n aquest estudi s'ha dut a terme una nova aproximació de teràpia gènica per a la diabetis basada en l'expressió conjunta d'insulina i de glucoquinasa en el múscul esquelètic utilitzant vectors virals adenoassociats de tipus 1 (AAV1). Els ratolins diabètics tractats amb els vectors AAV1-Ins+GK varen recuperar i mantenir la normoglucèmia, tant en condicions d'alimentació com de dejú, al llarg de més de 4 mesos després de la inducció de diabetis experimental. A més, es va observar una normalització de la tolerància a la glucosa i de la ingesta de menjar i d'aigua. Així doncs, l'acció conjunta de la producció basal d'insulina i de l'activitat de la glucoquinasa haurien generat en el múscul esquelètic un "sensor" de la glucosa que permetria la correcta regulació de la glucèmia en ratolins diabètics, evitant així l'aparició de complicacions secundàries.Un dels principals reptes en el camp de la teràpia gènica és el pas dels protocols de transferència gènica des de models murins fins a models animals grans, com ara gossos. Per això, l'última part d'aquest estudi ha pretès iniciar els primers passos en aquesta direcció. L'administració d'un vector AAV1-Ins al múscul esquelètic d'un gos diabètic ha permès, en primer lloc, establir les condicions per a la transferència de vectors a múscul esquelètic de gossos diabètics; i en segon lloc, ha evidenciat la viabilitat d'aquest tractament per contrarestar la hiperglucèmia en condicions de dejuni, i per millorar-ne la tolerància a la glucosa. Així doncs, els estudis realitzats en ratolins han demostrat l'eficàcia a llarg termini del tractament basat en l'ús de vectors adenoassociats per a la producció d'insulina i de glucoquinasa en el múscul esquelètic per contrarestar la hiperglucèmia diabètica i prevenir així l'aparició de complicacions secundàries. D'altra banda, els estudis portats a terme en un model caní han posat de relleu l'efectivitat preclínica de la tècnica en grans animals, com a pas previ al desenvolupament d'assajos clínics. / In this study we designed a new gene therapy approach based on the expression of insulin together with glucokinase in skeletal muscle using adenoassociated virus vectors of serotype 1 (AAV1). AAV-treated diabetic mice completely restored blood glucose levels in fed and in fasted conditions for more than 4 months after diabetes induction. Moreover, the animals normalized glucose tolerance, as well as food and fluid intake. Thus, insulin action together with glucokinase activity have generated a glucose sensor in skeletal muscle that allows tight regulation of glucose levels in diabetic mice, avoiding long term secondary complications.One of the main goals in gene therapy field is to scale up gene transfer protocols from mice to large animal models, such as the dog. For this reason, the last part of this study aimed to develop the first steps in this direction. AAV1 administration of the insulin transgene to skeletal muscle in a diabetic dog established first, the conditions for gene transfer in skeletal muscle of a large animal model and secondly, have shown evidence of the ability of this treatment to counteract diabetic hyperglycemia in fasted conditions and to ameliorate glucose tolerance.In summary, the presented studies in mice have demonstrated the long term efficacy of the treatment using AAV vectors to produce insulin and glucokinase in skeletal muscle to counteract diabetic hyperglycemia and prevent secondary complications. On the other hand, the studies presented in the large animal model demonstrated the preclinical efficacy of the treatment in dogs as a first step towards clinical trials.

La Fru-2,6-P2 es l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1, enzim clau en el control i regulació de la via glucolítica. El paper d'aquest metabòlit en el múscul esquelètic encara no queda molt clar. En el present estudi es presenten dos objectius; el primer és caracteritzar la concentració de Fru-2,6-P2 i el patró d'expressió de les diferents isoformes de l'enzim 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa durant el desenvolupament del teixit muscular cardíac i esquelètic, tant a nivell proteic (western blot) com a nivell de mRNA (PCR a temps real). Així com, en músculs esquelètics de contracció lenta i ràpida en l'individu adult. El segon objectiu es centra en determinar la importància de la Fru-2,6-P2 en el control de la glucòlisi muscular.El primer objectiu es realitza mitjançant un model experimental que inclou diferents etapes del desenvolupament del cor i del múscul esquelètic de rata (Fetus de 19 dies post-concepció, 2, 5 i 10 dies post-naixement i d'estadi adult). D'aquest estudi es conclou que en l'estadi fetal la concentració de Fru-2,6-P2 en ambdós teixits està controlada per la isoforma ubiqua de l'enzim PFK-2/FBPasa-2, enzim que controla la síntesi i degradació del metabòlit. També s'ha observat com durant el desenvolupament es produeix la substitució de la isoforma ubiqua de l'enzim PFK-2/FBPasa-2 per la pròpia de cada teixit, és a dir, per la cardíaca en cor i la muscular en múscul.Per tal de resoldre el segon objectiu s'ha dissenyat un model experimental d'electroestimulació crònica a baixa freqüència (10 Hz) en conill. El protocol provoca la contracció del múscul tibialis anterior durant 24 hores, a continuació es concedeix un període de desncas de 48 hores. Sobre aquests músculs i per tal d'analitzar la glucòlisi muscular en ells es realitza un test d'exercici emprant el mateix sistema d'electroestimulació a baixa freqüència, durant 1, 3 i 10 segons. Els músculs estimulats i descansats presenten el mateix comportament fisiològic dels músculs en estat de repòs, quan s'aplica un protocol de força i/o de fatiga. La concentració de Fru-2,6-P2 augmenta fruit de l'electroestimulació durant 24 hores, aquest augment es manté fins i tot quan es deixa descansar al múscul fins a 48 hores. L'anàlisi de les concentracions dels metabòlits intermediaris de la glucòlisi després de 48 hores de descans reflexa una recuperació total davant del procés d'electroestimulació. Quan es determina l'estat de la via glucolítica en aquests músculs s'ha observat un augment en la utilització de la mateixa en els primers instants del test d'exercici, coincidint amb un augment significatiu de l'activitat de l'enzim PFK-1, mesurat a través del quocient Fru-1,6-P2/Fru-6-P, principal regulador de la via. Per primera vegada es demostra com un augment persistent de Fru-2,6-P2 pot jugar un paper important en la regulació de la glucòlisi muscular en els primers instants de l'exercici.La impossibilitat d'explicar els increments persistents de Fru-2,6-P2 a través de la isoforma muscular de l'enzim PFK-2/FBPasa-2, fa plantejar l'estudi del patró d'expressió de les diferents isoformes de l'enzim per determinar si es produeix alguna substitució isoenzimàtica que permeti explicar l'increment de la concentració de Fru-2,6-P2. L'anàlisi d'expressió de les isoformes a través de PCR a temps real i western blot permet concloure que l'augment de l'expressió de la isoforma cardíaca juntament amb la disminució de l'expressió de la resta d'isoformes de l'enzim permetrien l'increment de Fru-2,6-P2 observat en el estudi.