Entre las razones que indujeron a la realización del presente estudio podríamos citar las siguientes:a/. La alta prevalencia de la diabetes.b/. El considerable impacto (tanto individual como social) que supone la retinopatía diabética como complicación de la diabetes.c/. La necesidad de una optimización en el uso de los recursos humanos y materiales para el control de la enfermedad, con vistas a conseguir un diagnóstico lo más precoz posible, base imprescindible del éxito terapéutico.d/. El desconocimiento en términos cuantitativos del impacto actual, real y preciso que la enfermedad produce en nuestro medio, y sobre el que se basará cualquier proyecto de control presente o futuro de la enfermedad.e/. La tendencia al aumento de la incidencia de la retinopatía diabética.f/. Un intento de aproximación a las líneas de trabajo recomendadas por los proyectos nacionales (Sociedad Española de Oftalmología, Sociedad Española de Retina y Vítreo), Europeos (Declaración de Sant Vincent) o a escala mundial (Diabetes 2.000 de la Américan Academy of Ophthalmology).

OBJECTIU Avaluar l'efectivitat d'una intervenció sobre l'estil de vida en l'atenció primària catalana per prevenir la diabetis tipus 2 en població d'alt risc. MATERIAL I MÈTODE Estudi transversal (1ª-fase), estudi pseudoexperimental (2ª-fase). Mostra aleatòria de població no diabètica de referència (45-75anys). Doble cribratge: qüestionari FINDRISC i prova de tolerància oral a la glucosa (PTOG). Subjectes d'alt risc, sense diabetis, van rebre una intervenció per modificar l'estil de vida, estandarditzada/intensiva (individual o en grup). RESULTATS 2054 individus van completar el qüestionari FINDRISC i 1192 PTOG. Van acceptar la intervenció 552 (219 estandarditzada i 333 intensiva-230 en grup i 103 individual). Es va diagnosticar diabetis a 124 participants (28,8% intervenció estandarditzada i 18,3% intervenció intensiva). Reducció del risc relatiu de 36,5%; p<0,005. Mediana de seguiment 4,2 anys. CONCLUSIÓ La intervenció intensiva sobre l'estil de vida en l'atenció primària redueix de forma important la incidència de diabetis entre els individus amb risc elevat. / AIM To assess the effectiveness of an active Catalan primary care lifestyle intervention in preventing type 2 diabetes within a high-risk Mediterranean population. METHODS A cross-sectional screening study followed by a prospective cohort study. White-European individuals without diabetes (45–75 years) were screened using the Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC) and a subsequent 2 h OGTT. Where feasible, high-risk individuals who were identified were allocated sequentially to standard care or intensive lifestyle intervention (group-based or individual-level). RESULTS 2,054 individuals were screened by the FINDRISC and 1,192 received an OGTT. Of these, 552 accepted the lifestyle intervention (219 standard care and 333 intensive intervention–230 group-level and 103 individual-level). Diabetes was diagnosed in 124 individuals (28.8% standard care group and 18.3% intensive intervention group). Relative risk reduction was 36.5% (p<0.005) after 4.2-year median follow-up. CONCLUSION Intensive lifestyle intervention in a primary care setting substantially reduces diabetes incidence among high-risk individuals.

La glicogen sintasa (GS) és un enzim cabdal en el metabolisme de carbohidrats, catalitzant l’addició d’un residu glicosil a l’extrem no reductor d’una cadena de glicogen preexistent. Les GSs eucariotes són enzims altament regulats, tant per al•losterisme com per fosforilació. Gràcies a diferents estructures de GSs resoltes en els darrers anys ja es té una idea aproximada el mecanisme enzimàtic de la reacció, així com els llocs d’unió de la molècula donadora del grup glicosil UDP-glucosa. Tot i que experimentalment es coneix la gran afinitat entre la GS i el glicogen, l’acceptor en la reacció catalítica, se sap poc de la interacció d’ambdós. En el nostre laboratori es va identificar un lloc d’unió a carbohidrats a la superfície de la GS de l’arqueó Pyrococcus abyssi (PaGS) gràcies a la resolució de l’estructura cristal•logràfica d’aquest enzim unit a una molècula de maltohexaosa. En aquesta tesi es demostra que aquest lloc d’unió a carbohidrats de PaGS es tracta d’un lloc d’unió a glicogen funcional ja que, quan el modifiquem per mutagènesi, l’enzim perd la seva capacitat d’unió al glicogen. Aquesta pèrdua d’afinitat té un impacte directe sobre l’eficiència catalítica de PaGS a l’hora d’utilitzar glicogen com a substrat. Per alineament de seqüències deduïm una possible conservació d’aquest lloc d’unió en la glicogen sintasa muscular humana (HMGS). La mutació d’aquest domini de la HMGS resulta en una disminució de l’afinitat per glicogen de l’enzim, un canvi en la seva localització subcel•lular i un clar impacte en la capacitat de l’enzim per acumular glicogen in vivo. D’aquesta manera identifiquem fins a cinc residus aminoacídics, tots allunyats del centre actiu, la mutació dels quals disminueix l’afinitat de l’enzim pel glicogen i que formarien, per tant, part d’un nou lloc d’unió a glicogen no catalític en la HMGS, que es mostra com un element regulador crític responsable de l’eficiència catalítica de l’enzim in vivo. Una vegada establerta la importància del domini d’unió a glicogen en HMGS, mesurem l’afinitat de la isoforma hepàtica de la glicogen sintasa humana (HLGS) pel glicogen. Tot i que ambdues isoformes de la GS humana tenen una alta identitat en la seva seqüència d’aminoàcids, els resultats mostren que HLGS té una menor afinitat pel glicogen. No hem pogut identificar els residus responsables d’aquest canvi d’afinitat. Al nostre laboratori es va descriure per primera vegada com la HMGS transloca al nucli cel•lular quan exhaureix els seus reservoris de glicogen. Els mutants de HMGS que no s’uneixen al glicogen també transloquen al nucli cel•lular, confirmant el glicogen com a únic factor de retenció citoplasmàtic de HMGS. Finalment, en aquesta tesi també s’intenta deduir si la localització nuclear de HMGS té algun paper biològic. Hem aconseguit identificar tres proteïnes que col•localitzen al nucli cel•lular amb HMGS, i que tenen en comú la seva capacitat d’unió a ARN. Hem observat com la incubació amb l’inhibidor de la transcripción actinomicina D de cèl•lules amb HMGS nuclear fa que l’enzim transloqui a la perifèria nucleolar, comportament descrit per moltes altres proteïnes que uneixen ARN. Finalment, un assaig in vitro d’unió entre HMGS i ARN apunta a la possible interacció entre ambdós. Totes aquestes evidències recolzen una possible funció nuclear per a la HMGS. / Thesis title: “Determinants of glycogen binding and translocation of glycogen synthase”. Author: Carlos Martínez Pons. ABSTRACT Glycogen is a glucose polymer synthesized by the cell to store large amounts of glucose and is subsequently mobilized when energy demand increases. The importance of glycogen is reflected in its conservation among archaea, bacteria and eukarya. The glycogen granule is considered as a finely regulated organelle, with most of its proteins locating at the granule thanks to a direct interaction with glycogen through a carbohydrate-binding site. But it still remains unclear if these sites have other implications on protein regulation and catalytic performance. In this thesis we structurally identify a functional non-catalytic glycogenbinding site on a key enzyme of glycogen metabolism. When we mutate this carbohydrate-binding site we observe an alteration of the subcellular distribution of the enzyme and, moreover, a dramatic decrease of its catalytic performance, showing that the glycogen-binding site is not only used to remain bound at the glycogen granule, but that it is necessary for the proper functioning of the enzyme.

La neuropatia diabètica és una de les complicacions més freqüents de la Diabetis Mellitus. És una patologia del sistema nerviós perifèric que causa una incapacitat progressiva important de la funció motora i sensorial en els individus que la pateixen. L'afectació nerviosa es distingeix per una degeneració progressiva de les fibres nervioses i un retard en el procés de regeneració de les fibres danyades. Els símptomes de la neuropatia inclouen pèrdua de sensibilitat, rigidesa, coïssor i en ocasions dolor als peus i mans. La teràpia intensiva amb insulina redueix la incidència de les complicacions de la diabetis però els pacients diabètics continuen desenvolupant neuropatia diabètica a llarg plaç. Els tractaments actuals per la neuropatia diabètica no són efectius i estan orientats principalment a pal·liar el dolor neuropàtic. La teràpia gènica podria ser un tractament alternatiu per aquesta patologia. Els vectors Adeno-associats són uns dels vectors de teràpia gènica interessants per assajos clínics en humans, ja que són capaços de dirigir l'expressió del transgen a llarg plaç, mantenint-se de forma episomal a la cèl·lula hoste. A més no presenten toxicitat associada al virus silvestre, el que augmenta la bioseguretat d'aquests vectors i es poden produir a títols alts. La recent descripció de nous serotips de vectors Adeno-associats, els quals entren a les cèl·lules humanes mitjançant diferents receptors cel·lulars, ha obert la possibilitat de delimitar selectivament la infecció de diferents tipus cel·lulars dins d'un mateix òrgan. Amb la finalitat de caracteritzar vectors com a eines de teràpia gènica eficients per neuropatia diabètica es van utilitzar els serotips AAV1 i AAVrh10 per infectar cultius organotípics de ganglis de l'arrel dorsal (DRG) de ratolí. Ambdós vectors van mostrar un tropisme preferencial per neurones sensorials petites, correlacionant després amb el tipus de neurones transduïdes més eficientment mitjançant injecció intratecal in vivo en ratolins. L'estabilitat dels vectors AAV1 i AAVrh10 in vivo es va confirmar fins a setmana 10, duració màxima de l'experiment. No obstant l'eficiència d'AAVrh10 era molt superior a la d'AAV1 tant a neurones sensorials com motores, aconseguint un percentatge de transducció al voltant del 50% en DRG i del 30% en motoneurones amb el serotip rh10. A més a més, s'ha demostrat que AAV1 és més immunogènic que AAVrh10 quan s'injecten a líquid cefaloraquidi, doncs l'administració d'AAV1 genera un títol molt més elevat d'anticossos neutralitzants en sang contra aquest serotip. Com a assaig preclínic de teràpia gènica es van administrar els vectors AAV1 i AAVrh10 codificant per el factor de creixement similar a la insulina I (IGF-I) o codificant per la proteïna GFP com a control, en el líquid cefaloraquidi d'un model murí per neuropatia diabètica, que combina diabetis induïda amb estreptozotozina (STZ) junt amb lesió a nervi ciàtic (crush). IGF-I és un factor de creixement que juga un paper important en la supervivència i diferenciació de neurones, oligodendròcits i cèl·lules de Schwann i també en la formació de la mielina. Aquest factor de creixement ha estat utilitzat com a tractament d'una gran varietat de patologies del sistema nerviós, incloent neuropaties diverses, degut a la seva acció com a potent agent en la supervivència i diferenciació cel·lular. L'anàlisi molecular dels nervis perifèrics dels animals tractats amb AAV-IGF-I mostrava un augment de l'expressió del gen terapèutic IGF-I, que correlacionava amb l'activació de la via de senyalització d'aquest factor de creixement, així com dels gens implicats en la regeneració (GAP43) o els gens relacionats amb la mielina (P0, PMP22, MAG, MBP), en comparació amb els animals control. A diferència d'AAV1, AAVrh10 mostrava expressió del transgen també en neurones motores de la medul·la espinal. La correlació entre les dades bioquímiques obtingudes i els tests neurofisiològics realitzats en els animals injectats amb AAV-IGF-I, va permetre observar una millora de la velocitat de conducció nerviosa sensorial en els animals tractats amb AAV1-IGF-I i una millora de la velocitat de conducció nerviosa sensorial i motora en els animals transduïts amb AAVrh10-IGF-I, respecte els animals diabètics control. Per tant, l'administració intratecal dels vectors AAV1 i principalment AAVrh10 codificant per IGF-I ofereixen una visió prometedora pel tractament o prevenció de les neuropaties perifèriques, en general, i de la neuropatia diabètica, en concret. / Diabetic neuropathy is one of the most common complications of diabetes mellitus. It is a peripheral nervous system disease that causes a progressive inability of sensory and motor nerve function in diabetic patients. Abnormalities are characterized by progressive degeneration of nerve fibres and a delay in the regeneration process of damaged fibres. Symptoms of neuropathy include loss of sensitivity, stiffness, burning sensation and sometimes pain in feet and hands. Intensive insulin therapy reduces the incidence of complications in diabetic patients but diabetic neuropathy continues to develop at long-term. Current treatments for diabetic neuropathy are not effective and are targeted primarily to alleviate neuropathic pain. Gene therapy could be an alternative treatment for this disease. Adeno-associated (AAV) vectors are interesting gene therapy vectors for human clinical trials since they are capable of directing expression of the transgene in the long term, maintained as episomal in the host cell nuclei. Besides, they do not show toxicity associated with wild-type virus, which increases the bio-safety of these vectors, and they can be produced at high titters in the laboratory. The recent description of new serotypes of adeno-associated vectors, which enter the human cells by different cellular receptors, has opened the possibility to selectively infect particular cell types in a defined organ. In order to characterize AAV vectors as tools for gene therapy for diabetic neuropathy, AAV1 and AAVrh10 serotypes were used to infect organotypic cultures of mouse dorsal root ganglia (DRG). Both vectors showed a preferential tropism for small sensory neurons, correlating with the type of neurons more efficiently transduced by intrathecal injection in mice. The stability of AAV1 and AAVrh10 vectors in vivo were confirmed up to 10 weeks, maximum duration of the experiments. However, AAVrh10 efficiency was significantly higher than AAV1, both in motor and sensory neurons, reaching transduction levels of about 50% in DRG neurons and 30% in motoneurons with serotype rh10. In addition, we have demonstrated that AAV1 is more immunogenic than AAVrh10 when injected into the cerebrospinal fluid, as administration of AAV1 generates significantly higher titre of circulating neutralizing antibodies against this serotype in blood. As a preclinical trial of gene therapy, was administered AAV1 and AAVrh10 vectors coding for insulin-like growth factor I (IGF-I) or for green fluorescent protein (GFP), as a control, in the cerebrospinal fluid of a mouse model for diabetic neuropathy, combining streptozotozin-induced diabetes with sciatic nerve injury (crush). IGF-I is a growth factor that plays an important role in the survival and differentiation of neurons, oligodendrocytes and Schwann cells and in the formation of myelin. This growth factor has been used to treat a variety of diseases affecting the nervous system, including various neuropathies, due to its role in cell differentiation and survival. Molecular analysis of the peripheral nerves of animals treated with AAV-IGF-I showed increased expression of the therapeutic gene, IGF-I, which correlates with activation of the signalling pathway of this growth factor and genes involved in regeneration (GAP43) or myelin-related genes (P0, PMP22, MAG, MBP), compared with control animals. Unlike AAV1, AAVrh10 also showed expression of the transgene in motor neurons of the spinal cord. The correlation between data obtained from biochemical and neurophysiological tests conducted in animals injected with AAV-IGF-I, showed an improvement in sensory nerve conduction velocity in mice treated with AAV1-IGF-I and improved motor and sensory nerve conduction velocity in animals transduced with AAVrh10-IGF-I, compared to control diabetic animals. Therefore, intrathecal administration of AAV1 and, mainly, AAVrh10 vectors coding for IGF-I offer a promising approach for the treatment or prevention of peripheral neuropathies, in general, and diabetic neuropathy, in particular.

La diabetis mellitus és una malaltia metabòlica molt freqüent, que comprèn una gran varietat de síndromes amb diferents etiologies i afecta en total a un 2-7% de la població mundial. Aquesta malaltia es caracteritza, bàsicament, per una hiperglucèmia deguda a la manca d'insulina o bé a una alteració en l'acció de l'hormona. Al nostre laboratori estem desenvolupant aproximacions per reduir la hiperglucèmia diabètica mitjançant la manipulació genètica de teixits extrapancreàtics per tal que captin glucosa. Per comprovar in vivo la validesa d'aquestes aproximacions hem dut a terme estudis en diferents models d'animals transgènics i genosuprimits.El múscul esquelètic és el principal teixit implicat en la captació de glucosa sanguínia després d'una ingesta, eliminant al voltant d'un 75% del sucre. El teixit muscular capta glucosa per difusió facilitada de forma dependent i independent de la insulina. Per tant, com a conseqüència de la manca d'insulina en la diabetis tipus 1 o de la resistència a l'hormona en la diabetis tipus 2, el múscul esquelètic és incapaç de captar glucosa de la sang.En el nostre laboratori s'havien generat ratolins transgènics que expressen l'enzim hepàtic glucoquinasa en múscul esquelètic. Aquests ratolins presenten un increment en la captació i utilització de la glucosa, però romanen hiperglucèmics en alimentació després del tractament amb STZ. Aquest fet podria ser degut a una alteració en el transport de la glucosa cap a l'interior de la cèl.lula muscular. Així, en aquest treball hem obtingut ratolins transgènics que expressen ambdós, el transportador GLUT2 i l'enzim GK, en múscul esquelètic, amb la finalitat d'incrementar el transport i la fosforilació de la glucosa. Això es va realitzar per tal d'estudiar si la coexpressió d'aquestes proteïnes resultava en una normalització de la hiperglucèmia diabètica. No obstant, els resultats obtinguts indiquen que l'expressió de GLUT2 en múscul esquelètic de ratolins MLC/GK tractats amb STZ no millora els resultats obtinguts amb ratolins que expressen únicament GK a múscul. En canvi, i contràriament als ratolins control diabètics, hem demostrat que petites dosis d'insulina exògena permeten aconseguir una normalització de la glucèmia en animals diabètics que expressen GK en múscul esquelètic.Per altra banda, també s'han manipulat cèl.lules musculars en cultiu per tal que expressin l'enzim GK i estudiar si el transplantament d'aquestes cèl.lules a ratolins tractats amb STZ permet aconseguir una contrarrestació o una prevenció de la hiperglucèmia diabètica. Els resultats presentats en aquesta memòria mostren que els mioblasts C2C12 que expressen GK presenten un increment en la captació de glucosa de forma dependent de la concentració extracel.lular del sucre. Així, quan aquestes cèl.lules són transplantades a ratolins tractats amb STZ, els animals presenten una disminució de la hiperglucèmia diabètica degut a un increment en la captació i utilització de la glucosa per part de l'implant. Per tant, això podria constituir una aproximació ex vivo per tal d'incrementar l'eliminació de glucosa sanguínia en la diabetis tipus 1.Les causes de l'aparició de diabetis tipus 2 encara són desconegudes, però es creu que interaccionen la susceptibilitat genètica i una sèrie de factors ambientals, principalment la dieta i l'activitat física. En el present estudi hem investigat l'efecte de l'expressió de GK en múscul esquelètic de ratolins models de resistència a la insulina. Per dur a terme això hem utilitzat dues aproximacions diferents: per una banda, s'ha expressat GK en múscul esquelètic d'un model de resistència a la insulina obtingut per combinació d'una alteració genètica a la via de senyalització de l'hormona, concretament una genosupressió parcial de l'IRS-1 (IRS-1+/-), juntament amb una dieta d'alt contingut en lípids. Per altra banda s'ha electrotransferit in vivo el gen de la GK a múscul esquelètic d'animals IRS-1-/-, un model de resistència a la insulina sense obesitat prèviament descrit i caracteritzat (Araki, 1994; Tamemoto, 1994). Així, els resultats obtinguts en aquesta part de l'estudi suggereixen que l'expressió de GK en múscul esquelètic permetria una millora en la sensibilitat a la insulina en aquests dos models de resistència a l'hormona. Per tant, l'expressió de GK en múscul esquelètic també podria resultar una bona aproximació per tal d'incrementar la captació de glucosa i incrementar la sensibilitat a la insulina en la diabetis tipus 2. / Diabetes mellitus is the most common of all metabolic disorders, and comprises a great variety of disorders with different aetiologies. This disorder is mainly characterized by hyperglycemia due to a lack of insulin or a defect in insulin activity in peripheral tissues. Increased glucose disposal by tissues engineered to express key regulatory genes in glucose transport or phosphorylation can reduce diabetic hyperglycemia. To investigate this approach in vivo, we performed studies in different transgenic and knock-out animal models. Skeletal muscle is the major site for insulin-mediated whole-body glucose disposal and it has been stimated to account for about 75% of glucose uptake after a meal. To reduce or delay the development of secondary complications, diabetic hyperglycemia might be decreased by engineering skeletal muscle to increase glucose transport and/or glucose phosphorylation. In our laboratory, transgenic mice expressing glucokinase in skeletal muscle were obtained. These mice showed an increase in glucose uptake and utilization, and a partial reduction in diabetic hyperglycemia after streptozotocin-treatment, but glucokinase expression did not restore normal glycemia. A decrease in glucose transport might impair glucokinase-induced glucose phosphorylation in these animals. Here we examined whether the expression of the glucose transporter 2 (GLUT2) in skeletal muscle increases glucose uptake and counteracts diabetic hyperglycemia. To this end, transgenic mice expressing both glucokinase and GLUT2 genes in skeletal muscle were obtained. However, our results showed that GLUT2 expression in skeletal muscle doesn't increase glucose uptake in streptozotocin-treated transgenic mice expressing glucokinase. Furthermore, injection of low doses of soluble insulin to fed streptozotocin-treated GLUT2/glucokinase-expressing or glucokinase-expressing mice restored normoglycemia, indicating that these mice were more sensitive to the hormone treatment as the streptozotocin-treated control diabetic mice. Furthermore, here we examined whether genetically manipulated glucokinase (GK)-expressing muscle cells could remove excess glucose from blood, without causing hypoglycemia, as a new ex vivo gene therapy approach to diabetic hyperglycemia. After streptozotocin treatment, mice transplanted with GK-expressing myotubes counteracted hyperglycemia, whereas mice transplanted with control myotubes developed diabetes. These results suggest that the use of GK-expressing myotubes may be a suitable approach to reduce diabetic hyperglycemia.Although the aetiology of type 2 diabetes is unclear, both genetic factors and environmental factors (high-energy diets combined with a sedentary lifestyle) seem to contribute to the onset of this disease. In type 2 diabetes, glucose phosphorylation, a regulatory step in glucose utilization by skeletal muscle, is impaired. Here we investigated the effect of GK expression in skeletal muscle in insulin resistance animal models. To this aim, we have studied two different approaches:first, we expressed GK in skeletal muscle in an insulin resistance animal model obtained by combining a genetic alteration in insulin's signal transduction pathway (a targeted partial disruption of the IRS-1 gene, IRS-1+/-), with a high fat diet. Furthermore, GK gene was electrotransfered invivo to skeletal muscle of IRS-1-/- knock-out mice, an insulin resistance animal model without obesity which was previously described and characterized (Araki, 1994; Tamemoto, 1994). Our results indicate that the increase in glucose phosphorylation by GK gene expression in skeletal muscle may lead to an increase in insulin sensitivity in this two different animal models. Therefore, GK expression in skeletal muscle may be a therapeutic approach to increase glucose uptake and to improve insulin sensitivity in type 2 diabetes.

La obesidad y la diabetes de tipo 2 se han convertido en las dos grandes epidemias de los países desarrollados y en vías de desarrollo. El conocimiento de las causas y mecanismos que desencadenan la obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2 es de vital importancia para su posterior prevención y tratamiento. Tanto la producción de glicerol-3¬fosfato como la obtención de ácidos grasos libres son fundamentales para la síntesis de triglicéridos por el tejido adiposo. Por tanto, alteraciones metabólicas primarias en el tejido adiposo que incrementen la obtención de glicerol-3-fosfato podrían aumentar su capacidad de almacenar lípidos, induciendo el desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes de tipo 2. En condiciones fisiológicas, se considera que el adipocito produce glicerol-3-fosfato a partir de la glucosa durante el periodo post-prandial, o a través de la gliceroneogénesis durante el ayuno. Así, en la primera parte de este estudio, se analizaron los efectos de un incremento en la gliceroneogénesis del tejido adiposo a través de la sobreexpresión de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) en ratones. La sobreexpresión de PEPCK llevaba a un incremento en la reesterificación de ácidos grasos y un mayor depósito de lípidos en tejido adiposo. Aunque estos animales eran obesos hipertróficos, mostraban una sensibilidad a la insulina y tolerancia a la glucosa similar a los controles. Ello probablemente era debido a la ausencia de niveles elevados de FFAs, junto con la ausencia de depósito de grasa en tejidos no adiposos y altos niveles de adiponectina sérica. Posteriormente, los ratones transgénicos aP2-PEPCK se alimentaron con una dieta alta en lípidos durante un breve período. Tras la dieta, estos animales presentaban obesidad mórbida y una severa resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa respecto a los controles. Por tanto, los efectos combinados de la dieta alta en lípidos junto al incremento en la reesterificación de ácidos grasos en tejido adiposo, probablemente saturaban la capacidad de éste de almacenar lípidos. Ello llevaba al depósito de lípidos en hígado y a hipertrigliceridemia. Además, la acumulación de lípidos en tejido adiposo marrón disminuía su capacidad termogénica. Todo ello contribuiría a la obesidad y resistencia a la insulina tan severas que presentaban estos animales transgénicos tras la dieta. Estos resultados sugieren que la capacidad del tejido adiposo blanco para almacenar lípidos es crucial para el mantenimiento de la sensibilidad a la insulina. Por otra parte, un incremento en la fosforilación de la glucosa por el tejido adiposo podría llevar a una mayor esterificación de ácidos grasos y depósito de lípidos, a través de un aumento en su obtención de glicerol-3-fosfato. Por ello, en la segunda parte del estudio, se expresó la enzima glucoquinasa (GK) en tejido adiposo de ratones, una enzima reguladora de la utilización de glucosa en hígado. La presencia de GK en tejido adiposo incrementaba su captación basal de glucosa, y mejoraba la tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina en estos animales. A pesar de la mayor captación de glucosa en tejido adiposo blanco, ello no generaba más glicerol-3-fosfato ni alteraba su depósito de lípidos, sino que aumentaba su producción de lactato, incrementando sus niveles circulantes. Todos estos resultados sugieren que la regulación del aporte de glicerol-3-fosfato contribuye al control de la síntesis de triglicéridos. Además, muestran la implicación directa de la PEPCK en la síntesis de glicerol-3-fosfato y resaltan el papel clave de la gliceroneogénesis en la reesterificación de ácidos grasos y la acumulación de grasa en el tejido adiposo. Sin embargo, el incremento en la captación de glucosa no es suficiente para promover la generación de glicerol-3-fosfato y el depósito de grasa. / Obesity and type 2 diabetes are the two most important health problems in Western societies. The mechanisms underlying the development of obesity, insulin resistance and type 2 diabetes are not fully understood. Obesity results from an imbalance between energy intake and expenditure, leading to increased energy storage in the form of triglycerides in white adipose tissue (WAT). Adipocytes synthesize triglyceride by esterification of free fatty acids (FFA) with glycerol-3-phosphate and net lipid deposition occurs when esterification is higher than lipolysis. Although glucose is traditionally viewed as the main precursor of the glycerol backbone for triglyceride synthesis, it may also be synthesized from pyruvate or lactate through glyceroneogenesis when glucose supply is limited, as fasting conditions. A regulatory step of glyceroneogenesis is catalized by phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). Thus, in the first part of this study, increase in glyceroneogenesis was analyzed in transgenic mice overexpressing PEPCK in adipose tissue. PEPCK overexpression led to increased FFA re-esterification, higher adipocyte size, fat mass, body weight and circulating adiponectin and decreased circulating FFA. Moreover, despite obesity, glucose tolerance and whole-body insulin sensitivity were preserved. This suggests that obesity without increased circulating FFA does not lead to insulin resistance or type 2 diabetes. Surprisingly, when fed a high-fat diet for a short period (6 weeks), transgenic mice developed severe obesity and were more hyperinsulinemic, glucose intolerance and insulin resistance than controls. In these animals, high-fat feeding in the presence of increased FFA reesterification leads to triglyceride accumulation in white and brown adipose tissue and to fat storage saturation. This impairs the role of white adipose tissue in buffering the flux of circulating lipids, leading to fat deposition in liver, hypertriglyceridemia and insulin resistance. Furthermore, fat accumulation in brown adipose tissue probably may reduce diet-induced thermogenesis, contributing to severe obesity and insulin resistance. All these results suggest that the regulation of the lipid storage capacity of white adipose tissue is crucial to the maintenance of insulin sensitivity. On the other hand, alterations in nutrient partitioning and particularly in glucose metabolism may contribute to obesity and type 2 diabetes. In an attempt to increase glucose uptake and triglyceride esterification, transgenic mice were engineered to increase glucose phosphorylation in adipose tissue. To this end, and to avoid the feedback inhibition of hexokinase activity by glucose-6-phosphate, the liver enzyme glucokinase (GK) was expressed under the control of aP2 promoter. Transgenic mice showed high levels of GK expression in white adipose tissue which led to increased adipose tissue basal glucose uptake. Consistent with this, transgenic mice presented increased glucose tolerance and higher whole-body insulin sensitivity than controls. Surprisingly, despite increased glucose uptake, body fat content and glycerol-3 phosphate synthesis were not altered in transgenic mice compared with controls. In vitro as well as in vivo studies using nuclear magnetic resonance showed that adipose tissue from transgenic mice released higher amounts of lactate than that from controls. This suggests that the major product from increased glucose uptake is lactate rather than glycerol-3 phosphate, leading to higher circulating lactate levels within physiological range. All these results reinforce the idea that glyceroneogenesis and PEPCK may be crucial to regulate triglyceride synthesis in adipose tissue. However, the increased glucose uptake in adipocytes is not sufficient to promote glycerol-3-phosphate synthesis and lipid deposition.

No description available.

Els limfòcits T autorreactius, responsables de la destrucció de les cèl.lules beta pancreàtiques en la DT1, presenten un repertori TCR esbiaixat segons s’ha demostrat al model experimental del ratolí NOD. Per a definir el repertori TCR autorreactiu en la diabetis humana, hem estudiat les poblacions i expansions monoclonals intra-illot d’un pàncrees de debut i les hem comparat amb les de la sang perifèrica i a la melsa del mateix individu. L’estudi de les cèl.lules T intra-pancreàtiques ha mostrat un repertori divers però amb cinc expansions monoclonals per a les famílies gèniques Vβ1, Vβ7, Vβ11, Vβ17, i Vβ22. Mitjançant el -CDR3, s’ha identificant la mateixa expansió monoclonal Vβ22 als illots i a la melsa, i també se n’ha detectat la seqüència en PBMCs. Per a valorar el biaix als TCR, s’ha analitzat 139 seqüències CDR3 de cadena beta de diferents clons infiltrants i s’ha observat una prevalença d’alguns aminoàcids a l’ NDN, que indica una restricció allunyada de l’atzar. Les seqüències CDR3 de les cinc expansions monoclonals pancreàtiques (incloent la comú a la melsa) s’ajusten a la restricció en NDN definida a partir dels limfòcits del pàncrees. El sub-clonatge i la expansió in–vitro (amb extracte d’illots i anti-CD3) de l’infiltrat pancreàtic, ha mostrat una alteració del repertori original però ha permès aïllar un clon present a l’infiltrat que expressa un doble TCR i que manté també els paràmetres de restricció definits a l’infiltrat original. El clon V22 s’ajusta a la restricció de -CDR3 establerta a l’infiltrat, i representa la única expansió monoclonal del pàncrees observada a la sang perifèrica i la melsa de l’individu. Aquest clon, es podria haver expandit o acumulat in situ per la presència d'un autoantigen comú en ambdós òrgans i d’aquesta manera es postula que la melsa de l’individu podria contribuir a la perpetuació de la malaltia per expansió o retenció d’alguns clons T autorreactius. / Autoreactive T cells, responsible for the destruction of pancreatic beta cells in type 1 diabetes (T1D), have a biased TCR repertoire as has been demonstrated by the NOD mouse experimental model. To define the TCR repertoire of autoreactive cells in human diabetes, we have studied intra-islet populations and monoclonal expansions of a pancreas in diabetic onset and compared them with peripheral blood and spleen populations from the same patient. The study of intra-pancreatic T cells, showed a diverse repertoire but with five monoclonal expansions in the gene families Vβ1, Vβ7, Vβ11, Vβ17, and Vβ22. By TCR’s  chain CDR3 (-CDR3) analysis, the same Vβ22 monoclonal expansion could be identified in the spleen and islets, and the same sequence was detected in PBMCs. To evaluate the existance of a bias in the pancreatic TCR repertoire, we analyzed 139 -CDR3 sequences from different infiltrating clones and prevalence of certain amino acids in the NDN was observed, thus indicating the existance of non-random restriction. CDR3 sequences from that five pancreatic monoclonal expansions (including the one equal in spleen) adjusted to the restrictions defined in NDN from the pancreas lymphocytes. The sub-cloning and in vitro expansion of pancreas infiltrating cells (with islets’ extract and anti-CD3) showed an alteration of the original repertoire, but allowed to isolate a clone expressing two TCRs that did also maintain the restriction parameters defined in the original infiltrate. The clone V22, fits that -CDR3 restriction established for infiltrating cells, and represents the only monoclonal expansion in the pancreas that is also observed in the peripheral blood and spleen of the patient. That clone should have been expanded, or accumulated, in situ in the presence of an autoantigen common to both organs, so is postulated that the spleen could contribute to the perpetuation of the disease by expansion or retention of some T autoreactive T cell clones.

La producció de glucosa hepàtica està sotmesa a un estricte control hormonal i de substrats. En individus diabètics, l'increment de la gluconeogènesi hepàtica, secundària a la resistència a insulina o a la manca de secreció de la hormona, repercuteix de forma directa sobre l'homeòstasi de la glucosa. A més, s'ha observat una relació directa entre la sobreexpressió de PEPCK-C, l'increment de la producció hepàtica de glucosa i el desenvolupament d'hiperglucèmia en models animals. Malgrat aquest conjunt d'evidències, la validació de PEPCK-C com a diana terapèutica per a disminuir la producció hepàtica de glucosa en la diabetis no ha estat investigada en profunditat fins al moment.No obstant, una gran controvèrsia ha esdevingut en els últims anys sobre la preponderància de la gluconeogènesi hepàtica en el control de la glucèmia. Els estudis amb ratolins genosuprimits per PEPCK-C hepàtica han demostrat que la supressió de l'enzim de manera específica al fetge, aboleix la gluconeogènesi sense afectar al control de la glucèmia en repòs, i han demostrat la rellevància de l'activitat PEPCK-C en el metabolisme energètic a través del manteniment del flux del cicle de Krebs. Resulta essencial el fet que, tant el context fisiopatològic com l'abast de la supressió de l'activitat PEPCK-C al fetge divergeixen entre aquest model de ratolí genosuprimit i el model de diabetis experimental o genètica estudiats en el nostre laboratori. Amb aquests precedents, ens vàrem interessar per estudiar els efectes aguts sobre l'homeòstasi energètica i de la glucosa derivats la modulació de l'activitat PEPCK-C hepàtica a fi de validar aquest enzim com a una possible diana per a una estratègia terapèutica per a controlar la hiperglucèmia diabètica. Per a assolir aquest objectiu general, s'ha aplicat tècniques de RNA d'interferència sobre diferents models animals de la patologia diabètica.Per això ens vam plantejar estudiar: a) les implicacions de la silenciació de PEPCK-C sobre l'homeòstasi de la glucosa i la resistència a la insulina en el marc de la patofisiologia de la diabetis b) la rellevància de la magnitud de la silenciació de PEPCK-C en fetge envers dels efectes sobre la cataplerosi i la funció mitocondrial, i c) les alteracions del metabolisme energètic resultants de la reducció de la gluconeogènesi hepàtica en el context de la resistència a la insulina.Aquests estudis ens han permès extreure importants conclusions sobre la implicació de PEPCK-C en el control de la gluconeogènesi i la glucèmia, validant idoneïtat de la PEPCK-C hepàtica com a diana una terapèutica plausible per la diabetis.

Como es sabido, la edad pediátrica está caracterizada ante todo por el fenómeno del crecimiento y desarrollo. El recién nacido es el exponente máximo de este dinamismo, con aspectos evolutivos únicos en su pasado fetal y en su adaptación a la vida extrauterina. De ahí que la Neonatología, entre otros motivos, sea una de las subespecialidades pediátricas mejor definidas.Por otra parte, aunque los avances de la Pediatría en lo referente a la mortalidad infantil son obvios, el período neonatal sigue siendo el más vulnerable. La mortalidad en la época del lactante entre los años 1950 y 1970 descendió del 70 al 30/1000, mientras que en el mismo período la mortalidad neonatal se mantuvo alrededor del 20/1000. En el año 1980 la mortalidad infantil era del 15,6/1000, correspondiendo al período neonatal el 10,9/1000. En Cataluña, en el año 1986, la mortalidad hasta los 5 años fue del 0,43/1000 habitantes, pero en el período neonatal la mortalidad era de 5,54/1000 recién nacidos vivos. Por todo ello no resulta difícil comprender que el centro de gravedad de la investigación pediátrica se halle actualmente en torno a la época neonatal. Dentro de los recién nacidos (RN), el grupo de los hijos de madre diabética (HMD) se caracteriza por su alta incidencia; de hecho, hasta el 3,80% de los RN vivos de este Hospital proceden de gestaciones diabéticas. En el presente Departamento de Pediatría, el Profesor Xavier Pastor Durán inició una línea de investigación neonatológica sobre este grupo, un excelente trabajo que dio pie a otros estudios en la misma línea. Sin embargo, quedaban algunos aspectos de este tema en particular que no han sido suficientemente aclarados, parte de los cuales son objeto de atención en la presente tesis doctoral.En concreto, nuestro trabajo se ha centrado en el estudio del HMD en los aspectos hematológicos que presentan estos recién nacidos, y en particular en la poliglobulia, que es una de las complicaciones más frecuentes del HMD. En nuestro estudio retrospectivo se ha revelado que la poliglobulia se halla presente en el 9,8% de la muestra, frente a una incidencia máxima de 2.8% de poliglobulias a nivel del mar y en nuestro medio. Por otra parte, la poliglobulia patológica provoca el síndrome de hiperviscosidad, con una elevada morbilidad, y su tratamiento (exanguinotransfusión parcial) es una técnica cruenta no exenta de complicaciones.Existe un cierto debate sobre cuál es la causa de la mayor incidencia de poliglobulia en el HMD. Al parecer se trata de una situación temporal, secundaria a algún factor presente en la vida intrauterina, ya que las alteraciones hematológicas desaparecen en las primeras semanas de vida. Esta poliglobulia se acompaña de signos de eritropoyesis activa, con niveles elevados de Epo en sangre de cordón. Dado que la hipoxia es el principal estímulo para la síntesis de Epo y se ha demostrado la existencia de esa situación en los fetos HMD, parece lógico considerar que la poliglobulia se deba a la existencia de hipoxia fetal en la gestación diabética.Sin embargo, surge una paradoja: el HMD (que suponemos hipóxico) posee un peso normal o incluso elevado para su edad gestacional, a diferencia de otros RN procedentes de gestaciones complicadas con hipoxia fetal, y que también presentan mayor incidencia de poliglobulia con cifras de eritropoyetina aumentadas, pero con un peso normal o bajo para su edad gestacional. La macrosomía del HMD se ha explicado por la hipótesis de Pedersen, según la cual se trataría de un feto hiperglucémico, y como es sabido que la insulina es la principal hormona anabolizante fetal. Existen otros datos que interesan en la génesis de la poliglobulia del HMD. Ha sido demostrado que la insulina y las somatomedinas o factores de crecimiento insulin-like (IGF-I e IGF-II) son capaces de estimular la eritropoyesis. Resultados parciales, pero similares, se han obtenido en el HMD, pero no se puede afirmar con total seguridad que la poliglobulia del HMD se deba exclusivamente a la influencia de la insulina, aunque sí parece tener un papel aparente.Otra característica hematológica del HMD es la presencia de un porcentaje de Hb fetal superior al correspondiente para su edad de gestación. Este fenómeno puede ser atribuido al estímulo de la Epo sobre la eritropoyesis fetal, aunque en otras situaciones de hiperinsulinismo fetal también se altera dicha proporción.De todas maneras, al parecer en la explicación de las alteraciones hematológicas del HMD no interviene tan sólo el binomio Eritropoyetina-Insulina, ya que pueden actuar otras hormonas moduladoras de la eritropoyesis, como son los glucocorticoides, andrógenos, hormonas tiroideas, hormona de crecimiento, somatotropina coriónica humana y factores de crecimiento insulin-like (IGF-I e IGF-II). En efecto, se han encontrado presencias elevadas de algunas de dichas hormonas en el HMD. Hasta el momento, las hipótesis propuestas han sido experimentadas principalmente en modelos animales. En efecto, aunque se han realizado algunos estudios sobre el RN humano, en los que comienzan a comprobarse distintas hipótesis, en general sólo alcanzan una visión parcial de cada uno de los aspectos, y ninguno de dichos estudios incide en la problemática de nuestro país. Por todo lo expuesto, hemos considerado pertinente para el presente trabajo plantear los siguientes objetivos:1. Confirmar si existe relación entre la poliglobulia del HMD y las cifras de eritropoyetina de estos recién nacidos.2. Establecer la posible relación entre los indicadores de poliglobulia del HMD y los propios de la fetopatía diabética, que incluyen los datos de tipo somatométrico (macrosomía) y los marcadores endocrino-metabólicos (hiperinsulinismo fetal).3. Determinar si los parámetros hematológicos están influidos también por otros factores perinatales, tanto de hipoxia crónica fetal (hábito tabáquico materno, posible disfunción placentaria) como de hipoxia aguda intraparto.4. Establecer la influencia del control metabólico de la gestante diabética sobre los indicadores de poliglobulia y la eritropoyetina del HMD.