Amb l'objectiu d'identificar gens potencialment involucrats en la fisiopatologia de la diabetis mellitus de tipus 2 i l'obesitat es va realitzar al nostre laboratori un experiment d'hibridació sostractiva amb músculs de rates Zucker ZDF obeses i diabètiques i rates. Un dels gens identificats en aquest estudi no havia estat descrit anteriorment; se'l va anomenar DOR, de l'anglès "Diabetes and Obesity Regulated gene". La manca absoluta d'informació prèvia a la literatura sobre DOR fa que la finalitat general d'aquesta tesi sigui identificar i caracteritzar la seva funció a nivell cel·lular. Per aquest motiu primerament es va analitzar la seqüència de la proteïna en busca de senyals o dominis que poguessin aportar informació sobre la seva funció. Diversos indicis indicaven que DOR podia ser una proteïna implicada en la regulació de la transcripció. Concretament, la presència d'una putativa caixa LxxLL, típica de coactivadors de receptors nuclears, indicaven que DOR podia ser un coactivador. Experiments amb vectors reporter van confirmar que la proteïna DOR exerceix de coactivador dels receptors nuclears TRα, PPARγ, GRα, ERα i VDRα. Posteriorment es va realitzar una fusió de la proteïna DOR amb el domini d'unió a DNA del factor de transcripció de llevat Gal4 (Gal4 DBD). D'aquesta manera es va demostrar que DOR té un domini d'activació de la transcripció, ja que aquesta proteïna de fusió és capaç d'activar l'expressió d'un reporter de Gal4. A més, través de fusions amb el Gal4 DBD de fragments de la proteïna DOR, es va poder mapar en quina regió de la proteïna es localitza aquest domini d'activació de la transcripció. La cerca a bases de dades va detectar diverses proteïnes de diferents espècies amb homologia amb DOR, que podien ser, per tant, ortòlegs de la proteïna. La fusió d'aquests possibles ortòlegs amb el Gal4 DBD també era capaç d'activar l'expressió del reporter de Gal4. En cèl·lules C2C12 en que s'havia reduït l'expressió de DOR per l'acció d'un siRNA específic, la capacitat dels receptors nuclears TRα i PPARγ d'activar l'expressió dels seus reporters es veia disminuïda, cosa que indica que la presència de DOR és important per a l'acció d'aquests receptors nuclears. Tot i contenir una putativa caixa LxxLL vam poder comprovar que aquesta no és el principal domini d'interacció de DOR amb els receptors nuclears, ja que la mutació de la caixa no aboleix la capacitat de DOR de coactivar aquests receptors. La caixa, en canvi, és important per al domini d'activació de la transcripció de DOR, ja que la versió mutada de la proteïna és menys potent a l'hora de coactivar els diferents receptors nuclears. Vam analitzar també la localització intracel·lular de la proteïna. Mitjançant estudis amb proteïnes de fusió de DOR amb la proteïna fluorescent GFP, així com amb estudis d'immunolocalització, vam poder comprovar que DOR es localitza al nucli, cosa que és coherent amb la seva funció com a coactivador. Tot i això en determinades condicions DOR es pot localitzar al citosol. En aquest sentit vam poder determinar a DOR les regions responsables de la seva localització nuclear i de la sortida del nucli de la proteïna que té lloc en determinades condicions. Per últim vam analitzar el paper de possibles modificacions post-traduccionals en l'activitat i la localització de DOR. A través de la mutació de llocs putatius de fosforilació per diferents cinases vam deduir que tant l'activitat com la vida mitja de DOR es veu afectada per fosforilacions per aquestes cinases. A més vam comprovar que DOR també es regula per modificacions en lisines, ja que la mutació de lisines de la proteïna també afecta a la seva localització i a la seva vida mitja. / To initially identify genes responsible for the alterations associated to diabetes, we screened genes differentially expressed in Zucker diabetic (ZDF) rats and non-diabetic lean rats by PCR-select cDNA subtraction. One of the genes differentially expressed had not been described before. We named it DOR for "Diabetes and Obesity Regulated gene". The study of the protein sequence suggested that DOR could be a nuclear protein that may participate in transcriptional regulation. To assess whether DRCoA regulates nuclear hormone receptor activity we performed reporter vector assays with several nuclear receptors. Our results confirmed that DOR is able to coactivate the nuclear receptors TRα, PPARγ, GRα, ERα i VDRα. We also constructed a fusion protein of DOR with the DNA binding domain of the yeast transcription factor Gal4 (Gal4 DBD). This allowed us to demonstrate that DOR has a transcription activation domain, as this fusion protein is able to activate the expression of a reporter vector for Gal4. The fusion of several fragments of the protein with the Gal4 DBD served us to delimitate the region of DOR responsible for the activation of the transcription. We also analyzed the cellular distribution of the protein. As could be expected, DOR localizes to the nucleus of the cells, although in certain conditions is localized in the cytoplasm. We determined the regions of the protein responsible for this nuclear localization, as well as the signals responsible for the exit of the protein to the cytoplasm in certain conditions. Lastly we analyzed the role of post-translational modifications in the activity, stability and localization of the protein.

La resistencia a la insulina es un estado patológico que se define como la incapacidad del organismo de responder normalmente a las acciones de la insulina. Este estado está ligado a la obesidad, al estilo sedentario de vida y es responsable en gran medida de la aparición de la diabetes de tipo 2. Aunque tradicionalmente el estudio de esta patología se había centrado en el metabolismo de carbohidratos, en las últimas décadas se ha producido un cambio hacia el estudio del metabolismo de ácidos grasos como principal promotor de esta enfermedad. De este modo, se ha demostrado una correlación entre la acumulación de lípidos en tejidos periféricos (hígado y músculo principalmente) y la aparición de resistencia a la insulina.El músculo es el responsable de la mayor parte del metabolismo de la glucosa en situaciones de estimulación por insulina. Esto confiere al músculo una vital importancia en el desarrollo de la resistencia a la insulina así como para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Numerosos estudios han descrito que la acumulación de especies derivadas de ácidos grasos en músculo, ya sea debido a un aporte excesivo de lípidos o a un fallo en su oxidación, conducen a una resistencia a la insulina. Estas especies derivadas de ácidos grasos actúan interfiriendo en la señalización de la insulina mediante la activación de una serie de proteínas, conduciendo a una desensibilización del músculo a las acciones de la insulina.En esta tesis se ha estudiado si un aumento en la oxidación de ácidos grasos en músculo es capaz de impedir la acumulación de sus derivados lipídicos y por lo tanto evitar la resistencia a la insulina ocasionada por ellos. Con este objetivo se han usado dos aproximaciones experimentales. En primer lugar, se ha evaluado el efecto de la sobreexpresión de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I), que es la enzima responsable del control del transporte de ácidos grasos a la mitocondria, donde serán oxidados, y en segundo lugar, se ha estudiado el efecto del C75, un activador de la CPT I recientemente descrito. Además, también se ha estudiado el papel de otra proteína recientemente involucrada en el control de la oxidación de ácidos grasos en músculo, la FAT/CD36. Todo esto se ha llevado a cabo usando como modelo de estudio células de músculo esquelético de rata L6E9.Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la sobreexpresión de CPT I ha resultado efectiva en el aumento de la oxidación de ácidos grasos, impidiendo su acumulación y por lo tanto protegiendo a la célula de la resistencia a la insulina. En cambio, se ha demostrado que el C75, a través de su activación a C75-CoA, se comporta como un inhibidor de la CPT I y por lo tanto de la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. Por último, no se ha podido demostrar que FAT/CD36 juegue un papel importante en la oxidación de ácidos grasos en las condiciones de estudio utilizadas. Estos resultados confirman la importancia del metabolismo lipídico en la resistencia a la insulina en músculo y describen la CPT I como una posible diana farmacológica para el tratamiento de la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2. Por otro lado describen una nueva acción del C75 sobre la actividad CPT I y sugieren la necesidad de realizar más estudios para esclarecer el papel de FAT/CD36 en la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. / Skeletal muscle is responsible for 70-80% of whole-body insulin-stimulated glucose uptake and is therefore generally considered the most important site of insulin resistance. Insulin resistance in skeletal muscle plays a major role in the pathogenesis of type 2 diabetes although the mechanism responsible remains unclear. Intramuscular lipid accumulation is evident in a wide set of experimental models, including humans, rodents and muscle cells in culture. These observations have promoted the so-called lipotoxic model of skeletal muscle insulin resistance, which proposes that high plasma fatty-acid levels observed in the obese or insulin-resistant state lead to muscle lipid accumulation, which in turn causes a predisposition towards decreased insulin sensitivity and worsening of the disease.In this thesis we have tested the hypothesis that increases in fatty-acid oxidation should protect from fatty acid induced-insulin resistance by reducing lipid accumulation in the muscle cell. For this purpose we have used two experimental approaches: a) the overexpression of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I), the rate-limiting enzyme in fatty acid import into mitochondria for oxidation, and b) study the effect of C75, a recently described CPT I agonist, in fatty-acid oxidation in muscle cells. Moreover we have studied the role of FAT/CD36, a protein recently described to be involved in beta-oxidation in muscle, in the rat skeletal muscle cultured cell line L6E9.Overexpression of LCPT I in L6E9 myotubes increased CPT I activity and palmitate oxidation, preventing lipid accumulation. As a result insulin sensitivity was completely restored. In contrast, C75 acted as an inhibitor of CPT I activity and palmitate oxidation, instead of an activator, both in muscle cells and in mice muscle in vivo. Finally, FAT/CD36 had not an important role in the control of fatty-acid oxidation in L6E9 myoutbes under our experimental conditions. These data confirm the importance of lipid metabolism in muscle insulin resistance and describe CPT I as a possible pharmacologic target for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes. Moreover, we describe a new role of C75 over CPT I activity and fatty-acid oxidation in skeletal muscle.

Las mutaciones en el factor de transcripción HNF1a son la causa más frecuente de diabetes tipo MODY. HNF1a está implicado en una compleja red transcripcional responsable de la diferenciación y función de la célula beta. El estudio de modelos genéticos deficientes para HNF1a será pues de gran relevancia para la comprensión de las bases moleculares de la diabetes MODY y del programa transcripcional responsable del desarrollo de la célula beta, pero también de manera más general, para estudiar como un activador regula la transcripción. El objetivo de este trabajo de tesis es pues emplear diferentes modelos genéticos para comprender aspectos funcionales de HNF1a en un contexto celular in vivo.En una primera parte, nos planteamos responder dónde, cuándo y cúanto HNF1a es necesario para ejercer su función en la célula beta. Diseñamos un modelo de expresión de HNF1a específico de célula beta e inducible por tetraciclina. El sistema sobreexpresaba HNF1a en células beta, lo que inhibía el ciclo celular e inducía apoptosis reduciendo progresivamente la masa de célula beta que acababa derivando en diabetes. Como la inducción de HNF1a en células beta era heterogénea pudimos comprobar que la función de HNF1a tiene autonomía celular y es rescatable postnatalmente sólo en aquellas células deficientes para HNF1a que reexpresaban HNF1a a niveles casi fisiológicos. Concluyendo, en esta primera parte del proyecto se demostró que HNF1a puede ejercer su función en células beta expresándose sólo en células beta, que esta función no está restringida a un momento determinado del desarrollo embrionario y que es altamente dependiente de los niveles de expresión, puesto que tanto mutaciones en heterocigosidad como la sobreexpresión causan diabetes. Estos resultados tienen importantes implicaciones en el diseño de terapias génicas para la cura de la diabetes MODY y en el desarrollo de protocolos de diferenciación in vitro de células beta para su posterior transplante. Así mismo llama la atención sobre los peligros de sobreexpresar factores de transcripción en células beta.En la segunda parte, nos planteamos cómo regula HNF1a la transcripción. Un nuevo nivel de regulación de la transcripción está emergiendo, el posicionamiento génico en subdominios nucleares en fución de la actividad transcripcional. Por otro lado se sabe que HNF1a induce la acetilación de los promotores de sus genes diana. El objetivo de esta segunda parte es estudiar como HNF1a influye las modificaciones de histona a nivel local de cromatina y el reposicionamiento génico en el espacio nuclear para establecer así la relación entre estos dos niveles de regulación de la transcipción. Mediante el uso de un modelo deficiente para HNF1a, demostramos que HNF1a induce la metilación en H3-Lys4 e impide la metilación en H3-Lys27 de sus genes diana. Así mismo estas modificaciones de histona se distribuyen no aleatoriamente en el espacio nuclear formando subdominios. HNF1a induce el reposicionamiento selectivo de sus loci diana de dominios ricos en H3-trimetil Lys27 a dominios activadores ricos en RNA polimerasa II y H3-dimetil Lys4, en concordancia con los cambios observados localmente. Concluyendo, en esta segunda parte demostramos por primera vez que el posicionamiento génico puede ser dependiente de un activador y que afecta selectivamente al locus diana. También demostramos por primera vez que las modificaciones de histona que regulan la transcripción localmente a nivel de la cromatina también tienen una representación espacial en el núcleo de manera que los genes se posicionan en dominios ricos en determinadas modificaciones de histona en función de su actividad transcripcional. Este trabajo de tesis tiene importantes implicaciones en la comprensión de las bases moleculares de una enfermedad humana y añade nuevas perspectivas al estudio de la función de un activador transcripcional. / Mutations in the transcription factor HNF1a are the major cause of MODY type diabetes. HNF1a is implicated in a complex transcriptional network responsible for beta-cell development and function. The study of genetic models deficient for that activator would not only be useful for understanding the molecular bases of a human disease, but also for the study of the transcriptional network implicated in the differentiation of beta-cells and the study of how transcription is actually regulated.The aim of this project of thesis was to understand the function in vivo of HNF1a in beta-cells using genetic models.In the first part, we aimed to assess when, where and how much HNF1a is needed in the beta-cell to be functional. For that purpose, we used a conditional and cell-specific model that overexpressed HNF1a only in beta-cells and in the absence of tetracycline. We demonstrated that the function of HNF1a in beta-cells is cell-autonomous, can be rescued postnatally and is tightly dependent on its expression levels, since both mutations in heterozygosity and overexpression lead to diabetes. These results have important implications in the development of gene therapies for MODY3 patients and for the establishment of good protocols for beta-cell differentiation in vitro for transplantation. This study also highlights the risk of misexpressing transcriptions factors in beta-cells. In the second part, we aimed to understand how HNF1a regulates transcription using an HNF1a-deficient model. HNF1a induces changes locally at the chromatin level by preventing the methylation of H3-Lys27 and inducing the acetylation and methylation of H3-Lys4 of its targets nucleosomes. HNF1a also induces the repositionning of its target loci from H3-methyl Lys27 rich domains to active RNA polymerase II and H3-methyl Lys4 rich domains in the nuclear space, concordantly with the changes observed locally. Thus, for the first time we show that an activator can locus-selectively determine the subnuclear positioning of its targets and that histone modifications have a functional representation in the nuclear space. This thesis add novel insights to our understanding of the in vivo function of a transcriptional activator, and for the first time link subnuclear gene repositioning to a human transcriptional disease.

El trasplantament d'illots pancreàtics és una teràpia emergent per la curació de la diabetis mellitus. Una de les limitacions radica en la baixa disponibilitat d'òrgans i l'elevada demanda existent, que queda agreujada amb l'elevat nombre d'illots que són necessaris per restablir la normoglucèmia del pacient. Estudis recents del nostre grup, han mostrat que en els primers dies després del trasplantament hi ha un augment de l'expressió d'IL-1beta en els empelts d'illots.La hipòtesi de treball és que la citocina proinflamatòria, IL-1, està implicada en la fallada del trasplantament. Designant la sobreexpressió d'IL-1Ra com l'estratègia a seguir per millorar el pronòstic del trasplantament singènic d'illots pancreàtics. Per tant, l'objectiu general de l'estudi va ser determinar si la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots pancreàtics protegeix les cèl·lules beta pancreàtiques dels efectes deleteris d'IL-1 en els illots i millora el pronòstic del trasplantament.L'estudi dels efectes d'IL-1beta i de la sobreexpressió d'IL-1Ra in vitro es va realitzar amb un cultiu primari d'illots de rata que van ser exposats durant 48h a 5.5 o 22.2 mM de glucosa en presència o absència de 50U/ml d'IL-1beta. I la inserció del gen exogen a les cèl·lules dels illots es va fer utilitzant un adenovirus V recombinant.La proliferació de les cèl·lules beta (determinada per incorporació de BrdU) va disminuir dràsticament quan es van exposar els illots a 50 U/ml d'IL-1beta, tant a 5.5 mM com a 22.2 mM de glucosa. Aquest efecte d'IL-1beta va quedar completament abolit per la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots que havien estat infectats amb l'adenovirus que codificava per l'antagonista, a les dues concentracions de glucosa utilitzades.L'apoptosi de les cèl·lules beta (determinada per immunohistoquímica mitjançant la tècnica del TUNEL i per citometria de flux, marcant les cèl·lules amb anexina V i iodur de propidi) estava significativament augmentada en els illots exposats a IL-1beta, però no en els illots que sobreexpressaven IL-1Ra.L'estudi dels efectes de la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots trasplantats es va realitzar utilitzant un model de trasplantament singènic. Grups de 500 illots control (no infectats) o que sobreexpressaven IL-1Ra van ser trasplantats sota la càpsula renal de rates Lewis diabètiques. 500 illots són una massa beta clarament insuficient per restablir la normoglucèmia, així doncs els animals d'ambdós grups es van mantenir hiperglucèmics durant tot l'estudi. Els empelts es van recuperar després de 3, 10 i 28 dies del trasplantament i es van processar per fer estudis histològics.La sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots trasplantats va fer augmentar significativament la proliferació de les cèl·lules beta dels empelts de 3, 10 i 28 dies i va protegir parcialment les cèl·lules beta de l'increment d'apoptosi detectat després del trasplantament, tant a curt com a llarg termini. L'àrea individual de les cèl·lules beta estava augmentada de manera similar tant en els empelts d'illots control com en els illots que sobreexpressaven IL-1Ra als 10 i 28 dies d'evolució. Finalment, la sobreexpressió d'IL-1Ra resultà en una recuperació de la massa beta inicialment trasplantada.Per tal d'estudiar si els efectes beneficiosos de la sobreexpressió d'IL-1Ra aconseguien reduir el nombre d'illots necessaris per restablir la normoglucèmia, es va trasplantar una massa beta marginal (800 illots) d'illots control i Ad-IL-1Ra a animals diabètics. El 100% dels animals trasplantats amb illots Ad-IL-1Ra eren normoglucèmics després de 14 dies del trasplantament i només un 40% dels animals trasplantats amb illots control assoliren l'euglucèmia en aquest dia.En aquest treball es mostra que la citocina proinflamatòria IL-1beta indueix clarament apoptosi a les cèl·lules beta dels illots de rata en cultiu i inhibeix dràsticament la replicació d'aquestes cèl·lules. La sobreexpressió d'IL-1Ra protegeix les cèl·lules beta dels efectes deleteris d'aquesta citocina i amplifica la resposta replicativa de les cèl·lules beta exposades a concentracions altes de glucosa. La sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots augmenta la replicació de les cèl·lules beta trasplantades, les protegeix de l'apoptosi induïda després del trasplantament, i preserva la massa beta inicialment trasplantada. Els efectes beneficiosos de la sobreexpressió d'IL-1Ra observats en els illots trasplantats permeten reduir el nombre d'illots necessaris per restablir la normoglucèmia dels animals diabètics.Aquests resultats suggereixen que la IL-1 juga un paper important en l'evolució dels empelts d'illots, ja que el seu bloqueig implica una millora dels illots trasplantats. / BACKGROUND AND AIMS: IL-1beta could contribute to the dramatic beta cell loss that takes place after islet transplantation. It is known that exposure to sustained hyperglycemia has a deleterious effect on transplanted islets. Moreover, it has been recently reported that IL-1beta expression is increased in islets exposed to high glucose levels. IL-1Ra is a naturally occurring inhibitor of IL-1 action and its overexpression protects pancreatic islets from the deleterious effects of IL-1â on beta cell replication, apoptosis and function. The aim of this study was to determine whether viral gene transfer of the IL-1Ra gene into rat islets ex vivo could have a beneficial effect on beta cell replication and mass of transplanted islets.METHODS:Lewis rat islets were infected for 2h with 6.25 × 106 pfu of Ad-IL-1Ra and streptozotocin-diabetic Lewis rats were transplanted with 500 Ad-IL-1Ra infected islets (Ad-IL-1Ra group) or 500 uninfected islets (control group) under the kidney capsule. Grafts were removed 3 (n = 12), 10 (n = 12) and 28 (n = 12) days after transplantation and beta cell replication, apoptosis and mass were determined.RESULTS:500 islets is an insufficient mass to restore normoglycemia and therefore, all animals but one (IL-1Ra group) remained hyperglycemic until the end of the study. Beta cell replication (determined by BrdU incorporation) was significantly increased in Ad-IL-1Ra group on days 3 (0.78 ± 0.23%), 10 (1.15 ± 0.16%) and 28 (1.22 ± 0.2%) after islet transplantation compared to beta cell replication in normal pancreas (0.24 ± 0.04%; p< 0.05). In contrast, in control group, beta cell replication was not increased on day 3 after transplantation (0.41 ± 0.11%), and although it increased on day 10 (0.89 ± 0.18%; p< 0.01) it was reduced again on day 28 (0.59 ± 0.10%) in agreement with previous reports of limited beta cell replication with persistent hyperglycemia. Beta cell apoptosis (determined by TUNEL method) was significantly increased in transplanted islets from both groups compared to pancreas. Although Ad-IL-1Ra group showed lower beta cell apoptotic levels than control group, differences did not reach statistical significance. The initially transplanted â-cell mass (1.34 ± 0.03 mg) was similarly reduced in both control (0.32 ± 0.06 mg) and Ad-IL-1Ra groups (0.45 ± 0.10 mg) (p<0.001) on day 3 after transplantation. In Ad-IL-1Ra islet grafts, beta cell mass increased after 10 (1.04 ± 0.091 mg; p< 0.010) and 28 (0.8 ± 0.24 mg) days of transplantation. In contrast, beta cell mass of control group was also increased on day 10 after transplantation (0.69 ± 0.12 mg), but it dropped again on day 28 (0.41 ± 0.05 mg) paralleling with the evolution of beta cell replication in this group. CONCLUSIONS:Islets overexpressing IL-1Ra showed an increased beta cell replication and a preserved beta cell mass after transplantation, that was maintained even after longterm exposure to hyperglycemia.

OBJETIVOS: La diabetes gestacional (DG) es una entidad que se ha relacionado con un mayor riesgo de complicaciones gestacionales. Los objetivos de este estudio fueron: 1) determinar el impacto de la hiperglucemia leve, 2) evaluar las asociaciones entre las complicaciones gestacionales y el grado de tolerancia a la glucosa, obesidad maternal pregestacional, 3) conocer cuál es el rol del sexo fetal en el desarrollo del propio feto en relación a la presencia de DG y obesidad materna pregestacional, y 4)conocer la prevalencia de la DG según los diferentes criterios diagnósticos (criterios de la National Diabetes Data Group y de la Asociación Americana de Diabetes). MÉTODOS: Estudio poblacional prospectivo multicéntrico, que incluyó 9.270 mujeres gestantes con feto único y sin diabetes pregestacional conocida que dio lugar a 4.793 recién nacidos de sexo masculino y 4.477 de sexo femenino. Las mujeres fueron categorizadas según el grado de tolerancia a la glucosa y según IMC pregestacional. Se evaluó el riesgo de macrosomía, tasa de cesáreas y de otras 7 complicaciones gestacionales, mediante modelos de regresión logística múltiple y se calculó el riesgo atribuible en la población. RESULTADOS-CONCLUSIONES: 1) Las mujeres con hiperglucemia leve presentaron una asociación con la presencia de complicaciones similar al grupo control, por lo que no se aconseja un cambio en los criterios diagnósticos. 2) En términos de riesgo absoluto y en términos de freceuncia del riesgo atribuible en la población la contribución de la hiperglucemia leve en las complicaciones gestacionales fue inferior a la presentada por la obesidad materna. 3) Se demostró un dimorfismo sexual en la frecuencia de las complicaciones gestacionales. La presencia de DG sólo se relacionó con morbilidad fetal exclusivamente en el sexo masculino. 4) La prevalencia de DG fue del 8,8% con los criterios NDDG y del 11,6% con los criterios de Carpenter y Coustan (incremento relativo del 31.8%). / OBJECTIVE: Gestational diabetes mellitus (GDM) increases the risk of adverse complications for both mother and child during pregnancy. The objectives of this study were: 1) To evaluate the potential impact of mild hyperglycemia on GDM outcomes; 2) To evaluate the associations among adverse gestational outcomes and glucose tolerance status and maternal obesity; 3) To elucidate whether the adverse gestational outcomes is influenced by maternal obesity and abnormal glucose tolerance differently in male and female fetuses. 4) To know GDM prevalence according to the different diagnostic criteria (National Diabetes Data Group and American Diabetes Association criteria). Methods: A population study in 16 general hospitals from the Spanish National Health Service -that included 9,270 consecutive women with singleton pregnancies and without a former diagnosis of diabetes mellitus delivering 4,793 male and 4,477 female newborns- was conducted. Women were categorized according to glucose tolerance status and pregestational body mass index (BMI). Fetal macrosomia, caesarean section and seven secondary outcomes were evaluated. Logistic regression analyses were performed to predict the effect of maternal BMI category and glucose tolerance on gestational outcomes. The population-attributable fractions (PAf) of predictor variables were also calculated. RESULTS/CONCLUSIONS: 1) The contribution of mild hyperglycemia to adverse GDM outcomes was not significantly different to that of control group. Therefore a change in diagnostic criteria was not warranted in our setting. 2) Pregestational maternal BMI (both the absolute risk and PAf) exhibited a much stronger influence on macrosomia, Caesarean section, pregnancy-induced hypertension and large-for-gestational-age newborns than glucose tolerance status. 3) There was a sexual dimorphism in the risk of abnormal birth weight attributed to maternal glucose tolerance status. A closer surveillance of fetal growth might be warranted in pregnant women with abnormal glucose tolerance carrying a male fetus. 4) Of 9,270 pregnant women screened for GDM, 819 (8.8%) met National Diabetes Data Group criteria. If the threshold for defining GDM had been lowered to ADA criteria, an additional 2.8% of women would have been defined as having the condition (relative increase of 31.8%).

Orientador: Felix Guillermo Reyes Reyes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:50:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maluly_HellenDeaBarros_D.pdf: 1502288 bytes, checksum: 2755d6e579f948905440f6ae2d7bbd17 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Tem sido relatado que a administração de glutamato monossódico (MSG) por via parenteral e oral possui um efeito lesivo sobre o núcleo arqueado do hipotálamo provocando alterações na regulação do apetite e, como conseqüência, obesidade e distúrbios relacionados à síndrome metabólica, que são caracterizados por alterações no metabolismo de carboidratos (resistência à glicose e insulina), dislipidemia e doença cardiovascular. Este estudo teve como objetivo avaliar possíveis alterações metabólicas e cardiovasculares quando da exposição oral ao MSG em níveis de até 5,0% na dieta. O estudo foi realizado com ratos diabéticos e não diabéticos. A utilização de animais diabéticos se justifica por serem susceptíveis a indução de possíveis distúrbios metabólicos. Foi avaliado o perfil metabólico característico da condição diabética, incluindo eletrocardiograma, testes bioquímicos, determinação de aminoácidos livres no soro dos animais e a possível alteração histológica de órgãos que são afetados pela condição diabética (fígado, rins e coração). Concluiu-se que o uso de MSG na concentração de até 5,0% na dieta, não alterou os parâmetros estudados, tanto nos animais não diabéticos, como nos diabéticos. As alterações observadas em animais diabéticos refletiram aos distúrbios característicos desta enfermidade, independente da adição de MSG na dieta / Abstract: It has been reported that the parenteral or oral administration of monosodium glutamate (MSG) has an deletereous effect on the arcuate nucleus of the hypothalamus, inducing alterations in the control of appetite that can lead to obesity and disorders related to the metabolic syndrome, such as alterations in carbohydrate metabolism (glucose and insulin resistance), dyslipidemia and cardiovascular disease. This study aimed to evaluate possible metabolic and cardiovascular alterations as a consequence to oral exposure to MSG at levels up to 5.0% in the diet. The study was carried out using diabetic and non-diabetic rats, the use of diabetic animals being justified by their susceptibility to the induction of possible metabolic disorders. The metabolic profile characteristic of the diabetic condition was evaluated, including electrocardiogram, biochemical tests, determination of amino acids in the serum and the possible histological alteration in the organs that are affected by this condition (liver, kidneys and heart). In conclusion, the use of MSG at levels up to 5.0% in the diet did not change the parameters studied in both: non diabetic and diabetic animals. The alterations observed in the diabetic animals reflected the metabolic changes characteristic of this disease, regardless the addition of MSG to the diet / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

INTRODUCCIÓ: L'estandardització de mesures d’hemoglobina glicada A(1c) (HbA(1c)) ha estat una de les principals preocupacions en el camp de la bioquímica clínica des de la publicació dels estudis DCCT i UKPDS. Des del desenvolupament del mètode de referència per a mesurar específicament hemoglobina glicada A(1c) en sang humana, s’han publicat equacions per a la transformació de resultats traçables al sistema de referència de la IFCC a resultats traçables als sistemes d’estandardització japonès (JDS/JSCC) i nord-americà (NGSP). Existeixen alguns inconvenients en l’ús d’equacions com el baix nombre de mostres utilitzat en el seu desenvolupament. L’objectiu principal d’aquest estudi fou elucidar dues equacions per a la transformació de resultats traçables al sistema de referència IFCC a resultats traçables als esquemes japonès i nord-americà. Estudiar les implicacions clíniques dels resultats obtinguts, la relació entre, por una banda, de la concentració basal de glucosa en sang amb la concentració de glucosa mitjana estimada a partir del resultat de HbA(1c) i, per altra, de la relació entre la mitjana de les concentracions basals de glucosa i el valor de HbA(1c) i, per últim, l’estudi de la capacitat diagnòstica de la concentració basal de glucosa respecte la HbA(1c). MATERIAL I MÈTODES: Es mesurà el percentatge d’hemoglobina glicada A(1c) en 3000 mostres de sang total per al desenvolupament de cadascuna de les equacions (2000 per a l’elucidació de cada equació i 1000 per a estudiar les diferències entre diferents valors d’hemoglobina A(1c) obtinguts) en dos analitzadors, un calibrat traçable al sistema de referència de la JDS/JSCC o al sistema de referència de la NGSP i un altre calibrat de forma traçable al mètode de referència de la IFCC. S’obtingueren les dues equacions mitjançant mètodes de regressió lineal simple. RESULTATS: Les equacions obtingudes foren: JDS/JSCC(%) = 1,0545*IFCC(%) + 1,129(%) (R^2 = 0,9972) i NGSP(%) = 0,9293*IFCC(%) + 2,1054(%) (R^2 = 0,9979). S’observaren diferències estadísticament significatives entre els resultats obtinguts mitjançant l'utilizació tan de les equacions anteriorment publicades como de les desenvolupades en el present treball i els resultats obtinguts directament de l’analizador. En quant a l’estudi de les seves implicacions clíniques, no s’observà relació lineal entre la concentració basal de glucosa en sang i el valor de la concentració mitjana de glucosa en sang estimada a partir dels valors de HbA(1c), així com tampoc s’observà cap tipus de relació lineal entre el valor de la concentració basal mitjana de glucosa en sang i el valor d’HbA(1c). No s’observaren millors resultats en els paràmetres diagnòstics en l’ús de la concentració basal de glucosa respecte de la mesura d’HbA(1c). CONCLUSIONS: Es possible realitzar la transformació de resultats d’HbA(1c) traçables al sistema de referència de la IFCC a valors traçables als esquemes d’estandardització japonès i nord-americà mitjançant les equacions desenvolupades en el present estudi. L’elevat nombre de mostres utilitzat en el desenvolupament de les equacions proporciona una notable robustesa a les mateixes, garantint-se la qualitat dels resultats obtinguts mitjançant la seva utilització. No s’observà cap tipus de relació lineal entre la concentració de glucosa basal en sang i la glucosa mitjana estimada a partir de l’HbA(1c), ni entre la mitjana de les concentracions basals de glucosa i el valor d’hemoglobina glicada, pel que no es poden obtenir equacions lineals per a l’estimació d’aquestes variables. La HbA(1c) segueix essent la millor prova de laboratori per a el diagnòstic de diabetis mellitus i l’avaluació del control metabòlic dels pacients diabètics. / INTRODUCTION: HbA(1c) measurements are the cornerstone in diabetic patient’s control. Master equations have been published to transform values from the reference method to values traceable to national standardization systems. There are diverse inconveniences in these equations like low sample number use and heterogeneity of methods used to develop equations. The aim of this study was to obtain two equations for reference method values transformation to values traceable to the JDS/JSCC and the NGSP standardization schemes and to compare it with the already published equations. A secondary objective was to study the clinical implications of the obtained results and the relationship between fasting plasma glucose and average estimated glucose concentrations derived from HbA(1c) values and, on the other hand, the relationship between mean values of fasting plasma glucose and HbA(1c) values. MATERIAL AND METHODS: HbA(1c) was measured in 3000 blood samples in two analyzers calibrated traceably to the JDS/JSCC and the NGSP schemes and to the reference method. Two equations for value transformation were developed by simple linear regression methods with use of 2000 paired values and compared with the already published equation using 1000 HbA(1c) values. RESULTS: The equations obtained were JDS/JSCC(%) = 1,0545*IFCC(%) + 1,129(%) (R^2 = 0,9972) i NGSP(%) = 0,9293*IFCC(%) + 2,1054(%) (R^2 = 0,9979). Statistically significant differences were found between the results obtained using these equations, the results obtained with the published equations and those obtained directly from the analyzer. No linear relationship were found neither between fasting plasma glucose and average estimated glucose concentrations derived from glycohemoglobin values nor between mean values of fasting plasma glucose and glycohemoglobin values. Fasting plasma glucose does not provide better diagnostic parameters than HbA(1c) CONCLUSIONS: These new developed master equations are useful tools to transform reference method values to the JDS/JSCC and NGSP schemes values. The elevated nunber of values used in its development provides high robustness to the equations. HbA(1c) remains as the best laboratory test for the evaluation of diabetic patients.

La coexistència de múltiples factors de risc cardiovascular com la síndrome metabòlica, l'obesitat abdominal, la dislipèmia i la resistència a la insulina, determinen l'aparició de la disfunció endotelial, primer event en la patogènia de l'aterosclerosi. La tonometria arterial perifèrica (PAT) és una tècnica novedosa i no invasiva la qual permet la valoració de la funció endotelial a nivell clínic. Per altra banda, evidències científiques recents suggereixen que FABP4, adipoquina secretada pel teixit adipós, circulant podria tenir un efecte directe en teixits perifèrics. Per tant, els nivells elevats de FABP4 podrien estar implicats en el dany arterial i la disfunció endotelial. Per dur a terme la valoració clínica es van reclutar pacients amb risc cardiovascular (CV) moderat i se'ls hi va realitzar el test de la funció endotelial per PAT i l'extracció sanguínia per l'anàlisi dels biomarcadors circulants endotelials, d'inflamació i oxidació lipídica i FABP4. A nivell in vitro, es va treballar en cèl·lules endotelials HUVECs i limfòcits (Jurkat T cells), i es va estudiar la via de senyalització de la PI3K/Akt/eNOS, l'expressió de molècules implicades en la disfunció endotelial i l'assaig d'adhesió dels leucòcits a l'endoteli. Els resultats més significatius a nivell clínic van ser que la sE-selectina (molècula d'adhesió endotelial) i les LDL oxidades s'associen inversament amb la mesura de RHI-PAT en els pacients amb risc CV moderat, és a dir amb una pitjor funció endotelial. La FABP4 plasmàtica es relaciona inversament amb el RHI-PAT en pacients amb diabetis tipus 2, per tant a més FABP4 més disfunció endotelial. A nivell in vitro, FABP4 podria ser capaç de modular les vies de senyalització de la insulina, disminuint les cascades de fosforilacions (Akt i eNOS) augmentant l'expressió de les molècules d'adhesió (VCAM1 i E-selectina) i augmentant l'adhesió de leucòcits a l'endoteli, induint la disfunción endotelial i la resistència a la insulina en les cèl·lules endotelials. Segons els resultats obtinguts, podem concloure que la sE-selectina i les LDL oxidades es relacionen amb el RHI-PAT en pacients amb risc CV recolzant el paper del RHI-PAT en la valoració clínica de la funció endotelial i els nivells circulants de FABP4 estan associats amb la disfunció endotelial en pacients diabètics. FABP4 podria induir la disfunció endotelial a nivell molecular, interferint en les cascades de senyalització depenents d'insulina en l'endoteli vascular. / The coexistence of multiple cardiovascular risk factors such as metabolic syndrome, abdominal obesity, dyslipidemia and insulin resistance, determine the onset of endothelial dysfunction, the first event in the pathogenesis of atherosclerosis. The peripheral arterial tonometry (PAT) is a novel and noninvasive technique which allows the assessment of endothelial function at the clinical level. Moreover, recent scientific evidence suggests that FABP4 circulating, adipokyne secreted by adipose tissue, could have a direct effect on peripheral tissues. Therefore, high levels of FABP4 might be involved in arterial damage and endothelial dysfunction. To perform the clinical assessment were recruited patients with moderate cardiovascular risk (CV). The endotehlial function was assessed by PAT. Antropometry, circulating endothelial, lipid oxidation and inflammation biomarkers and FABP4 were measured. In vitro, was working in endothelial cells HUVECs and leukocyte (Jurkat T cells), and were quantified protein expression and mRNA. The results were clinically significant in that the sE-selectin (endothelial adhesion molecule) and oxidized LDL are associated inversely with RHI-PAT in patients with moderate CV risk. The plasma FABP4 was inversely associated with RHI-PAT in patients with type 2 diabetes. In vitro, FABP4 might modulate insulin signaling, decreasing the phosphorylations pathways (Akt and eNOS) and increasing the expression of adhesion molecules (VCAM1 and E-selectin), inducing endothelial dysfunction and insulin resistance in endothelial cells. We conclude that sE-selectin and oxidized LDL are associated with RHI-PAT in patients with CV risk by supporting the role of PAT in the clinical assessment of endothelial function and circulating FABP4 levels are associated with dysfunction endothelial cells in diabetic patients. FABP4 might induce endothelial dysfunction at the molecular level, interfering in insulin-dependent signaling pathways in vascular endothelium.

Le traitement des maladies chroniques passe par plusieurs axes. L’un est technique et indispensable, issu de « l’évidence base médecine », il est biomédical et largement enseigné dans les facultés de médecine. L’autre est plus récent, moins présent dans les enseignements, et issu du « share decision making ». Ce dernier semble mieux considérer les valeurs du patient mais reste assujettie aux preuves biomédicales et investigations cliniques. L’abord du patient nécessite une interdépendance de ces deux approches et donc une part liée à l’éducation. La relation au patient se trouve modifiée par cette approche thérapeutique et impose au soignant un positionnement professionnel différent et requérant de nouvelles compétences. Il est intéressant de questionner au travers d’une étude menée dans deux milieux socio-culturels différents la possibilité d’un abord didactique des ateliers d’ETP. Cette approche, est menée dans un premier temps, par l’étude comparée des conceptions des patients et des soignants au cours de laquelle nous avons relevé des différences de conceptions non pas liées au macrocontexte mais plutôt au microcontexte et entre les soignants et les patients. Dans un deuxième temps, l’utilisation de concepts didactiques issus de la didactique des sciences, des travaux de Gérard Sensévy et de la littératie en santé va nous permettre de dégager des indicateurs et paramètres pouvant classer les différents types d’ateliers d’ETP et guider les soignants-formateurs au cours de leurs interventions éducatives. / Chronic illnesses can be treated along several axes.One of these is technical and indispensable, coming for the "evidence base medecine". It is biomedical and largely taught in medical schools. The other is more recent, less commonly taught and coming from "share decision making." The latter better considers the values of the patient but remains dependent on biomedical proof and chemical investigation. The patient approach requires an interdependence of the two approaches and is therefore, in part linked to education .The relation to the patient is modified by this therapeutic approach and requires and the caretaker to have a different professional position and requires new skills. It is interesting to question through a study lead in two different socio-cultural backgrounds the possibility of a didactic approach of the ETP workshops.Firstly, this approach, by the comparative study of conceptions of patients and caretakers during which we noticed different conceptions not only linked to the macro context but rather to the micro context between the two former.Secondly, the use of didactic concepts coming from the teaching of science from the works of Gérard Sensévy and the health literacy that allows us to identify the indicators and parameters.Allowing us to classify different types of ETP workshops and guide the care professionnal along their educational interventions.

In the last decade, molecular biology has expanded from a reductionist view to a systems-wide view that tries to unravel the complex interactions of cellular components. Owing to the emergence of high-throughput technology it is now possible to interrogate entire genomes at an unprecedented resolution. The dimension and unstructured nature of these data made it evident that new methodologies and tools are needed to turn data into biological knowledge. To contribute to this challenge we exploited the wealth of publicly available high-throughput genomics data and developed bioinformatics methodologies focused on extracting information at the pathway rather than the single gene level. First, we developed Gene Set Variation Analysis (GSVA), a method that facilitates the organization and condensation of gene expression profiles into gene sets. GSVA enables pathway-centric downstream analyses of microarray and RNA-seq gene expression data. The method estimates sample-wise pathway variation over a population and allows for the integration of heterogeneous biological data sources with pathway-level expression measurements. To illustrate the features of GSVA, we applied it to several use-cases employing different data types and addressing biological questions. GSVA is made available as an R package within the Bioconductor project. Secondly, we developed a pathway-centric genome-based strategy to reposition drugs in type 2 diabetes (T2D). This strategy consists of two steps, first a regulatory network is constructed that is used to identify disease driving modules and then these modules are searched for compounds that might target them. Our strategy is motivated by the observation that disease genes tend to group together in the same neighborhood forming disease modules and that multiple genes might have to be targeted simultaneously to attain an effect on the pathophenotype. To find potential compounds, we used compound exposed genomics data deposited in public databases. We collected about 20,000 samples that have been exposed to about 1,800 compounds. Gene expression can be seen as an intermediate phenotype reflecting underlying dysregulatory pathways in a disease. Hence, genes contained in the disease modules that elicit similar transcriptional responses upon compound exposure are assumed to have a potential therapeutic effect. We applied the strategy to gene expression data of human islets from diabetic and healthy individuals and identified four potential compounds, methimazole, pantoprazole, bitter orange extract and torcetrapib that might have a positive effect on insulin secretion. This is the first time a regulatory network of human islets has been used to reposition compounds for T2D. In conclusion, this thesis contributes with two pathway-centric approaches to important bioinformatic problems, such as the assessment of biological function and in silico drug repositioning. These contributions demonstrate the central role of pathway-based analyses in interpreting high-throughput genomics data. / En l'última dècada, la biologia molecular ha evolucionat des d'una perspectiva reduccionista cap a una perspectiva a nivell de sistemes que intenta desxifrar les complexes interaccions entre els components cel•lulars. Amb l'aparició de les tecnologies d'alt rendiment actualment és possible interrogar genomes sencers amb una resolució sense precedents. La dimensió i la naturalesa desestructurada d'aquestes dades ha posat de manifest la necessitat de desenvolupar noves eines i metodologies per a convertir aquestes dades en coneixement biològic. Per contribuir a aquest repte hem explotat l'abundància de dades genòmiques procedents d'instruments d'alt rendiment i disponibles públicament, i hem desenvolupat mètodes bioinformàtics focalitzats en l'extracció d'informació a nivell de via molecular en comptes de fer-ho al nivell individual de cada gen. En primer lloc, hem desenvolupat GSVA (Gene Set Variation Analysis), un mètode que facilita l'organització i la condensació de perfils d'expressió dels gens en conjunts. GSVA possibilita anàlisis posteriors en termes de vies moleculars amb dades d'expressió gènica provinents de microarrays i RNA-seq. Aquest mètode estima la variació de les vies moleculars a través d'una població de mostres i permet la integració de fonts heterogènies de dades biològiques amb mesures d'expressió a nivell de via molecular. Per il•lustrar les característiques de GSVA, l'hem aplicat a diversos casos usant diferents tipus de dades i adreçant qüestions biològiques. GSVA està disponible com a paquet de programari lliure per R dins el projecte Bioconductor. En segon lloc, hem desenvolupat una estratègia centrada en vies moleculars basada en el genoma per reposicionar fàrmacs per la diabetis tipus 2 (T2D). Aquesta estratègia consisteix en dues fases: primer es construeix una xarxa reguladora que s'utilitza per identificar mòduls de regulació gènica que condueixen a la malaltia; després, a partir d'aquests mòduls es busquen compostos que els podrien afectar. La nostra estratègia ve motivada per l'observació que els gens que provoquen una malaltia tendeixen a agrupar-se, formant mòduls patogènics, i pel fet que podria caldre una actuació simultània sobre múltiples gens per assolir un efecte en el fenotipus de la malaltia. Per trobar compostos potencials, hem usat dades genòmiques exposades a compostos dipositades en bases de dades públiques. Hem recollit unes 20.000 mostres que han estat exposades a uns 1.800 compostos. L'expressió gènica es pot interpretar com un fenotip intermedi que reflecteix les vies moleculars desregulades subjacents a una malaltia. Per tant, considerem que els gens d'un mòdul patològic que responen, a nivell transcripcional, d'una manera similar a l'exposició del medicament tenen potencialment un efecte terapèutic. Hem aplicat aquesta estratègia a dades d'expressió gènica en illots pancreàtics humans corresponents a individus sans i diabètics, i hem identificat quatre compostos potencials (methimazole, pantoprazole, extracte de taronja amarga i torcetrapib) que podrien tenir un efecte positiu sobre la secreció de la insulina. Aquest és el primer cop que una xarxa reguladora d'illots pancreàtics humans s'ha utilitzat per reposicionar compostos per a T2D. En conclusió, aquesta tesi aporta dos enfocaments diferents en termes de vies moleculars a problemes bioinformàtics importants, com ho son el contrast de la funció biològica i el reposicionament de fàrmacs "in silico". Aquestes contribucions demostren el paper central de les anàlisis basades en vies moleculars a l'hora d'interpretar dades genòmiques procedents d'instruments d'alt rendiment.