La tesi presenta l'anàlisi molecular del gen CFTR a la població espanyola. L'estudi inclou afectats i famílies de fibrosi quística (FQ) així com pacients de les malalties relacionades (agenèsia bilateral de conductes deferents, pancreatitis crònica i bronquiectàsies). La FQ és una malaltia genètica recessiva caracteritzada per malaltia pulmonar crònica, insuficiència pancreàtica i infertilitat en l'home. Per l'anàlisi del gen (250kb) s'han utilitzat dues tècniques de cribatge: l'electroforesi en gels de gradient desnaturalitzant (DGGE) i l'anàlisi de la conformació de la cadena senzilla (SSPC/HD) amb la posterior seqüenciació dels patrons anòmals per tal d'identificar les mutacions. A més s'ha evaluat l'eficiència de l'equip comercial que permet l'anàlisi directa de 31 mutacions freqüents del gen. L'estudi evidencia l'heterogeneïtat molecular de la població espanyola amb únicament dotze mutacions que presenten una freqüència superior a l'1%. La mutació majoritària al món, F508del, representa el 51% d'al·lels. La mutació G542X és la segona més freqüent amb un 8% d'al·lels. L'equip comercial permet identificar el 76% dels al·lels, el que suposa la total caracterització del genotip en el 59% dels pacients FQ. Amb l'estratègia emprada s'han caracteritzat 108 mutacions que representen el 97% dels al·lels FQ. A l'ABCD el 85% dels pacients presenten al menys una mutació i/o variant, sent la variant 5T la més prevalent (39%) en aquest grup. Pel que fa als fenotips PC i BQ, un 35% dels pacients presenten al menys una mutació i/o variant CFTR. En general, aquests fenotips (ABCD, PC, BQ) presenten heterogeneïtat molecular encara que amb un espectre de mutacions diferent, predominant les mutacions amb error de sentit. Aquestes mutacions que determinen un canvi d'aminoàcid poden afectar de forma molt diversa la funció i estabilitat de la proteïna. Tanmateix, l'alta freqüència d'individus heterocigots suggereix que aquests tenen una major predisposició a desenvolupar les diferents malalties, probablement, en un context multifactorial.

La Fibrosi Quística (FQ; MIM# 219700) és una de les malalties letals més comuns en les poblacions d'origen caucàsic, amb herència autosòmica recessiva. El seu fenotip clínic es caracteritza per l'acumulació de moc viscós en òrgans exocrins, amb conseqüències patològiques en el tracte respiratori, gastrointestinal i urogenital. Mutacions al gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ABCC7; MIM# 602421) són responsables de la malaltia. Fins al moment, ja s'han descrit més de 1600 mutacions en el gen CFTR. La gran majoria són mutacions puntuals de les quals: 42% són mutacions de sentit erroni (missense).El gen CFTR codifica per una proteïna de membrana de 1480 aminoàcids, que pertany a la gran família dels transportadors ABC. La proteïna CFTR presenta una estructura simètrica, formada per dos motius repetits, cadascun d'ells format per una regió transmembrana (TMD), composada per sis α-hèlix, i una regió citosòlica hidrofílica d'unió a ATP (NBD). Aquests dos motius queden units mitjançant un domini regulador (R), citosòlic i hidrofílic, que és fosforila per PKA i PKC. El paper principal que desenvolupa el canal CFTR en la part apical de les cèl·lules epitelials és el transport de fluid transepitelial i electròlits a través de la membrana, activitat que ve regulada directament per la fosforilació de PKA. Aquest canal permet el trànsit d'ions de clorur a través d'ell en qualsevol direcció, i es caracteritza per tenir una baixa conductància unitària (la seva conductància és de 7-10 pS).Existeixen moltes evidències en la literatura on les mutacions de sentit erroni, independentment de la seva localització en el gen CFTR, poden afectar a la funció del canal CFTR a diferents nivells: biogènesi de la proteïna, transport i localització, propietats electrofisiològiques del canal.Així que l'objectiu general de la tesi va ser l'anàlisi molecular i funcional de vuit mutacions amb sentit erroni (p.P5L, p.S50P, p.E60K, p.R75Q, p.G85E, p.G85V, p.Y89C, p.E92K) localitzades en la regió N-terminal de CFTR, i identificades majoritàriament a la població espanyola.Per portar a terme els objectius de la tesi, es van generar les vuit mutacions per mutagènesi dirigida en el vector pCMVCFTRNot6.2wt, i es van expressar en cèl·lules epitelials HEK293. Es va analitzar el processament i patró de maduració de les proteïnes mutants per Western blot i la seva localització cel·lular per immunocitoquímica. I posteriorment, es van caracteritzar funcionalment els canals mutants mitjançant la tècnica de Patch clamp en configuració whole cell i excised inside-out.Vam observar que cinc de les mutacions analitzades, p.S50P, p.E60K, p.G85E, p.G85V i p.E92K, provoquen un processament i una maduració incorrecte de la proteïna. Totes cinc presenten un comportament molt similar a la mutació p.F508del, podent-se classificar aquestes mutacions dins la classe II.La mutació p.P5L afecta a la funció de CFTR a dos nivells: a nivell de la biogènesi i a nivell de l'activitat del canal. Aquesta mutació provoca una disminució de la densitat de canals a la membrana citoplasmàtica. La conductància i la cinètica del canal també s'alteren. La proteïna mutant p.Y89C afecta a l'activitat del canal. Aquesta mutació altera específicament la cinètica del canal. El canal CFTR corresponent a la mutació p.R75Q presenta un patró de maduració i un comportament funcional del canal anàleg a la proteïna CFTR no mutada. Els nostres estudis corroboren la classificació de p.R75Q com a mutació sense expressió clínica.El comportament sever de la majoria de les mutacions avaluades, afectant la biogènesi i/o l'activitat del canal, ressalta la importància funcional de la cua N-terminal i del segment TM1 en la fisiologia de CFTR. / Over 1,600 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene sequence variations have been identified in patients with cystic fibrosis (CF) and related disorders involving an impaired function of the CFTR chloride channel. However, detailed structure-function analyses have only been established for a few of them.This study aimed evaluating the impact of eight N-terminus CFTR natural missense changes on channel behavior. By site-directed mutagenesis, we generated four CFTR variants in the N-terminal cytoplasmic tail (p.P5L, p.S50P, p.E60K, and p.R75Q) and four in the first transmembrane segment of membrane-spanning domain 1 (p.G85E/V, p.Y89C, and p.E92K). Immunoblot analysis revealed that p.S50P, p.E60K, p.G85E/V, and p.E92K produced only core-glycosylated proteins. Immunofluorescence and whole cell patch-clamp confirmed intracellular retention, thus reflecting a defect of CFTR folding and/or trafficking. In contrast, both p.R75Q and p.Y89C had a glycosylation pattern and a subcellular distribution comparable to the wild-type CFTR, while the percentage of mature p.P5L was considerably reduced, suggesting a major biogenesis flaw on this channel. Nevertheless, whole-cell chloride currents were recorded for all three variants. Single-channel patch-clamp analyses revealed that the channel activity of p.R75Q appeared similar to that of the wild-type CFTR, while both p.P5L and p.Y89C channels displayed abnormal gating. Overall, our results predict a major impact of theCFTR missense variants analyzed, except p.R75Q, on the CF phenotype and highlight the importance of the CFTR N-terminus on channel physiology.

El ratón doméstico, Mus domesticus, es un roedor comensal cuyo cariotipo estándar está formado por 40 cromosomas acrocéntricos. En su área natural de distribución, es frecuente la reducción de este número cromosómico debido a la presencia de un tipo de mutación denominada translocación Robertsoniana, que consiste en la fusión céntrica de dos cromosomas acrocéntricos para dar lugar a un cromosoma metacéntrico. En Europa y norte de África se han descrito más de 40 razas cromosómicas, definiendo como raza a un grupo de poblaciones contiguas que comparten el mismo juego de cromosomas Robertsonianos en homocigosis. Es frecuente que entre razas cromosómicas, o entre éstas y las poblaciones estándar se generen zonas híbridas compuestas por individuos con un número cromosómico intermedio entre el de las dos poblaciones que las han formado, y con una elevada frecuencia de heterocigotos para las fusiones que presentan. Muestreos realizados en las cercanías de la ciudad de Barcelona, entre 1981 y 1997, evidenciaron la existencia de poblaciones formadas por ejemplares con un 2n comprendido entre 29 y 39 cromosomas, debido a la presencia de las fusiones Rb(3.8), Rb(4.14), Rb(5.15), Rb(6.10), Rb(9.11) y Rb(12.13), pero no se demostró la existencia de ninguna raza cromosómica. Aún así se sugirió que se trataba de una zona híbrida entre las poblaciones estándar y una raza hipotética con 2n=28.Las zonas de polimorfismo Robertsoniano son lugares potenciales de especiación, ya sea por un proceso de reforzamiento, o bien por una disminución del flujo genético causada por una reducción en la recombinación a nivel pericentromérico en los cromosomas Robertsonianos. Es por ello importante estudiar aquellos aspectos que pueden determinar un aislamiento genético entre las poblaciones que forman estas áreas. En este marco, los objetivos de la presente tesis fueron: 1) realizar un estudio exhaustivo de la estructura poblacional referente a la presencia de estas fusiones; 2) determinar cómo afecta la heterocigosidad estructural de las translocaciones Robertsonianas a nivel reproductivo en ejemplares pertenecientes a esta zona de polimorfismo cromosómico; 3) valorar el grado de aislamiento genético entre diferentes grupos cromosómicos mediante un estudio comparado de morfología craneana y post-craneana; 4) determinar las posibles relaciones entre el cariotipo y el comportamiento de los animales.Los resultados obtenidos mostraron que las poblaciones de ratón doméstico ubicadas en la provincia de Barcelona y alrededores forman una zona de polimorfismo Robertsoniano, no pudiendo considerar este conjunto poblacional como una zona híbrida, puesto que no ha sido detectada ninguna raza cromosómica. Las poblaciones de esta área funcionan como unidades panmíticas separadas. Se puso en evidencia la existencia de una nueva fusión, Rb(7.17), no descrita previamente en ninguna población Robertsoniana de la especie. La notable extensión de esta zona (5000 km2) sugiere que la eficacia biológica de los individuos portadores de translocaciones no está severamente afectada. En la línea de células germinales masculinas se apreció una mayor muerte celular en aquellos ejemplares con fusiones Robertsonianas, especialmente cuando más de una translocación ha estado presente en heterocigosis estructural. Se detectó un patrón general en el cambio de forma relacionado con la heterocigosidad estructural y el número cromosómico, aunque dicha variación de forma es de carácter moderado. La diferenciación morfológica de los animales estándar respecto a los ejemplares que presentan polimorfismo Robertsoniano, sugiere un aislamiento genético de estos últimos. La existencia de diferenciación genética dentro de la zona de polimorfismo Robertsoniano vino también avalada por las diferencias significativas detectadas en la pauta de comportamiento, estudiada mediante el patrón diario de la actividad motora (variable regulada por el sistema circadiano). Respecto a esta variable se obtuvo que las fusiones Robertsonianas no afectan a las principales características del reloj circadiano pero sí a la modulación ultradiana del ritmo circadiano. El patrón de actividad motora se mostró como una variable apropiada para la discriminación entre grupos de ratones diferenciados cromosómicamente.Se concluye que las fusiones Robertsonianas presentes en esta zona han contribuido a la diferenciación morfológica y etológica entre las poblaciones que la forman, circunstancia que sugiere la existencia de diferencias genéticas entre ellas. De aquí se desprende que la zona de polimorfismo presente en la provincia de Barcelona y en sus inmediaciones constituye un escenario muy apropiado para estudiar aspectos relacionados con el proceso de especiación

La febre mediterrània familiar (FMF) afecta unes 10.000 i 100.000 persones d'origen principalment àrab, armeni, turc i jueu i és caracteritza per la recurrència d'episodis autolimitats de febre i inflamació de seroses, sense una causa infecciosa aparent. A la població espanyola, els pacients de FMF descrits són casos aïllats i el recull més extens és el de pacients xuetes de Mallorca. La recent clonació del gen MEFV, al 1997, va constituir un punt d'inflexió en l'estudi de la FMF en els més diversos aspectes de la malaltia i va crear grans expectatives en els camps del diagnòstic, terapèutic i preventiu. A més, l'estudi en poblacions no ancestrals era un camp totalment inexplorat, començant pel fet que es considerava que la FMF no les afectava.La hipòtesi de treball d'aquesta tesi s'ha basat en què l'estudi de les mutacions del MEFV en els pacients de FMF espanyols, així com la detecció de la possible intervenció de factors modificadors de la malaltia, permetria establir la relació causal de les mutacions al gen MEFV i la FMF i establir-ne les bases genètiques. A més, l'estudi de la dinàmica genòmica del locus MEFV permetria estudiar la història natural de les mutacions més freqüents a la vessant occidental de la Mediterrània.Les conclusions de l'estudi són, en quant a les bases genètiques de la FMF a la població espanyola, que només el 53% dels pacients de FMF espanyols tenen una o dues mutacions en el gen MEFV, essent l'espectre de mutacions força heterogeni, mentre que el 47% dels pacients espanyols diagnosticats clínicament de FMF no presenta cap mutació al MEFV ni en cap dels gens coneguts responsables d'altres SHFP. Existeix una alta freqüència de pacients heterocigots qüestiona el patró d'herència de la FMF i suggereix l'existència d'almenys un altre locus implicat en la malaltia. D'altra banda, els pacients espanyols diagnosticats clínicament de FMF probable sense mutacions al gen MEFVpodrien manifestar un fenotip de FMF inusual o bé una nova síndrome de febre periòdica, altrament anomenada, FMF-like.Els pacients de FMF a la població espanyola no pertanyen a cap ètnia relacionada amb les de les poblacions anomenades ancestrals, per la qual cosa l'origen ètnic no s'hauria de considerar un criteri d'exclusió en el diagnòstic clínic de FMF a la població espanyola. Clínicament, els pacients espanyols diagnosticats de FMF constitueixen un grup heterogeni: un subgrup manifesta la simptomatologia clínica típica de la malaltia, on ni l'amiloïdosi ni l'ELE ni l'historial familiar són manifestacions clíniques freqüents, mentre que l'altre subgrup manifesta episodis lleugerament més llargs i amb una major freqüència de limfadenopaties i mialgia. Es conclou que és necessari afegir l'anàlisi de la totalitat dels exons del MEFV en el diagnòstic de la FMF a la població espanyola.A la població general espanyola s'observa una diversitat d'haplotips del MEFV força limitada causada per l'alt LD dels subhaplotips de cada bloc. L'equilibri de lligament entre els haplotips majoritaris del gen MEFV i l'alt LD de cada subhaplotip suggereix l'existència d'un punt calent de recombinació a l'intró 2, que constituiria un mecanisme plausible de generació dels haplotips majoritaris. Es proposa, per primera vegada, una nomenclatura sistematitzada dels haplotips de SNPs intragènics al gen MEFV, basada en criteris genètics i independentment del grup ètnic on s'han estat descrits. A més, es descriuen Tag-SNPs, per tal d'optimitzar la recerca de futurs estudis.L'estudi dels haplotips associats a mutacions al MEFV en pacients de FMF revela la proximitat genètica de la població espanyola amb altres poblacions no ancestrals com la italiana o la francesa i una clara distància amb les poblacions ancestrals i estaria d'acord amb l'origen jueu sefardita dels xuetes.

El càncer de mama és la neoplàsia més freqüent en la dona a Catalunya, amb una prevalença de 45.000 casos l'any 2005. Entre un 5% i un 10% de tots els casos presenta un component hereditari degut a mutacions germinals en gens de susceptibilitat, fonamentalment BRCA1 i BRCA2, els quals s'associen a la síndrome de càncer de mama i ovari hereditari (CMOH), caracteritzada per la presència de casos de càncer de mama i ovari en una mateixa família o de múltiples casos de càncer de mama precoç. L'objectiu principal d'aquest treball és l'estudi molecular dels gens BRCA1 i BRCA2 en pacients amb sospita de síndrome de CMOH. La identificació de mutacions en aquests pacients facilita l'assessorament genètic i l'aplicació de mesures de prevenció, detecció precoç i terapèutiques adequades.Els mètodes utilitzats per a la detecció de mutacions en BRCA1 i BRCA2 són l'anàlisi de conformacions de cadena senzilla (SSCP), l'anàlisi de la proteïna truncada (PTT) i la seqüenciació dels fragments amb mobilitat electroforètica anormal. Els nostres resultats mostren que les famílies espanyoles amb CMOH presenten una gran diversitat al·lèlica en els gens BRCA1 i BRCA2, amb les mutacions distribuïdes al llarg de tota la seqüència. La freqüència global de mutacions identificades (propera al 30%) és similar a la trobada en altres poblacions i, en general, el percentatge de mutacions augmenta amb el nombre de casos de càncer en la família. A més, s'evidencia la relació entre càncer d'ovari i BRCA1 i càncer de mama en homes i BRCA2. Addicionalment, s'ha analitzat l'haplotip associat a tres mutacions que apareixen de forma recurrent en diverses famílies, mitjançant l'estudi de marcadors microsatèl·lits polimòrfics. La identificació d'haplotips específics associats a la mutació 330A>G en BRCA1, present en famílies d'origen gallec, i a les mutacions 9254del5 i 6857delAA en BRCA2, presents en famílies de l'àrea mediterrània, suggereix l'existència de subpoblacions espanyoles amb mutacions característiques.Finalment, s'ha avaluat la possible patogenicitat de les variants d'efecte biològic desconegut identificades durant el procés de detecció de mutacions. Aquestes variants no es poden classificar, únicament amb la informació que ens proporciona l'estudi del DNA, com a mutacions associades a la malaltia o com a polimorfismes innocus, de manera que dificulten l'assessorament genètic dels pacients i requereixen anàlisis addicionals. Per exemple, l'anàlisi de l'RNA missatger de portadors permet establir possibles efectes en el procés de maduració de l'RNA (splicing). Malgrat que existeixen diversos mètodes teòrics per predir potencials alteracions en l'splicing, els resultats observats amb l'estudi de l'RNA no coincideixen totalment amb els obtinguts amb aquests mètodes, pel que s'han de considerar amb prudència i es recomana l'anàlisi de l'RNA sempre que sigui possible. / Breast cancer is the most common malignancy among woman in Catalonia, with a prevalence of 45.000 cases in 2005. It is currently estimated that 5-10% of all breast cancers are hereditary and attributable to mutations in several highly penetrant susceptibility genes of which only two have been identified: BRCA1 and BRCA2. BRCA1 and BRCA2 mutations are associated with the hereditary breast and ovarian cancer (HBOC)syndrome, characterized for the presence of both breast and ovarian cases in the same family or for several cases of early onset breast cancer. The principal aim of this thesis is the molecular study of BRCA1 and BRCA2 genes in patients with HBOC syndrome. The identification of mutations in these patients facilitates the genetic assessment and the application of preventive measures, early detection and appropriate therapeutics. Analyses of the entire coding and flanking sequences were carried out by a combination of SSCP (single strand conformation polymorphism) and PTT (protein truncation test), followed by direct sequencing of abnormal bands. Our results show that HBOC Spanish families present a high allelic diversity in BRCA genes, with mutations distributed all over the sequence. The global frequency of mutations detected (of about 30%) is similar to that founded in other populations and, in general, the rate of mutations increases with the number of cancer cases in the family. Furthermore, ovarian cancer associates to BRCA1 and male breast cancer to BRCA2.Additionally, we analysed the haplotype associated to three mutations which appear recurrently in several families, employing microsatellite markers. Identification of a specific haplotype associated to the 330A>G mutation in BRCA1, present in Galician families, and to the 9254del5 and 6857delAA mutations in BRCA2, present in Mediterranean families, suggests the existence of Spanish subpopulations with characteristic mutations.Finally, we evaluated the pathological effect of variants of unknown pathological significance by RNA analysis. This information is essential for providing efficient counselling for breast/ovarian cancer families.

Las mutaciones en el factor de transcripción HNF1a son la causa más frecuente de diabetes tipo MODY. HNF1a está implicado en una compleja red transcripcional responsable de la diferenciación y función de la célula beta. El estudio de modelos genéticos deficientes para HNF1a será pues de gran relevancia para la comprensión de las bases moleculares de la diabetes MODY y del programa transcripcional responsable del desarrollo de la célula beta, pero también de manera más general, para estudiar como un activador regula la transcripción. El objetivo de este trabajo de tesis es pues emplear diferentes modelos genéticos para comprender aspectos funcionales de HNF1a en un contexto celular in vivo.En una primera parte, nos planteamos responder dónde, cuándo y cúanto HNF1a es necesario para ejercer su función en la célula beta. Diseñamos un modelo de expresión de HNF1a específico de célula beta e inducible por tetraciclina. El sistema sobreexpresaba HNF1a en células beta, lo que inhibía el ciclo celular e inducía apoptosis reduciendo progresivamente la masa de célula beta que acababa derivando en diabetes. Como la inducción de HNF1a en células beta era heterogénea pudimos comprobar que la función de HNF1a tiene autonomía celular y es rescatable postnatalmente sólo en aquellas células deficientes para HNF1a que reexpresaban HNF1a a niveles casi fisiológicos. Concluyendo, en esta primera parte del proyecto se demostró que HNF1a puede ejercer su función en células beta expresándose sólo en células beta, que esta función no está restringida a un momento determinado del desarrollo embrionario y que es altamente dependiente de los niveles de expresión, puesto que tanto mutaciones en heterocigosidad como la sobreexpresión causan diabetes. Estos resultados tienen importantes implicaciones en el diseño de terapias génicas para la cura de la diabetes MODY y en el desarrollo de protocolos de diferenciación in vitro de células beta para su posterior transplante. Así mismo llama la atención sobre los peligros de sobreexpresar factores de transcripción en células beta.En la segunda parte, nos planteamos cómo regula HNF1a la transcripción. Un nuevo nivel de regulación de la transcripción está emergiendo, el posicionamiento génico en subdominios nucleares en fución de la actividad transcripcional. Por otro lado se sabe que HNF1a induce la acetilación de los promotores de sus genes diana. El objetivo de esta segunda parte es estudiar como HNF1a influye las modificaciones de histona a nivel local de cromatina y el reposicionamiento génico en el espacio nuclear para establecer así la relación entre estos dos niveles de regulación de la transcipción. Mediante el uso de un modelo deficiente para HNF1a, demostramos que HNF1a induce la metilación en H3-Lys4 e impide la metilación en H3-Lys27 de sus genes diana. Así mismo estas modificaciones de histona se distribuyen no aleatoriamente en el espacio nuclear formando subdominios. HNF1a induce el reposicionamiento selectivo de sus loci diana de dominios ricos en H3-trimetil Lys27 a dominios activadores ricos en RNA polimerasa II y H3-dimetil Lys4, en concordancia con los cambios observados localmente. Concluyendo, en esta segunda parte demostramos por primera vez que el posicionamiento génico puede ser dependiente de un activador y que afecta selectivamente al locus diana. También demostramos por primera vez que las modificaciones de histona que regulan la transcripción localmente a nivel de la cromatina también tienen una representación espacial en el núcleo de manera que los genes se posicionan en dominios ricos en determinadas modificaciones de histona en función de su actividad transcripcional. Este trabajo de tesis tiene importantes implicaciones en la comprensión de las bases moleculares de una enfermedad humana y añade nuevas perspectivas al estudio de la función de un activador transcripcional. / Mutations in the transcription factor HNF1a are the major cause of MODY type diabetes. HNF1a is implicated in a complex transcriptional network responsible for beta-cell development and function. The study of genetic models deficient for that activator would not only be useful for understanding the molecular bases of a human disease, but also for the study of the transcriptional network implicated in the differentiation of beta-cells and the study of how transcription is actually regulated.The aim of this project of thesis was to understand the function in vivo of HNF1a in beta-cells using genetic models.In the first part, we aimed to assess when, where and how much HNF1a is needed in the beta-cell to be functional. For that purpose, we used a conditional and cell-specific model that overexpressed HNF1a only in beta-cells and in the absence of tetracycline. We demonstrated that the function of HNF1a in beta-cells is cell-autonomous, can be rescued postnatally and is tightly dependent on its expression levels, since both mutations in heterozygosity and overexpression lead to diabetes. These results have important implications in the development of gene therapies for MODY3 patients and for the establishment of good protocols for beta-cell differentiation in vitro for transplantation. This study also highlights the risk of misexpressing transcriptions factors in beta-cells. In the second part, we aimed to understand how HNF1a regulates transcription using an HNF1a-deficient model. HNF1a induces changes locally at the chromatin level by preventing the methylation of H3-Lys27 and inducing the acetylation and methylation of H3-Lys4 of its targets nucleosomes. HNF1a also induces the repositionning of its target loci from H3-methyl Lys27 rich domains to active RNA polymerase II and H3-methyl Lys4 rich domains in the nuclear space, concordantly with the changes observed locally. Thus, for the first time we show that an activator can locus-selectively determine the subnuclear positioning of its targets and that histone modifications have a functional representation in the nuclear space. This thesis add novel insights to our understanding of the in vivo function of a transcriptional activator, and for the first time link subnuclear gene repositioning to a human transcriptional disease.

Les miopaties miofibril•lars (MFM) són un grup heterogeni de malalties musculars progressives, que es caracteritzen morfològicament per la dissolució focal de les miofibril•les, l’acumulació dels productes que resulten de la degradació miofibril•lar i l’expressió ectòpica de múltiples proteïnes en forma d’agregats intracitoplasmàtics insolubles. Les MFM estan causades per mutacions a diferents gens, la majoria dels quals codifiquen per proteïnes sarcomèriques del disc Z o bé per proteïnes que resulten indispensables per mantenir-ne la seva integritat. Aquestes són la desmina, l’αB-cristal•lina, la miotilina, la ZASP (Z-band alternatively spliced PDZ motif-containing protein) i la filamina C. Altres gens que s’inclouen en classificacions més àmplies de les MFM són el gen del FHL1 (four-and-a-half LIM domain 1), el gen del BAG3 (Bcl-2- associated athanogene-3) o el gen de la plectina.

Numerosos estudios han relacionado la enfermedad de Alzheimer (EA) con defectos mitocondriales. Tales defectos incluyen anomalías de tipo estructural, bioquímico y genético. Entre las de tipo genético destacan los reordenamientos y las mutaciones puntuales descritas en el DNA mitocondrial (mtDNA). Otros estudios no han podido confirmar esos hallazgos. Objetivo: Estudiar la incidencia de defectos en el mtDNA (mutaciones puntuales, reordenamientos, depleción, reducción en la expresión de genes mitocondriales) de pacientes con EA y la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial y determinar las posibles diferencias respecto a individuos control. Pacientes y métodos. Necropsias de cerebelo, córtex frontal e hipocampo de pacientes con EA y controles. También se dispuso de sangre de enfermos vivos diagnosticados de EA y de controles. Resultados: No se observaron diferencias entre pacientes y controles, ni en tejidos cerebrales ni en sangre en los análisis realizados mediante Southern. No se halló asociación entre las mutaciones puntuales analizadas, reordenamientos, depleción o reducción en la expresión de genes mitocondriales y la EA. Pacientes y controles mostraros similares tasas de respiración y actividades enzimáticas de los complejos respiratorios, tampoco hubo diferencias significativas al estudiar la peroxidación (indicador del estrés oxidativo) en pacientes y controles. Conclusiones. Los resultados obtenidos no apoyan la hipótesis de una implicación mitocondrial en la EA en los pacientes analizados, lo cual no descarta la posible existencia de otras mutaciones puntuales en otras regiones no analizadas y/o eventualmente de otros defectos mitocondriales no analizados en esta tesis que contribuyan al desarrollo de la EA. / There is mounting evidence for mitochondrial involvement in neurodegenerative diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis. Defects in mitochondrial oxidative phosphorylation have frequently been associated with Alzheimer's disease (AD). Cybrid technology has facilitated the study of energy metabolism in AD, suggesting that the most consistent mitochondrial electron transport chain (ETC) defect reported in AD, a deficit in cytochrome c oxidase, could be determined by the mitochondrial genome (mtDNA). These and other findings have raised the issue of whether genetic alterations, inherited or acquired, underlie the disordered energy metabolism. The study of mitochondrial genetics in AD patients has been performed with the idea that any mtDNA defect has potential consequences in ETC, contributing to mitochondrial dysfunction through ATP production impairment, which could interfere among others, with calcium homeostasis, amyloid metabolism and reactive oxygen species generation, enhancing the susceptibility of neurons to cell death.

La Síndrome de Rett (RTT), és una malaltia del desenvolupament neurològic, d'inici precoç i que afecta quasi de forma exclusiva a les nenes. La seva incidència és de 1:10000-1:15000, i constitueix la segona causa de retard mental més freqüent en dones després de la Síndrome de Down. La malaltia té dues presentacions clíniques, la forma clàssica i diferents formes atípiques (forma d'inici precoç o congènita, variant amb epilèpsia precoç, variant amb llenguatge conservat, forma fruste i variant amb regressió tardana). El diagnòstic de la RTT es realitza per criteris clínics, que inclouen criteris necessaris, criteris de suport i criteris d'exclusió. L'objectiu fonamental d'aquesta tesi l'any 1999 era la identificació del gen responsable de la malaltia, però el gen va ser descrit a l'octubre de 1999 per Amir i col., la qual cosa va fer que es modifiquessin els objectius. Actualment sabem que la RTT és una malaltia dominant lligada al cromosoma X, causada en un elevat percentatge de casos per mutacions de novo en la regió codificant del gen MECP2.MECP2 codifica per la proteïna methyl-CpG-binding protein 2(MeCP2). La proteïna conté dos dominis funcionals: el domini d'unió al DNA i el domini catalític. MeCP2 s'uneix selectivament a dinucleòtids CpG metilats i forma un complex inhibidor mitjançant la seva unió a diferents correpresors, el qual modifica l'estructura de la cromatina i reprimeix l'expressió d'altres gens. MECP2 és, per tant, un gen modulador de processos epigenètics que regula l'expressió d'altres gens.S'han identificat mutacions en la regió codificant de MECP2 en el 70% de pacients amb RTT, però s'ha vist que el percentatge de detecció de mutacions varia segons la forma clínica de la malaltia. Les mutacions es produeixen de novo en més d'un 99% del casos. Tot i així i degut al risc de mosaïcisme germinal, el diagnòstic prenatal està indicat en l'RTT, independentment del sexe del fetus, sempre que es conegui la mutació en la germana afectada.En la present tesi, s'ha posat de manifest que barons amb cariotip normal poden presentar RTT clàssica degut a mosaïcisme somàtic per una mutació en el gen MECP2, i que delecions en pauta en la regió C-terminal de la proteïna MeCP2 poden ser variants polimòrfiques sense relació amb la malaltia.El servei de Neurologia de l'Hospital Sant Joan de Déu, va elaborar un cheklist amb la finalitat d'establir uns barems per a puntuar les diferents variables clíniques característiques de l'RTT, i poder definir el grau d'afectació de les pacients. Per realitzar les correlacions, les pacients han estat classificades en 2 grups, segons el tipus de mutació (portadores de mutacions de canvi d'aminoàcid i portadores de mutacions que produeixen proteïna truncada) i segons la localització de les mutacions (mutacions localitzades dins de MBD o TRD).Fins el moment, l'anàlisi de mutacions dut a terme per tots els grups que treballem en la RTT ha estat restringida a la regió codificant del gen MECP2 (exons 2, 3 i 4), la qual dóna lloc a la proteïna. En aquesta tesi s'ha estudiat la regió promotora del gen MECP2, i s'ha detectat un canvi en una pacient amb RTT clàssica que podria tenir un efecte patogènic i ser el causant de la malaltia en la pacient: el canvi -5134delC trobat en l'exó1 del gen MECP2 afecta la diana d'un factor de transcripció específic del sistema nerviós i provoca una disminució en la seva afinitat d'unió.S'ha descrit també, l'existencia d'un splicing alternatiu a la regió 5' de MECP2 que no és específic de teixit, i que podria donar lloc a dues isoformes de MeCP2 divergents a N-terminal. Desconeixem encara si l'RTT presenta homogeneïtat o heterogeneïtat genètica.

La malaltia de Gaucher i la síndrome de Sanfilippo A, anomenada també mucopolisacaridosi IIIA (MPS IIIA), són malalties d'acumulació lisosòmica.En el present treball es mostra la cerca de mutacions responsables de la MPS IIIA en 26 pacients espanyols. S'han identificat 47 dels 52 al·lels responsables de la malaltia, el que correspon al 90% del al·lels mutats. La mutació c.1079delC (abans c.1091delC) és la més prevalent entre els pacients d'origen espanyol amb un 36,5% del total d'al·lels mutats. S'han analitzats també quatre polimorfismes interns per a construir els haplotips associats a les mutacions identificades. Hem comprovat que els cromosomes portadors de la mutació majoritària comparteixen el mateix haplotip [T, T, +ins, G], fet que suggereix un origen únic per aquesta mutació.La cerca de les mutacions responsables de la MPS IIIA serà, i de fet ja ha estat, útil per oferir el diagnòstic molecular a familiars dels pacients afectes per la MPS IIIA. En total, hem realitzat el diagnòstic molecular de 4 possibles portadors i confirmat dos diagnòstics prenatals realitzats enzimàticament. Hem comprovat la patogenicitat d'algunes de les mutacions identificades. Concretament, les mutacions S66W, R74H, Q85R, R206P, L386R, c.1079delC, R433W i R433Q han estat expressades emprat un sistema basat en l'obtenció de baculovirus recombinants mitjançant transposició de lloc específic. Els resultats revelen que totes les proteïnes mutades presenten baixos, sinó nuls, nivells d'activitat malgrat que en les anàlisis de westerns blot es detecta tant la proteïna precursora com la madura. Únicament, la sulfamidasa amb les mutacions p.S66W i p.R206P presenta certs nivells d'activitat enzimàtica.La malaltia de Gaucher està causada per la deficiència en l'activitat beta-glucosidasa àcida. Per tal de determinar la patogenicitat d'algunes de les mutacions responsables de la malaltia de Gaucher identificades en treballs anteriors del nostre grup, s'ha procedit a la seva expressió en cèl·lules d'insecte (Sf9). El sistema d'expressió escollit fou el mateix que per l'expressió de la sulfamidasa. Les mutacions P182L, R257X, Y313H, P391L i N392I presenten nivells d'activitat negligibles. Les mutacions N370S, I402T, D409, L444P i els dobles mutants [L444P;E326K] i [N188S;E326K], presenten nivells d'activitat entre el 6% i el 23% respecte la proteïna salvatge. Les N188S i E326K, presenten nivells d'activitat elevats del 42,7% i 66,6%, respectivament. Aquestes mutacions podrien ser considerades com a "variants modificadores", les quals al trobar-les soles en un al·lel no provocarien la malaltia o provocarien uns efectes molt lleus. En canvi, al trobar-les un combinació amb una segona mutació tindrien un efecte additiu incrementant la patogenicitat de l'altra mutació.En el present treball s'ha avaluat també l'efecte del procés de "nonsense mediated decay" (NMD) sobre quatre trànscrits diferents portadors de les següents mutacions: W(-4)X, R257X, c.1098insA i c.1451delAC. Amb l'ús de diferents tècniques (RT-PCR i digestió; PCR quantitativa; i, el test de la proteïna truncada) hem pogut demostrar que dels trànscrits analitzats únicament els que presenten les mutacions R257X i c.1098insA són degradats pel mecanisme de NMD. Les dades funcionals i mutacionals obtingudes en el present treball ens ajuden a entendre el mecanisme enzimàtic de la sulfamidasa i de la beta-glucosidasa àcida.