranes de polisulfona, i de biosensors per a ió amoni, basats en la incorporació de l'enzim glutamat deshidrogenasa en polímers de mediador o en membranes de polisulfona. També es va desenvolupar un biosensor bienzimàtic per a la determinació d'urea, basat en la incorporació dels enzims glutamat deshidrogenasa i ureasa en membranes de polisulfona. D'altra banda, els quimiosensors per a peròxid d'hidrogen s'han emprat per al desenvolupament de biosensors per a glucosa, basats en la incorporació de l'enzim glucosa oxidasa en gels de sílice mitjançant vàries configuracions diferents. Els biosensors desenvolupats han demostrat la capacitat de les membranes de polisulfona i dels gels de sílice per a incorporar enzims. A més, en alguns casos, com el biosensor per a ió amoni, s'han aconseguit unes característiques analítiques excel·lents (sensibilitat elevada, intervals lineals amplis, temps de resposta curts, bona reproductibilitat entre corbes de calibració successives,...).Finalment, la darrera part del treball es va basar en l'adaptació dels quimiosensors i biosensors desenvolupats, basats en una configuració cilíndrica, a una configuració plana, mitjançant processos de serigrafia, i la seva posterior implementació en sistemes de flux. / The aim of this work was the study of different chemical modifications of amperometric sensors in order to minimise the problems involved in the development of biosensors based on oxidoreductase enzymes, trying to find compatibility between the used chemical modifications and the employed enzymatic immobilisation strategies.The first part of the work was devoted to the development of reliable and stable chemosensors for the determination of NADH cofactor and hydrogen peroxide, for the further development of dehydrogenase- and oxidase-based biosensors, respectively, since dehydrogenase enzymes are NAD-dependent and most of the oxidase enzymes involve hydrogen peroxide as a reaction product. Chemosensors for the determination of NADH were based on the incorporation of different electron mediators, using several incorporation strategies into the amperometrical detection system (in solution, by adsorption onto the electrode surface or onto Nafion membranes, by incorporation inside polymeric matrices of graphite-epoxy composites, by electropolymerization or by immobilisation inside polysulfone membranes). Chemosensors based on polysulfone membranes have shown many advantages in front of the other developed chemosensors. In fact, polysulfone is presented for the first time as an adequate polymeric material for the development of amperometric chemosensors, since it avoids the fouling surface problems typically involved in the amperometric determination of NADH cofactor, while at the same time allows an excellent retention of the immobilised mediators inside the membrane, without leakage of the immobilised species into the solution. On the other hand, in relation to the development of chemosensors for the determination of hydrogen peroxide, several sol-gels have been synthesised, which incorporate different metals acting as catalysts for the oxidation and reduction processes of hydrogen peroxide. These sol-gels have been mixed with cellulose acetate and polyethyleneglycol in order to be deposited as membranes, minimising the limitations of this kind of materials (cracking, water absorption,...). Different analysis techniques have been used with the aim of characterising the final chemosensors based on polysulfone membranes and metal-modified-xerogels. The second part of the work was directed towards the development of biosensors based on different oxidoreductase enzymes, using the previously developed chemosensors. Chemosensors for NADH have been used for developing lactate biosensors, based on the incorporation of L-lactate dehydrogenase enzyme inside sol-gel matrices and polysulfone membranes, and ammonium biosensors, based on the entrapment of glutamate dehydrogenase enzyme inside electropolymerized mediators or polysulfone membranes. Furthermore, a urea bienzymatic biosensor was developed, based on the incorporation of glutamate dehydrogenase and urease enzymes inside polysulfone membranes. On the other hand, chemosensors for hydrogen peroxide have been used for developing glucose biosensors, based on the immobilisation of glucose oxidase enzyme in sol-gels using different configurations. Both strategies, based on polysulfone membranes and sol-gels, have shown the ability of these membranes to incorporate enzymes into the biosensor configuration. Additionally, some of the developed biosensors, such as the ammonium biosensor, have achieved excellent analytical characteristics (high sensitivity, wide linear ranges, fast response times, good reproducibility among successive calibration curves,...).Finally, the last part of this work was based on the application of screen-printing technology for the preparation of the developed chemosensors and biosensors with a planar configuration, and their further implementation in flow systems.

No description available.

Aquesta Tesi doctoral aprofundeix en el coneixement del metabolisme cel·lular, concretament en el metabolisme central del carboni de cèl·lules no tumorals transfectades amb un oncogen (HRas) amb una mutació puntual (G12V), de cèl·lules no tumorals amb delecions puntuals en els enzims clau que controlen la progressió a través del cicle cel·lular (CDK4 i CDK6) o de cèl·lules tumorals tractades amb agents antitumorals. El metabolisme, vist com un nivell integrador de moltes de les vies de transducció de senyals, pot servir no només per entendre com es produeixen les alteracions que porten a l'adquisició d'un fenotip tumoral maligne, sinó que pot oferir una sèrie de dianes terapèutiques basades en impedir l'adaptació específica de la cèl·lula tumoral als canvis durant el procés de malignitat o davant tractaments antitumorals. Amb aquesta finalitat, en aquesta Tesi Doctoral se li ha donat especial importància a la síntesi i desenvolupament de nous compostos amb potencial antitumoral dels que s'ha fet un estudi molecular i metabòlic detallat per poder observar la resposta de la cèl·lula tumoral front de les pertorbacions provocades. El coneixement detallat dels efectes a nivell molecular i metabòlic de potencials fàrmacs és d'esperar que sigui de gran utilitat a l'hora de dissenyar teràpies combinades per potenciar sinergies entre fàrmacs i evitar els possibles efectes secundaris no desitjats. S'han utilitzat models in vitro i s'han estudiat les seves alteracions moleculars i metabòliques: en el primer capítol s'ha posat de manifest, mitjançant l'ús de fibroblasts embriogènics de ratolí deficients en CDK4, CDK6 i CDK2, que la inhibició de la transició G1 / S del cicle cel·lular reverteix l'ús de les branques oxidativa i no oxidativa de la ruta de les pentoses fosfat característica de tumors. A continuació, s'han caracteritzat nous inhibidors de CDK4 i CDK6 identificats amb eines bioinformàtiques en diferents línies cel·lulars per així millorar el disseny racional de noves teràpies dirigides a tumors deficients en el supressor tumoral p16INK4a i que mantinguin el pRB inalterat. En el tercer capítol es caracteritza una nova família de lactones sintètiques disubstituidas per validar els seus efectes antitumorals i inhibitoris de les proteïnes clau de la fase G1 del cicle cel·lular, CDK4 i CDK6. Els efectes moleculars o activitat dels compostos i la relació amb la seva estructura proporcionen informació valuosa per al disseny racional de noves teràpies. En el quart capítol s'analitzen els efectes moleculars de l'àcid metilselenínic. El compost és capaç de translocar FOXO al nucli i en cèl·lules de carcinoma humà de pulmó A-549 indueix efectes moleculars que són explicats pel nou mecanisme d'acció descrit. Finalment, en el capítol 5 s'aprofundeix sobre el perfil metabòlic associat a la transfecció de l'oncogen HRas amb una mutació puntual en el codó 12. / There are numerous experimental evidences showing that a large number of tumours are associated with deregulation of cyclin D-CDK4/6-INK4a-pRb pathway, and in particular the reduction of normal levels of p16INK4a, a natural inhibitor of CDK4/6 protein. Therefore, obtaining inhibitors of these proteins can be extremely useful in selective therapeutic treatments against cancer. Currently there are molecules, some of them already in clinical phase, which inhibit CDK4/CDK6 competing with ATP. However, given the large number of kinase proteins that exist in the body, these molecules could cause numerous side effects. It is therefore of great interest to design specific inhibitors CDK4/CDK6 using a different strategy and eliminate these side effects.It is therefore expected that CDK4/CDK6 inhibitors developed in this work will have high practical applicability and usefulness in cancer treatment. The designed inhibitors mimic the binding site of p16 and not the binding ATP as most CDK inhibitors currently available and in consequence they will be highly specific to CDK4/6 kinases.Moreover, in this thesis we elucidated the mechanism of action of metilselenínic acid (MSeA). The treatment of MSeA on human lung carcinoma cell line A-549 provokes a cell cycle arrest in G1 phase of the cell cycle, apoptosis, reactive oxygen species detoxification at 24, 48 and 72h as well as metabolic effects at 24h that could be explained by the FOXO translocation to the nucleus.Furthermore, phenotypic specificity shown by different KRas transfectants raises the question whether metabolic adaptation of this mutated gene causes is specific from the mutated isoform, and thus is maintained by introducing mutated isoform of H-ras in mouse fibroblast cells. Thus, in this section of the work, we considered doing a metabolomic characterization of NIH-3T3 cells transfected with copies of HRas oncogene containing a substitution similar to those already tested in K-ras: replacement of glycine at position 12 by a valine. This would open the possibility of using a sensitivity analysis similar to that in KRas, which allows the specific design of therapies depending on the metabolic profile observed.

L'enzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la primera etapa limitant en la síntesi d'isoprenoides citosòlics. En plantes, és un enzim de membrana i la seva primera destinació subcel·lular és el reticle endoplasmàtic. Estructuralment, està formada per un domini amino-terminal (que inclou una regió amino-terminal citosòlica i dos fragments transmembrana) i un domini catalític altament conservat en tota l'escala evolutiva. En totes les espècies de plantes conegudes fins al moment, existeixen isoformes de l'HMGR codificades per diferents gens. Concretament, en Arabidopsis thaliana el gen hmg1 (expressat de forma majoritària) codifica per a les isoformes HMGR1S i HMGR1L, i el gen hmg2 (expressat a arrels, plàntules i inflorescències) codifica per a la isoforma HMGR2. A nivell d'estructura primària l'HMGR1L difereix de l'HMGR1S per la presència d'una regió extra de 50 residus aminoacídics a l'extrem amino-terminal. El domini amino-terminal confereix diferents destinacions de localització subcel·lular a la proteïna. En un treball anterior, es van identificar tres proteïnes que interaccionen amb les isoformes derivades del gen hmg1: AtB"α, AtB"β i AtKLC-1. Les dues primeres interaccionen específicament amb la regió amino-terminal de les isoformes HMGR1S i HMGR1L. Les proteïnes AtB"α i AtB"β són isoformes de la subunitat B" reguladora del complex proteïna fosfatasa 2A (PP2A). En el genoma d'A. thaliana hi ha cinc seqüències que codifiquen per a isoformes de la subunitat B" que comparteixen una gran homologia. En l'estructura primària de la subunitat B" s'han identificat motius EF-Hand (implicats en la unió a calci). S'ha demostrat que tant AtB"α com AtB"β uneixen calci. La tercera proteïna identificada, AtKLC-1, interacciona específicament amb la regió amino-terminal de l'HMGR1L. S'ha determinat per assaigs de doble híbrid en llevat i, posteriorment confirmats in vitro, que la PR65, proteïna estructural del complex PP2A, interacciona específicament amb l'AtKLC-1. La regió de la PR65 suficient per a la interacció amb la subunitat B" reguladora, AtB"α, i amb l'AtKLC-1 comprèn la mateixa seqüència aminoacídica. Per tant, l'AtB"α i l'AtKLC-1 podrien competir per a l'associació amb la PR65. Així, en la cèl·lula, la PP2A podria regular d'una forma particular les isoformes HMGR1S i HMGR1L. Assaigs in vivo i in vitro demostren que la PP2A és un regulador negatiu de l'enzim HMGR. Els ions calci inhibeixen també l'activitat HMGR. Per a què es dugui a terme la repressió de l'activitat HMGR tant per calci com per PP2A, es requereix el domini amino-terminal de la proteïna. Per tant, els resultats són consistents amb què les subunitats AtB" i/o AtKLC-1 duen a terme un paper mediador en la modulació de l'HMGR per la PP2A. El domini amino-terminal de l'HMGR1S està implicat en la morfogènesi de vesícules derivades del reticle endoplasmàtic. La subunitat AtB"α i la resta del complex PP2A participen en aquest procés. El domini amino-terminal de l'HMGR1L dirigeix la proteïna a la trama de reticle endoplasmàtic. La PP2A participa també en la localització subcel·lular d'aquesta isoforma.S'ha caracteritzat una línia mutant en el gen hmg1 d'A. thaliana que mostra absència del transcrit hmg1 i una reduïda activitat HMGR. Les plantes d'aquest mutant creixen normalment en un medi de cultiu estèril i manifesten severes alteracions del desenvolupament quan són cultivades en terra. L'addició de mevalonat, producte de la reacció catalitzada per l'HMGR, no reverteix el fenotip. Les dades indiquen que el gen hmg1 duu a terme una funció no metabòlica relacionada amb l'adaptació al medi. En aquestes condicions de creixement, les estructures vesiculars induïdes per l'HMGR1S podrien tenir alguna funció essencial relacionada amb la resposta a estrès. / "ROLE OF THE PROTEINS AtKLC-1 AND AtB" IN THE REGULATION OF HMG-CoA REDUCTASE IN ARABIDOPSIS THALIANA".TEXT: The enzyme HMG-CoA reductase (HMGR) catalyses the formation of mevalonate in the first rate-limiting step of the mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis. All known plant HMGR isoforms are primarily targeted to the endoplasmic reticulum (ER).These proteins contain two domains: an N-terminal domain (which includes an N-terminal cytosolic region and two membrane-spanning sequences) and a conserved catalytic domain. In all plant species, there are a variety of HMGR isoforms encoded by a multigene family. In Arabidopsis thaliana, two genes (hmg1 and hmg2) encode three HMGR isoforms (HMGR1S, HMGR1L and HMGR2). Isoforms HMGR1S and HMGR1L are identical in sequence but HMGR1L is extended 50 amino acid residues at the N-terminal end. In a previous study, three proteins had been identified which specifically interact with the HMGR1L N-terminal end. Two of these proteins, designed AtB" and AtB", are regulatory B" subunits of protein phosphatase 2A (PP2A). They bind the N-terminal region of HMGR1S and HMGR1L. The third one, AtKLC-1, exclusively interact with the N-terminal region of HMGR1L. In vitro assays have revealed that PR65, PP2A scaffolding subunit, specifically interact with AtKLC-1. Genetic and pharmacological approaches demonstrate that PP2A exerts an inhibitory control over HMGR. These results indicate that AtB" or AtKLC-1 could have a mediating role in the HMGR regulation carried out by PP2A. The N-terminal domain of the HMGR1S isoform is involved in the biogenesis of vesicle structures derived from the ER membranes. The PP2A complex is concerned in this process and the subunit AtB" acts as an interceding factor. Furthermore, we have characterized an Arabidopsis thaliana insertion mutant for hmg1. This mutant exhibits no visible phenotype under sterile growth conditions but shows dwarfing and sterility when it is grown in a soil substrate. The addition of mevalonate doesn't rescue this phenotype. These data suggest that hmg1 performs a no-metabolic function related with environment adaptation. In this context, ER derived vesicles induced by HMGR1S could play an essential role related with stress response.

La Fru-2,6-P2 es l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1, enzim clau en el control i regulació de la via glucolítica. El paper d'aquest metabòlit en el múscul esquelètic encara no queda molt clar. En el present estudi es presenten dos objectius; el primer és caracteritzar la concentració de Fru-2,6-P2 i el patró d'expressió de les diferents isoformes de l'enzim 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa durant el desenvolupament del teixit muscular cardíac i esquelètic, tant a nivell proteic (western blot) com a nivell de mRNA (PCR a temps real). Així com, en músculs esquelètics de contracció lenta i ràpida en l'individu adult. El segon objectiu es centra en determinar la importància de la Fru-2,6-P2 en el control de la glucòlisi muscular.El primer objectiu es realitza mitjançant un model experimental que inclou diferents etapes del desenvolupament del cor i del múscul esquelètic de rata (Fetus de 19 dies post-concepció, 2, 5 i 10 dies post-naixement i d'estadi adult). D'aquest estudi es conclou que en l'estadi fetal la concentració de Fru-2,6-P2 en ambdós teixits està controlada per la isoforma ubiqua de l'enzim PFK-2/FBPasa-2, enzim que controla la síntesi i degradació del metabòlit. També s'ha observat com durant el desenvolupament es produeix la substitució de la isoforma ubiqua de l'enzim PFK-2/FBPasa-2 per la pròpia de cada teixit, és a dir, per la cardíaca en cor i la muscular en múscul.Per tal de resoldre el segon objectiu s'ha dissenyat un model experimental d'electroestimulació crònica a baixa freqüència (10 Hz) en conill. El protocol provoca la contracció del múscul tibialis anterior durant 24 hores, a continuació es concedeix un període de desncas de 48 hores. Sobre aquests músculs i per tal d'analitzar la glucòlisi muscular en ells es realitza un test d'exercici emprant el mateix sistema d'electroestimulació a baixa freqüència, durant 1, 3 i 10 segons. Els músculs estimulats i descansats presenten el mateix comportament fisiològic dels músculs en estat de repòs, quan s'aplica un protocol de força i/o de fatiga. La concentració de Fru-2,6-P2 augmenta fruit de l'electroestimulació durant 24 hores, aquest augment es manté fins i tot quan es deixa descansar al múscul fins a 48 hores. L'anàlisi de les concentracions dels metabòlits intermediaris de la glucòlisi després de 48 hores de descans reflexa una recuperació total davant del procés d'electroestimulació. Quan es determina l'estat de la via glucolítica en aquests músculs s'ha observat un augment en la utilització de la mateixa en els primers instants del test d'exercici, coincidint amb un augment significatiu de l'activitat de l'enzim PFK-1, mesurat a través del quocient Fru-1,6-P2/Fru-6-P, principal regulador de la via. Per primera vegada es demostra com un augment persistent de Fru-2,6-P2 pot jugar un paper important en la regulació de la glucòlisi muscular en els primers instants de l'exercici.La impossibilitat d'explicar els increments persistents de Fru-2,6-P2 a través de la isoforma muscular de l'enzim PFK-2/FBPasa-2, fa plantejar l'estudi del patró d'expressió de les diferents isoformes de l'enzim per determinar si es produeix alguna substitució isoenzimàtica que permeti explicar l'increment de la concentració de Fru-2,6-P2. L'anàlisi d'expressió de les isoformes a través de PCR a temps real i western blot permet concloure que l'augment de l'expressió de la isoforma cardíaca juntament amb la disminució de l'expressió de la resta d'isoformes de l'enzim permetrien l'increment de Fru-2,6-P2 observat en el estudi.

Les glutaredoxines són enzims que intervenen en reaccions redox i que la sevafunció principal consisteix en protegir les cèl·lules contra estrès oxidatiu mitjançant elmanteniment de l'estat redox adequat dels grups sulfidril de les proteïnes cel·lulars.Treballs anteriors han descrit l'existència de dues glutaredoxines en el llevatSaccharomyces cerevisiae, Grx1 i Grx2, que contenen dues cisteïnes en el seu centreactiu les quals són essencials per a mantenir la seva funció. Aquestes duesglutaredoxines juguen diferents papers en la cèl·lula en la protecció contra estrèsoxidatiu.Aquest treball consisteix en l'estudi i caracterització d'una nova família deglutaredoxines en S. cerevisiae, formada per Grx3, Grx4 i Grx5, que es diferencia de laja descrita perquè les proteïnes tenen una única cisteina en el seu centre actiu. S'harealitzat un anàlisi comparatiu de les seqüències de les dues famílies de glutaredoxinesde llevat amb les existents en altres organismes, i s'ha vist que l'estructura bàsica de lesmateixes està conservada des de bacteris a humans. L'anàlisi funcional dels mutantsd'aquesta nova família ha revelat que, de les tres glutaredoxines monotiòliques, Grx5 ésla que desenvolupa una funció més important en la protecció contra estrès oxidatiu,clarament diferenciada de Grx3 i Grx4. Grx5 s'ha vist localitzada en la mitocòndria,essent aquesta localització indispensable per al normal funcionament de l'enzim. Grx3 iGrx4, en canvi, es troben al nucli. D'acord amb la sublocalització cel·lular, es mostrendiferents evidències de què Grx5 es troba directament implicada en la biosíntesi delscentres Fe/S, que en llevats té lloc a la mitocòndria. Els mutants mancats de Grx5 sóndefectuosos en l'activitat d'enzims amb centres Fe/S i acumulen en excés de ferro, tantal citosol com a la mitocòndria. Estudis mitjançant la tècnica del doble-híbrid handemostrat una interacció física entre Grx5 i Isa1, una altra proteïna de la matriumitocondrial que intervé en la síntesi dels centres Fe/S. Les dades existents indiquenque les glutaredoxines monotiòliques poden portar a terme funcions especialitzadescada una d'elles en diferents compartiments del llevat, sense excloure la possibleredundància funcional entre Grx3 i Grx4. / Las glutaredoxinas son enzimas que intervienen en reacciones redox y cuyafunción principal consiste en proteger las células contra estrés oxidativo a través delmantenimiento del estado redox adecuado de los grupos sulfidrilo de las proteínascelulares. Trabajos anteriores han descrito la existencia de dos glutaredoxinas en lalevadura Saccharomyces cerevisiae, Grx1 y Grx2, que contienen dos cisteínas en sucentro activo las cuales son esenciales para mantener su función. Estas dosglutaredoxinas juegan diferentes papeles en la célula en la protección contra estrésoxidativo.El presente trabajo consiste en el estudio y caracterización de una nueva familiade glutaredoxinas en S. cerevisiae, formada por Grx3, Grx4 y Grx5, que se diferencia dela ya descrita porque las proteínas poseen una única cisteína en su centro activo. Se harealizado un análisis comparativo de las secuencias de las dos familias deglutaredoxinas de levadura con las existentes en otros organismos, observándose que laestructura básica de las mismas está conservada desde bacterias a humanos. El análisisfuncional de los mutantes de esta nueva familia ha revelado que, de las tresglutaredoxinas monotiólicas, Grx5 es la que desarrolla una función más importante en laprotección contra estrés oxidativo, claramente diferenciada de Grx3 y Grx4. Grx5 se havisto localizada en la mitocondria, siendo esta localización indispensable para el normalfuncionamiento de la enzima. Grx3 y Grx4, en cambio, se encuentran en el núcleo. Enconcordancia con la sublocalización celular, se muestran varias evidencias de que Grx5se halla directamente implicada en la biosíntesis de los centros Fe/S, que en levadurastiene lugar en la mitocondria. Los mutantes carentes de Grx5 son defectivos en laactividad de enzimas con centros Fe/S y acumulan un exceso de hierro, tanto en elcitosol como en la mitocondria. Estudios mediante la técnica del doble-híbrido handemostrado una interacción física entre Grx5 e Isa1, otra proteína de la matrizmitocondrial que interviene en la síntesis de centros Fe/S. Los datos existentes apuntana que las glutaredoxinas monotiólicas pueden desempeñar funciones especializadas cadauna de ellas en compartimentos diversos de la levadura, sin excluir la posibleredundancia funcional entre Grx3 y Grx4. / Glutaredoxins are enzymes involved in redox reactions, whose main functionconsists of protecting cells against oxidative stress through maintaining a normal redoxstatus of sulfhydril groups in cellular proteins. Previous work has described twoglutaredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Grx1 and Grx2, that contain twocysteines residues in their active site, which are essential for their enzymatic function.These two glutaredoxins play different roles in protecting cells against oxidative stress.The present work consists of the study and characterisation of a new family ofglutaredoxins in S. cerevisiae, composed by Grx3, Grx4 and Grx5. These have a singlecysteine in the active site of the protein, in contrast to the previous glutaredoxins. Acomparative analysis of the sequences of the two families of the yeast glutaredoxinsand the glutaredoxins of other organisms has been carried out, and the basic structure ofthese enzymes is indeed conserved from bacteria to humans. The functional analysis ofmutants of this new family reveals that Grx5 is the most important monothiolicglutaredoxin in protecting cells against oxidative stress, and that its function is differentfrom that of Grx3 and Grx4. Grx5 is located in mitochondria and this localisation isneeded for the normal function of the enzyme. In contrast, Grx3 and Grx4 are located atthe nucleus. According to the subcellular location, several evidences are showndemonstrating that Grx5 is directly involved in the biosynthesis of Fe/S clusters, whichtakes place at the mitochondrial matrix in yeast. The grx5 mutants are defective in theactivity of Fe/S enzymes and accumulate iron both in mitochondria and cytosol. Twohybridassays show that there is a physical interaction between Grx5 and Isa1, anothermatrix mitochondrial protein that participates in the synthesis of Fe/S clusters. All thesedata suggest that monothiolic glutaredoxins play specialised functions in differentcompartments of yeast, which does not exclude the possibility that Grx3 and Grx4 couldbe functionally redundant.

La superòxid dismutasa (SOD) és efectiva en processos inflamatoris i per tant actua enels efectes que produeix de forma aguda la radioteràpia. En aquest treball es revisen elsmecanismes d'acció de les radiacions ionitzants i s'analitzen les causes dels seus efectesbiològics en el tractament radioteràpic de la patologia oncològica pèlvica. Es revisal'experiència de diversos autors en aquest camp, en les distintes àrees irradiades, ambl'administració del fàrmac durant el tractament radioteràpic.Una vegada avaluats els treballs anteriors, sembla lògic pensar que la SOD podria actuarde forma preventiva en els efectes secundaris tardans utilitzant-la una vegada finalitzatel tractament radioteràpic. Per tant, s'ha dissenyat un treball experimental en el que escomparen dos grups homogenis de 50 pacients cadascun, administrant SOD a un d'ells,durant un període de temps, una vegada finalitzada la irradiació i utilitzant l'altre com agrup control, sense tractament. Com a objectiu secundari s'han avaluat l'eficàcia i laseguretat de la SOD en el tractament dels efectes secundaris aguts del tractamentradioteràpic.S'avalua l'eficàcia i la seguretat de l'administració de SOD en les diferentslocalitzacions: pell, tracte digestiu alt i baix i aparell genitourinari, així com la toxicitatmàxima i la rellevant en cada localització.La discussió contempla tots els aspectes dels resultats de l'estudi amb una anàlisi finalde l'efectivitat del tractament amb SOD i la rellevància clínica dels resultats obtinguts.Les conclusions finals són les següents:- La SOD és un fàrmac segur ja que no s'ha presentat cap efecte advers.- Per prevenir els efectes secundaris aguts, la SOD s'ha d'administrar durant eltractament radioteràpic.- La pauta de tractament per prevenir els efectes aguts de la irradiació no és la mésadequada per prevenir els efectes tardans.- La SOD administrada després d'acabar la radioteràpia durant 7 setmanes, és capaç dereduir la toxicitat global tardana al llarg de tot el període d'estudi, manifestant-se ja elseu efecte a partir del dia 90, moment en el que comencen a aparèixer els fenòmensradioinduïts tardans.- La SOD utilitzada per prevenir els efectes tardans radioinduïts, és capaç d'evitarl'aparició global de toxicitat tardana de forma significativa, de manera que un pacient notractat amb SOD té de forma significativa un 37% més de probabilitats de desenvolupartoxicitat fins als 24 mesos, que un tractat amb SOD.- La reducció de toxicitat es manifesta especialment en el tracte digestiu baix, demanera que un pacient no tractat amb SOD té un 26% més de possibilitats dedesenvolupar toxicitat en el tracte digestiu baix, de forma significativa fins als 24mesos, que un tractat amb SOD. / La superóxido dismutasa (SOD) es efectiva en procesos inflamatorios y por tanto actúaen los efectos que produce de forma aguda la radioterapia. En este trabajo se revisan losmecanismos de acción de las radiaciones ionizantes y se analizan las causas de susefectos biológicos en el tratamiento radioterápico de la patología oncológica pélvica. Serevisa la experiencia de diversos autores en este campo, en las distintas áreas irradiadas,con la administración del fármaco durante el tratamiento radioterápico.Una vez evaluados los trabajos anteriores, parece lógico pensar que la SOD podríaactuar de forma preventiva en los efectos secundarios tardíos utilizándola una vezfinalizado el tratamiento radioterápico. Por tanto, se ha diseñado un trabajoexperimental en el que se comparan dos grupos homogéneos de 50 pacientes cada uno,administrando SOD a uno de ellos, durante un período de tiempo una vez finalizada lairradiación, y utilizando el otro como grupo control sin tratamiento. Como objetivosecundario se han evaluado la eficacia y la seguridad de la SOD en el tratamiento de losefectos secundarios agudos del tratamiento radioterápico.Se evalúa la eficacia y la seguridad de la administración de SOD en las distintaslocalizaciones: piel, tracto digestivo alto y bajo y aparato genitourinario, así como latoxicidad máxima y la relevante en cada localización.La discusión contempla todos los aspectos de los resultados del estudio con un análisisfinal de la efectividad del tratamiento con SOD y la relevancia clínica de los resultadosobtenidos.Las conclusiones finales son las siguientes:- La SOD es un fármaco seguro ya que no se ha presentado ningún efecto adverso.- Para prevenir los efectos secundarios agudos, la SOD se debe administrar durante eltratamiento radioterápico.- La pauta de tratamiento para prevenir los efectos agudos de la irradiación no es la másadecuada para prevenir los efectos tardíos.- La SOD administrada después de terminar la radioterapia durante 7 semanas, es capazde reducir la toxicidad global tardía a lo largo de todo el periodo de estudio,manifestándose su efecto a partir ya del día 90, momento en el que empiezan a aparecerlos fenómenos radioinducidos tardíos.- La SOD utilizada para prevenir los efectos tardíos radioinducidos, es capaz de evitar laaparición global de toxicidad tardía de forma significativa, de manera que un pacienteno tratado con SOD tiene de forma significativa un 37% más probabilidades dedesarrollar toxicidad hasta los 24 meses, que uno tratado con SOD.- La reducción de toxicidad se manifiesta especialmente en el tracto digestivo bajo, demanera que un paciente no tratado con SOD tiene un 26% más posibilidades dedesarrollar toxicidad en el tracto digestivo bajo, de forma significativa hasta los 24meses, que uno tratado con SOD. / Superoxide dismutase (SOD) is effective in inflammatory processes and therefore it actsin radiation therapy induced acute effects. In this work, the mechanisms of action ofionising radiation are reviewed and the causes of their biological effects in oncologicalpelvic radiation treatment are analysed. The experience of several authors in this field,in the different irradiated areas, with drug administration during radiotherapy treatmentis reviewed.Once evaluated the previous studies, it seems logical to think that SOD could preventlate side effects by using it after termination the radiation treatment. Therefore, anexperimental work has been designed to compare two homogenous groups of 50patients each. One group has been administered SOD during a period of time after thecompletion of radiation, and the other one, as a control group without treatment. Thesecondary aim is to evaluate the SOD efficacy and safety in the treatment of acute sideeffects of radiation therapy.Effectiveness and security of SOD administration is analysed in different localisations:skin, high and low digestive tract and genitourinary system, as well as the maximumand the outstanding toxicity in each location.The discussion contemplates all the aspects of the study results with a final analysis ofthe effectiveness of SOD treatment and the clinical relevance of the obtained results.The final conclusions are:- SOD is a safe drug since any adverse effect has not appeared.- To prevent acute side effects, SOD has to be administered during radiotherapytreatment.- The treatment schedule for administering SOD to prevent acute side effects is notadequate to prevent late side effects.- SOD, administered during 7 weeks after finishing radiotherapy, is able to reduce theglobal delayed toxicity throughout all the period of the study, showing its effect fromthe 90th day when late radiation induced phenomena starts to appear.- SOD, used to prevent late radiation induced side effects, is able to avoid the globalappearance of delayed toxicity in a significant form. So that, a patient not treated withSOD has, in a significant form, a 37% more probabilities of developing toxicity until to24 months that one treated with SOD.- The toxicity reduction is specially pronounced in the low digestive tract, so that apatient not treated with SOD has, in a significant form, a 26% more probabilities ofdeveloping toxicity in the low digestive tract until to 24 months that one treated withSOD.