El càncer de mama és la neoplàsia més freqüent en la dona a Catalunya, amb una prevalença de 45.000 casos l'any 2005. Entre un 5% i un 10% de tots els casos presenta un component hereditari degut a mutacions germinals en gens de susceptibilitat, fonamentalment BRCA1 i BRCA2, els quals s'associen a la síndrome de càncer de mama i ovari hereditari (CMOH), caracteritzada per la presència de casos de càncer de mama i ovari en una mateixa família o de múltiples casos de càncer de mama precoç. L'objectiu principal d'aquest treball és l'estudi molecular dels gens BRCA1 i BRCA2 en pacients amb sospita de síndrome de CMOH. La identificació de mutacions en aquests pacients facilita l'assessorament genètic i l'aplicació de mesures de prevenció, detecció precoç i terapèutiques adequades.Els mètodes utilitzats per a la detecció de mutacions en BRCA1 i BRCA2 són l'anàlisi de conformacions de cadena senzilla (SSCP), l'anàlisi de la proteïna truncada (PTT) i la seqüenciació dels fragments amb mobilitat electroforètica anormal. Els nostres resultats mostren que les famílies espanyoles amb CMOH presenten una gran diversitat al·lèlica en els gens BRCA1 i BRCA2, amb les mutacions distribuïdes al llarg de tota la seqüència. La freqüència global de mutacions identificades (propera al 30%) és similar a la trobada en altres poblacions i, en general, el percentatge de mutacions augmenta amb el nombre de casos de càncer en la família. A més, s'evidencia la relació entre càncer d'ovari i BRCA1 i càncer de mama en homes i BRCA2. Addicionalment, s'ha analitzat l'haplotip associat a tres mutacions que apareixen de forma recurrent en diverses famílies, mitjançant l'estudi de marcadors microsatèl·lits polimòrfics. La identificació d'haplotips específics associats a la mutació 330A>G en BRCA1, present en famílies d'origen gallec, i a les mutacions 9254del5 i 6857delAA en BRCA2, presents en famílies de l'àrea mediterrània, suggereix l'existència de subpoblacions espanyoles amb mutacions característiques.Finalment, s'ha avaluat la possible patogenicitat de les variants d'efecte biològic desconegut identificades durant el procés de detecció de mutacions. Aquestes variants no es poden classificar, únicament amb la informació que ens proporciona l'estudi del DNA, com a mutacions associades a la malaltia o com a polimorfismes innocus, de manera que dificulten l'assessorament genètic dels pacients i requereixen anàlisis addicionals. Per exemple, l'anàlisi de l'RNA missatger de portadors permet establir possibles efectes en el procés de maduració de l'RNA (splicing). Malgrat que existeixen diversos mètodes teòrics per predir potencials alteracions en l'splicing, els resultats observats amb l'estudi de l'RNA no coincideixen totalment amb els obtinguts amb aquests mètodes, pel que s'han de considerar amb prudència i es recomana l'anàlisi de l'RNA sempre que sigui possible. / Breast cancer is the most common malignancy among woman in Catalonia, with a prevalence of 45.000 cases in 2005. It is currently estimated that 5-10% of all breast cancers are hereditary and attributable to mutations in several highly penetrant susceptibility genes of which only two have been identified: BRCA1 and BRCA2. BRCA1 and BRCA2 mutations are associated with the hereditary breast and ovarian cancer (HBOC)syndrome, characterized for the presence of both breast and ovarian cases in the same family or for several cases of early onset breast cancer. The principal aim of this thesis is the molecular study of BRCA1 and BRCA2 genes in patients with HBOC syndrome. The identification of mutations in these patients facilitates the genetic assessment and the application of preventive measures, early detection and appropriate therapeutics. Analyses of the entire coding and flanking sequences were carried out by a combination of SSCP (single strand conformation polymorphism) and PTT (protein truncation test), followed by direct sequencing of abnormal bands. Our results show that HBOC Spanish families present a high allelic diversity in BRCA genes, with mutations distributed all over the sequence. The global frequency of mutations detected (of about 30%) is similar to that founded in other populations and, in general, the rate of mutations increases with the number of cancer cases in the family. Furthermore, ovarian cancer associates to BRCA1 and male breast cancer to BRCA2.Additionally, we analysed the haplotype associated to three mutations which appear recurrently in several families, employing microsatellite markers. Identification of a specific haplotype associated to the 330A>G mutation in BRCA1, present in Galician families, and to the 9254del5 and 6857delAA mutations in BRCA2, present in Mediterranean families, suggests the existence of Spanish subpopulations with characteristic mutations.Finally, we evaluated the pathological effect of variants of unknown pathological significance by RNA analysis. This information is essential for providing efficient counselling for breast/ovarian cancer families.

ANTECEDENTSEl coneixement de Ies diferents activitats de transport d'aminoàcids prové de l'anàlisi del transport d'aquests en cèl.lules o vesícules de membrana provinents del teixit que es vol analitzar. A causa de la presència escassa d'aquestes proteïnes en la membrana i també la seva baixa estabilitat, conèixer la proteïna responsable de la funció per una estratègia clàssica de purificació-reconstitució presenta moltes dificultats. A més, és possible que algunes entitats de transport estiguin formades per diferents polipèptids amb propietats fisicoquímiques diferents, i encara és més difícil poder arribar a tenir una fracció totalment pura del transportador analitzat. Davant d'aquestes dificultats, l'expressió funcional en oòcits de "Xenopus" representa una estratègia altemativa per a l'aïllament molecular de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids, sempre que les seves activitats siguin detectables en expressar-les en l'oòcit.D'aquesta forma, el nostre grup va expressar activitat independent de Na+ de transport d'aminoàcids injectant en oòcits poli(A)+ de ronyó de conill. Aquesta activitat de transport era d'especificitat àmplia per a aminoàcids neutres i bàsics, i era saturable amb una K(m) al voltant de 0.6 mM. El missatger responsable d'aquesta activitat tenia una mida entre 1.8 i 2.4 kb (evidenciat per separació del poli(A)+ per mida en gradients de sacarosa i injecció de les diferents fraccions en l'oòcit). Amb aquestes evidències, el nostre grup, en col.laboració amb el grup del professor Heini Murer, va clonar per expressió funcional un cDNA que en expressar-se en oòcits induïa la mateixa activitat que es veia en injectar el poli(A)+ de ronyó. A més, l'activitat d'aquest poli(A)+ s'inhibia en incubar aquest amb un oligo antisentit generat a partir de la seqüència d'aquest cDNA. Aquesta proteïna es va anomenar rBAT ("related to b(0,+) amina acid transport activity"), ja que l'activitat que induïa en oòcits era molt similar a la descrita en blastòcits de ratoli (b(0,+) per Van Winkle. La diferencia que hi havia entre aquestes dues activitats era que rBAT també induïa transport de cistina. Independentment, dos grups diferents van clonar la mateixa proteïna de rata. El transport induït per rBAT en oòcits de "Xenopus" era saturable, amb K(m) per a aminoàcids bàsics i cistina entre 50-100 mil.limicres i variable per a aminoàcids neutres que depenen del grup radical: l'afinitat era més alta quan més gran era el grup radical. Així, a per aminoàcids com la L-leucina la K(m) era de l'ordre de mil.limicres, per a altres com ara la L-alanina, de l'ordre de mM i, finalment l'L-glicina no era transportada. Aquesta activitat de transport no és estereoselectiva, els D-aminoàcids es transporten d'igual forma que els L-aminoàcids.Per tranferència Northem es va analitzar l'expressió de l'RNA missatger. En condicions d'alta astringència, el cDNA d'l'BAT hibrida amb transcrits de 2.2 i 3.8 kb presents en ronyó i mucosa intestinal. Aquestes diferències de mida es deuen a diferències en poliadenilació, fet que es va demostrar posteriorment en clonar-se el cDNA de 3.8 kb emprant també expressió funcional. En condicions de baixa astringència hi ha presència de senyal en cervell (3.8 i 5.4 kb) i en fetge (2.2 kb). Es pensa que deuen ser transcrits homòlegs però no idèntics, ja que no són protegits en un assaig de protecció a RNAases fent servir una sonda d'rBAT de rata. La seqüència d'aminoàcids deduïda a partir de la seqüència de nucleòtids permetia predir una proteïna de 677 aminoàcids amb un pes molecular de 78 kD. A partir de l'anàlisi d'hidrofobicitat i estudis fets amb sistemes de traducció "in Vitro" es va suggerir que la proteïna rBAT seria una glicoproteïna de membrana de tipus II (el domini N-terminal seria citosòlic) amb un únic domini transmembrana. El grup de S. Tate va estudiar més tard la topologia de la proteïna rBAT mitjançant anticossos policlonals dirigits contra diferents parts de la proteïna i, així, va deduir la presència de 4 dominis transmembrana, i que els extrems N i C-terminal són citosòlics. Aquest tipus d'estructura no era usual per als transportadors de membrana descrits fins a aquell moment, fet que va fer plantejar la qüestió de si aquesta proteïna era un transportador per si mateix, un activador de sistemes de transport endògens en l'oòcit, o si formava part d'un complex heterooligomèric amb proteïnes ja presents en l'oòcit.En mirar el banc de dades de gens clonats, es va trobar que el domini extraceI.lular presentava una homologia alta amb una família d'enzims relacionats amb el catabolisme dels sucres. En canvi, la proteïna rBAT no presenta aquesta activitat, ja que presenta una mutació en un residu implicat en el centre actiu de reconeixement dels sucres. A més, es va trobar que rBAT presentava un 30% d'identitat i un 50% de similitud amb la cadena pesada de l'antigen 4F2 (4F2hc). L'antigen 4F2 (també anomenat CD98) és no heterodimer format per una proteïna glicosilada de 85 kD (4F2hc) que havia estat clonada fent servir l'anticòs monoclonal anti-eD98, unit covalentment per ponts disulfurs a una proteïna d'uns 40 kD altament hidrofòbica, no gIicosilada i que no s'havia pogut microseqüenciar. Es desconeixia la funció que tenia 4F2hc, només s'havia suggerit la seva implicació en el cicle cel.lular, ja que és un marcador de proliferació i també se l'havia implicat en la modulació dels nivells intracel.lulars de calci.Sorprenentment, en injectar 4F2hc en l'oòcit, es va observar un increment d'una activitat de transport descrita per Rosa Devés com y(+)L en eritròcits. Aquesta activitat es caracteritza per una inducció de transport d'aminoàcids dibàsics de fomm independent de sodi i neutres de forma dependent de sodi. S'ha demostrat que l'efecte del sodi sobre el transport d'aminoàcids neutres consisteix en la reducció de l'afinitat en unes 50 vegades. La predicció d'estructura de 4F2hc deduïda a partir de la seqüència d'aminoàcids era la d'una proteïna amb un únic domini transmembrana, fet que va plantejar els mateixos dubtes que amb la proteïna rBAT respecte a quina era l'entitat molecular responsable del transport.En analitzar en més detall la seqüència d'aminoàcids de les dues proteïnes es va observar que hi havia un residu de cisteïna, just després del primer domini transmembrana que estava conservat en ambdues proteïnes. Es va hipotetitzar que aquest residu seria el responsable de la formació d'un pont disulfur amb la possible subunitat lleugera de la qual no es coneixia la seqüència.D'aquesta forma es van identificar dues proteïnes, rBAT i 4F2hc, com una nova família de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids. En aquell moment, i a causa del fet que l'BAT induïa transport de cistina en oòcits, es va plantejar la hipòtesi que rBAT fos un gen candidat per a la cistinúria. La cistinúria és una malaltia autosòmica recessiva que presenta com a fenotip bioquímic la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina. A causa de la solubilitat baixa de la cistina, aquesta precipita formant càlculs renals. Per demostrar aquesta hipòtesi, s'havien de trobar nous fets experimentals que estiguessin d'acord amb totes les alteracions descrites per a aquesta malaltia. Així, es va estudiar la localització subcel.lular i l'expressió durant el desenvolupament de la proteïna rBAT. Es va demostrar que la proteïna l'BAT es localitza en el domini apical del túbul proximal S3 i que la seva expressió era postnatal. Aquests fets coincidien amb el que es coneixia del transport de cistina i del lloc on residia el defecte causant de la cistinúria. D'aquesta forma, tots els fets apuntaven a rBAT com a gen candidat.Com a primer pas per detenninar si aquesta hipòtesi era certa, el nostre grup va aïllar i caracteritzar el cDNA corresponent a l'rBAT humà i es va iniciar la recerca de mutacions (principalment de tipus puntual) mitjançant la tècnica coneguda com SSCP en la seqüència codificant del gen d'individus cistinúrics. Així, es van descobrir 6 mutacions puntuals, entre les quals destacava la mutació Met461Thr, per trobar-se en homozigosi. Per mutagènesi dirigida es va construir un cDNA de rBAT humà amb aquesta mutació i es va analitzar funcionalment en oòcits. Es va observar que aquest mutant presentava un defecte en el transport mesurat tres dics després de la injecció, fet que reafirmava la implicació d'rBAT en la cistinúria. Sorprenentment, en realitzar el transport sis dies després de la injecció es va veure que no hi havia diferències respecte a la proteïna salvatge. Per poder explicar aquest comportament de manera més detallada i reafirmar de manera més forta la implicació d'rBAT en la cistinúria, vaig construir i analitzar el mutant Met467Lys, resultats que explico més endavant en l'apartat de "resultats".Aixi i tot, nos resultats obtinguts pel grup d'A Busch a Tübingen, en coI.laboració amb el nostre grup, van suscitar gran controvèrsia. Aquests resultats demostraven que l'activitat induïda per rBAT estava d'acord amb un intercanviador d'aminoàcids. Diferents grups van publicar que no podien comprendre com un intercanviador podria servir com a mecanisme de reabsorció d'aminoàcids. A més, cal recordar, que el fenotip de la cistinúria consisteix en la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina, mentre que rBAT també indueix transport d'aminoàcids neutres. L'explicació d'aquest interrogant ha estat també un dels objectius de la meva tesi.Un detall important i no comentat fins ara és que la cistinúria és una malaltia heterogènia. S'han descrit tres tipus de cistinúria basant-se en les concentracions d'aminoàcids bàsics i cistina en homozigots i heterozigots per a la malaltia i en funció de l'absorció intestinal.El nostre grup va observar quc hi havia famílies on no hi havia una cosegregació entre el locus rBAT i la cistinúria, fet que plantejava la possibilitat que la cistinúria fos una malaltia deguda a mutacions en diferents gens, Una anàlisi més precisa del fenotip d'aquestes famílies va permetre dir que els tipus II i III de cistinúria no són causats per mutacions en rBAT. Quins podrien ser aquests altres gens candidats de cistinúria? Un possible candidat seria un altre transportador de cistina que estigués en els segments S1 i S2 del túbul renal. En aquesta línia, Segal, el 1977, va detectar fent servir vesicules apicals de ronyó de rata dos components de transport de cistina: un d'afinitat alta i capacitat baixa compartit amb aminoàcids bàsics (que podria correspondre a l'activitat deguda a rBAn i no altre d'afinitat baixa (K., =0.93 mM) i capacitat alta. A més, per estudis de microperfusió en túbuls aïllats, Vòlkl i Silbemagl van demostrar que al voltant del 90% de la cistina infosa pel túbul era reabsorbida pel túbul contornejat distal i que aquesta reabsorció era inhibida per fenilalanina a una concentració de 10 mM. Així, el gen o els gens responsables d'aquest sistema de transport podrien ser també gens de cistinúria. Un altre gen candidat seria la possible subunitat lleugera, que igual que per a la proteïna 4F2hc estaria lligada a rBAT per ponts disulfur. Quines evidències hi ha sobre la presència d'aquesta subunitat?:1. Si es fan experiments de transferència western fent servir un anticòs dirigit contra la proteïna rBAT amb membranes de ronyó, el pes que es detecta és diferent en funció de la presència o no d'agents reductors. Així, en absència d'agents reductors es detecten bandes de 125 kD de mobilitat electroforètica i de més alt pes molecular, mentre que la seva movilitat en presència d'agents reductors és de 94 kD. En tractar amb endoglicosidasa F aquesta banda de 94 kD passa a tenir una mobilitat que està d'acord amb el pes molecular deduït a partir de la seqüència d'aminoàcids. Per experiments de transferència western en gels de dues dimensions (primera dimensió no reductora, segona dimensió reductora) i per experiments de "crosslinking" amb reducció posterior, s'ha observat que la banda de 94 kD forma part d'aquest complex. Malauradament, no s'ha pogut immunoprecipitar aquest complex com s'havia fet en el cas de l'antigen 4F2, que demostrava directament que aquestes dues proteïnes interaccionen directament.2. L'expressió de la proteïna rBAT en cèl.lules heteròlogues (COS, MDCK) no suposa cap activitat de transport: la proteïna o no arriba a la membrana o si hi arriba no indueix cap activitat de transport. En aquestes cèl.lules transfectades no s'han detectat per transferència western aquestes bandes de pes molecular més alt (125 kD).3. Ens podem preguntar llavors si podem detectar aquests complexos de pes molecular més alt en l'oòcít de "Xenopus". En condicions no reductores s'ha observat una lIeugera banda de 125 kD (en comparació amb la intensilat de la banda de 94 kD), banda que s'ha postulat que seria homòloga a la detectada en membranes de ronyó.Així, totes aquestes evidències experimentals estan a favor d'un model on la proteïna rBAT estaria associada a una altra proteïna ("subunitat lleugera") mitjançant ponts disulfur. Aquesta possible proteïna seria, doncs, un altre gen candidat de cistinúria.OBJECTIUSTenint en compte els antecedents descrits en l'apartat anterior es van plantejar els següents tres objectius inicials:1. Reafirmar la implicació d'rBAT en la malaltia cistinúria construint per mutagènesi dirigida cDNA d'rBAT que continguessin alteracions en la seqüència d'aminoàcids.Així es va construir el mutant Met467Lys i es va caracteritzar en oòcits l'activitat induïda per intentar explicar el possible defecte que patien pacients cistinúrics que tinguessin la proteïna rBAT amb aquesta alteració.2. Intentar comprendre els mecanismes dc reabsorció d'aminoàcids bàsics i cistina partint de les activitats induïdes per rBAT i 4F2hc en l'oócit de "Xenopus". D'aquesta manera també es volia comprendre com alteracions en l'activitat b(0,+) induïda per rBAT podrien explicar el fenotip cistinúric.3. Estudiar el paper de les proteïnes rBAT i 4F2hc com a components i/o activadors dels sistemes de transport b(0,+) i (+)L respectivament.Es volia detenninar primer quina era l'estructura del transportador per poder identificar més tard quina era l'entitat molecular responsable del transport i aixi entendre com aquestes dues proteïnes (la cadena lleugera i la cadena pesada) interaccionaven entre si.CONCLUSIONS1. Es reafirma la implicació del gen rBAT en la cistinúria de tipus 1. Dues de les mutacions trobades en pacients cistinúrics, Met467Lys i Met46TThr, no són completament funcionals a causa d'un problema en el trànsit cap a la membrana plasmàtica.2. El transportador b(0,+) funciona com un intercanviador obligatori d'aminoàcids amb estequiometria 1:1. En aquesta tesi hem vist que el potencial de membrana i l'intercanvi amb aminoàcids neutres són les principals forçes que penneten acumular aminoàcids. Aquest mecanisme explica completament el fenotip de la cistinúria de tipus I. El transportador y(+)L també funciona com un intercanviadar d'aminoàcids, però de forma asimètrica ja que únicament permet la sortida d'aminoàcids bàsics, a causa probablement de les baixes concentracions de sodi intracel·lulars.3. Els transportadors b(0,+) i y(+)L formen part d'una gran família de transportadors heteromultimèrics constituïts per dues subunitats: una subunitat llengera (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-l, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, etc) responsable de l'especificitat de substracte, i una subunitat pesada (4F2he, rBAT), necessària per a l'expressió en superfície de la subunitat lleugera. Aquestes dues proternes interaccionen a través d'un pont disulfur entre 2 residus de cisteïna que estan altament conservats. A part d'aquesta interacció covalent, són necessàries altres interaccions entre altres dominis com ara l'extrem C-terminal d'rBAT. Així, rBAT determina propietats funcionals del transportador b(0,+).4. La mutació L334R trobada en un pacient espanyol amb LPI i la mutació V170M trobada en pacients jueus amb cistinúria de tipus no-I, provoquen un defecte en la funció de la proteïna y(+)LAT-1 i b(0,+)AT, respectivament.5. S'ha identificat una nova família de transportadors lisosomals formada per 3 membres, MfP, LyCAT i LyMAT. LyCAT funciona com un transportador lisosomal d'aminoàcids bàsics, mentre que LyMAT funciona com un transportador lisosomat de múltiples aminoàcids. El domini C-terminal d'aquestes proteïnes en determina la locaIització subcel·lular. Estudis posteriors permetran implicar el transportador Iisosomal LyCAT en la regulació de la síntesi de NO en macròfags, com permeten suggerir les dades obtingudes en la present tesi. / l. It is reaffirmed the implication of the gene rBAT in the type I cystinuria. Two of the mutations found in cystinuric patients, Met467Lys and Met467Thr, are not thoroughly functional due to a problem in the travel toward the plasma membrane.2. The carriers b(0,+) operates as a obligatory exchanger of amino acids with 1: 1 stoichiometry. In this thesis, we have seen that the membrane potential and the exchange with neutral amino acids are the principal forces that permit to accumulate amino acids. This mechanism fully explains the phenotype of the type I cystinuria. The carrier y(+)L also operates as an exchanger of amino acids, but in a asymmetrical way, since solely permits the exit of basic amino acids, because probably of the lower intracellular sodium concentrations.3. The carriers b(0,+) and y(+)L form part or a great heteromultimerics carriers family constituted by two subunits: a light subunit (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-I, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, ... ) responsible for the substrate specificity and a heavy subunit (4F2hc, rBAT) necessary for the expression in surface or the light subunit. These two proteins interact to through a disulfur bridge between two residues of cisteine that are highly preserved. In addition to this covalent interaction, they are necessary other domains as the extreme C-terminal of rBAT. Then, rBAT it determines functional properties or the transporter.4. The mutation L334R found in a Spanish patient with LPI and the mutation Vl70M found in Jewish patients with non-type I cystinuria provoke a defect in the function of the proteins y(+)LAT-I and b(0,+)AT, respectively.5. It has been identified a new family of lysosomal carriers formed by 3 members: MTP, LyCAT and LyMAT. LyCAT operates as a lysosomal carrier of basic amino acids, while LyMAT operates as a Iysosomal carrier of multiples amino acids. The C-terminal domain or these proteins determines their subcelular localization. Subsequent studies will alIow to imply the Iysosomal carrier LyCAT, in the regulation of the synthesis of NO in macrophages, as permit to suggest the data obtained in the present thesis.

La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) comprende un conjunto de trastornos hereditarios de la esteroidogénesis, causados por la deficiencia de alguna de las enzimas necesarias para la conversión del colesterol en cortisol. El más frecuente es el déficit en 21-hidroxilasa, responsable de cerca del 90% de los casos de HSC. El déficit en 21-hidroxilasa es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva, causado por una alteración genética en el gen CYP21B que codifica la enzima.Esta enfermedad presenta un espectro muy amplio de manifestaciones clínicas; desde formas severas que se presentan al nacimiento, en las que la virilización puede ir o no acompañada de un síndrome pierde sal, hasta formas más leves en que los signos de virilización se presentan más tardíamente. La incidencia de las formas clásicas de este déficit, oscila alrededor de 1:10.000-15.000 nacimientos, mientras la de las formas no clásicas se ha estimado en 1:1.000 en la población blanca, con marcadas variaciones étnicas.El objetivo ha sido la caracterización clínica, biológica y genética de la HSC por déficit en 21-hidroxilasa de una población de la Comunitat Autònoma de Catalunya, con el fin de poder realizar un diagnóstico etiológico concluyente y establecer el consejo genético familiar completo.Han colaborado 53 familias (106 cromosomas no emparentados) con al menos un hijo diagnosticado de HSC por déficit en 21-hidroxilasa, siendo el total de individuos estudiados de 214. De este total, 71 son pacientes que según los síntomas clínicos fueron clasificados en: 13 SW; 5 SV y 53 NC; 102 son progenitores y 41 son hermanos de dichos pacientes, ninguno de ellos clínicamente afecto.Para la determinación de la función hormonal se practicó una prueba de estimulación con corticotropina (test de ACTH), con valoración de las concentraciones plasmáticas de 17-hidroxiprogesterona antes y tras 30 minutos de la inyección. La determinación de los antígenos de Clase I y Clase II del Sistema HLA, se realizó mediante la técnica de Microlinfocitotoxicidad. El análisis genético consistió en la detección de grandes reordenamientos mediante la técnica de "Southern blot", y la detección de nueve de las mutaciones puntuales más comunes mediante el diseño de una nueva metodología en la que se emplean dos estrategias según la mutación a detectar: ganancia o pérdida de al menos una diana de restricción en el producto de PCR amplificado a partir de DNA genómico o creación de una diana de restricción por amplificación (ACRS-PCR) y posterior digestión con una enzima de restricción apropiada.El test de ACTH se confirma como fiable, ya que no se observaron falsos positivos ni falsos negativos en los valores obtenidos de 17-hidroxiprogesterona post estimulación. El nomograma de 17-hidroxiprogesterona proporciona un patrón hormonal que facilita, en la mayoría de los casos, el diagnóstico de las distintas formas de presentación clínica del déficit. No se observó la presencia del antígeno HLA-Bw47 en ninguno de los grupos analizados. Las formas no clásicas se encuentran significativamente asociadas al haplotipo HLA-B14-DR1, mientras que las formas clásicas al antígeno HLA-B5(w51).La metodología utilizada para el análisis molecular del gen ha permitido detectar la mutación causal en el 89,62% de los cromosomas afectos, evaluados globalmente, consolidándose ésta como altamente efectiva en el diagnóstico de esta patología. Las mutaciones más frecuentes observadas han sido: Intrón 2 (50%) en SW; Intrón 2 (50%) y I172N (16,6%) en SV y V281L (61,5%) en NC. El análisis de los pedigrees ha permitido diagnosticar veintiséis formas crípticas y revelar en dos casos la presencia de mutaciones originadas de novo. La concordancia hallada entre el genotipo y el fenotipo ha sido del 97,2%, de ahí, que las predicciones desde el genotipo han de ser hechas todavía con gran cautela.

La malaltia de Gaucher és una malaltia d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica Glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C.Fins al moment s'han descrit més de 200 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP.Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la Glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids.Algunes de les mutacions descrites en el gen GBA són al·lels complexos, que són portadors de diferents mutacions, produïts per processos de recombinació entre el gen i el seu pseudogèn.En aquest treball presentem el cas d'un individu que va ser dignosticat erròneament com a homozigot per a la mutació N370S, quan realment era portador d'un al·lel complex no descrit fins al moment.A més, hem volgut caracteritzar millor l'al·lel mutant RecNciI i per a això hem analitzat aquesta mutació en població espanyola i argentina, ja que és molt freqüent en aquesta última població, utilitzant diferents mètodes. D'aquesta manera també hem pogut trobar nous individus que tenien al·lels Rec i no s'havien pogut detectar, i entendre millor els mecanismes mitjançant els quals es produeixen aquests al·lels.També s'han analitzat mostres de pacients de la malaltia de Gaucher que eren candidats de ser portadors de mutacions en el gen PSAP. Aquest anàlisi ens ha permès decriure una mutació en la Saposina D que juntament amb una altra mutació ja descrita prèviament és la causant de la patologia.Fins al moment s'han desenvolupat diferents tècniques de teràpia gènica, però en general tenen moltes limitacions. Per una banda els vectors utilitzats poden generar reaccions immunes (adenovirus) o integracions a l'atzar en el genoma (retrovirus). Per altra banda, el gen forani deixa d'expressar-se després d'un cert temps. Per tot això és lògic que s'hagin desenvolupat noves estratègies per a la teràpia de malalties genètiques. Una d'aquestes aproximacions és l'utilització de quimeraplasts, molècules quimèriques de RNA-DNA capaces de promoure la correcció d'una mutació mitjançant els mecanismes de reparació de la cèl·lula. En la malaltia de Gaucher una de les mutacions més freqüents és la L444P. Hem intentat corregir aquesta mutació utilitzant quimeraplasts en fibroblasts d'un pacient de la malaltia de Gaucher homozigot per la mutació L444P.Els resultats obtinguts mostren una molt baixa, o nul·la, eficiència de correcció. Recentment s'han publicat diferents treballs on descriuen també resultats negatius per altres malalties utilitzant aquesta tècnica, deixant en entredit l'eficàcia d'aquesta tècnica.Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. La teràpia de reducció de substrat es basa en la inhibició parcial de la glucosilceramida sintasa (GCS), enzim encarregat de sintetitzar glucosilceramida a partir de ceramida i glucosa. D'aquesta manera s'evita l'acúmul de glucosilceramida que provoca la malaltia.En els darrers anys, els siRNAs (small interference RNAs) s'han utilitzat en diferents tipus d'experiments per inhibir l'expressió gènica. L'objectiu d'aquest treball és la inhibició de la expressió del gen de la GCS mitjançant siRNAs com una possible alternativa terapèutica per a la malaltia de Gaucher.Vam dissenyar quatre siRNAs per a inhibir el gen GCS humà i els vam transfectar en cèl·lules HeLa. Amb dos d'aquests siRNAs vam aconseguir reduir la expressió de GCS a nivell de RNA. També vam comprovar la reducció tant a nivell d'activitat enzimàtica com de formació de glucosilceramida.Després d'aconseguir silenciar el gen de la GCS utilitzant siRNAs, vam decidir probar-ho utilitzant shRNAs (short-hairpin RNAs). Els shRNAs són siRNAs generats per un plasmidi on se li ha insertat la seqüència que s'ha de transcriure per formar aquest shRNA. Vam generar dos shRNAs diferents aconseguint inhibir també l'expressió de GCS. / "Characterization of mutations causing Gaucher disease. Gene therapy approach."The glycosphingolipid (GSL) lysosomal storage disorders are a group of inherited genetic diseases caused by mutations in the genes coding for enzymes involved in GSL catabolism. These diseases are characterised by the accumulation of the GSL substrates within lysosomes of cells, which results in cellular dysfunction and damage. The most common of the glycosphingolipidoses is Gaucher disease (GD), an autosomal recessive trait due to the accumulation of glucosylceramide caused by deficient activity of the enzyme glucocerebrosidase (EC 3.2.1.45).The glucocerebrosidase gene, lies on a gene-rich region which includes the metaxin gene and the glucocerebrosidase and metaxin highly homologous pseudogenes. The presence of these repetitions leads to DNA rearrangements. Some of these rearrangements give rise to complex alleles that cause the disease, of which RecNciI is the most prevalent. We analysed Gaucher disease patients from Argentina and Spain bearing this allele, and patients who carried mutation L444P, one of the three changes present in the RecNciI allele. Only two patients bearing mutations in the PSAP gene, and not in the GBA gene, have been reported. In both cases, one mutant allele remained unidentified. We report here the identification of the second mutation in one of these patients, being the first complete genotype described so far in a SAP-C deficient-GD patient. This mutation, p.Q430X, is the first one reported in the saposin D domain and probably produces a null allele by nonsense mediated mRNA decay.A number of gene therapy approaches have been developed for the treatment of genetic diseases, most of them based on the use of viral vectors. However, in general they have not been successful and some complications. To overcome these limitations, novel strategies have recently emerged. One of them is chimeraplasty, based on the correction of single-base mutations by mismatch repair mechanisms using chimeric RNA/DNA oligonucleotides, named chimeraplasts. Mutation L444P is one of the most common mutations in many populations. We have attempted to correct mutation L444P in fibroblasts from a Gaucher disease patient using a chimeraplast approach. Our results show a very low efficiency (if any) of chimeraplast correction. In the last few years, small interference RNAs (siRNAs) have been used in a number of different experimental settings to silence gene expression. Enzyme replacement and substrate deprivation therapies are the current approaches to treat Gaucher disease. We present here a new approach based on the inhibition of the GCS gene using siRNAs as a possible future therapeutic strategy for Gaucher disease. A clear reduction in GCS RNA levels, enzyme activity and glucosylceramide synthesis was achieved. Similar results were obtained when using plasmids expressing shRNAs. Also, siRNAs to inhibit the mouse homolog Ugcg gene were successfully assayed.

Esta tesis es una contribución al conocimiento del síndrome de Maroteux-Lamy en el terreno de la genética molecular. El síndrome de Maroteaux-Lamy o mucopolisacaridosis de tipo VI (MPS VI) es una grave enfermedad hereditaria muy poco frecuente en humanos, provocada por la deficiencia de un único gen, que codifica la hidrolasa lisosómica N-acetilgalactosamino-4-sulfatasa o arilsulfatasa B (ARSB). La primera publicación incluída en la tesis engloba los resultados del análisis de las mutaciones encontradas en el gen ARSB de pacientes españoles y argentinos con MPS VI. Se han identificado todos los alelos responsables de la enfermedad, de los cuales 9 no habían sido publicados anteriormente. Mediante estudios de RT-PCR se han obtenido evidencias de que algunas de las mutaciones podían provocar la destrucción del correspondiente transcrito mutado mediante el mecanismo de nonsense-mediated RNA decay . El estudio también ofrece datos relativos a la clínica de los pacientes analizados, incluyendo la edad de diagnóstico, los principales síntomas fenotípicos y la concentración de glicosaminoglicanos totales excretados en orina, que constituyen datos importantes a la hora de intentar establecer relaciones genotipo-fenotipo. Cumpliendo con otro de los objetivos de la tesis, se realizó el análisis haplotípico de cuatro mutaciones comunes identificadas en pacientes españoles y argentinos con MPS VI y se apuntó a un posible origen único para dichos cambios. La segunda publicación presenta los estudios de expresión y caracterización bioquímica de la mayor parte de las proteínas mutadas que no habían sido descritas con anterioridad por otros autores. Por primera vez en la bibliografía, se explicitó que el cDNA mutado se había expresado en el mismo contexto haplotípico que en el paciente en relación con los dos cambios exónicos presentes en las bases de datos de SNPs, p.V358M y p.S384N. Ambas variantes se expresaron también de forma individual, siendo de especial interés los resultados obtenidos para el cambio p.S384N, que tradicionalmente se ha considerado como mutación patogénica sin que se hayan realizado estudios de expresión. El análisis bioquímico de la actividad enzimática in vitro de las proteínas mutadas se completó mediante análisis de western blot. También se realizaron estudios de inmunofluorescencia indirecta para valorar el grado de localización de la proteína ARSB mutada en los lisosomas de fibroblastos de pacientes. Finalmente se realizaron estudios a nivel de RNA para las mutaciones que introducen codones de parada prematuros en la secuencia codificante (sin sentido, de splicing). Mediante el tratamiento de cultivos de fibroblastos de pacientes con el inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida, se puso de manifiesto que el mecanismo de nonsense-mediated RNA decay era responsable de la degradación de los transcritos portadores de cuatro de las mutaciones. El trabajo que ocupa el tercer artículo es una aproximación a una forma de terapia complementaria a la de sustitución enzimática ya establecida para los pacientes de MPS VI, que se podría aplicar a los pacientes portadores de mutaciones sin sentido. Se trata del primer intento en esta enfermedad de intentar suprimir los codones de terminación prematura mediante el uso de antibióticos aminoglicósidos. Los ensayos se realizaron tanto en células transfectadas como en una línea de fibroblastos humanos. Las mutaciones escogidas permitieron ensayar la influencia del contexto nucleotídico del codón de parada en la determinación de la eficacia de la supresión de terminación. Las células se incubaron en presencia de gentamicina y se compararon los niveles de mRNA y de actividad enzimática con los obtenidos en células sin tratar. Los resultados evidenciaron que, en líneas generales, el tratamiento con gentamicina para la supresión de codones sin sentido incrementa, aunque poco, la capacidad catalítica de la ARSB, y que la eficacia del proceso parece depender del contexto nucleotídico. / Maroteaux-Lamy syndrome or mucopolysaccharidosis type VI (MPS VI) is a rare lysosomal, autosomal recessive storage disorder caused by a deficiency of the lysosomal enzyme N-acetylgalactosamine 4-sulfatase or arylsulfatase B (ARSB). The first aim of the thesis was to analyze the spectrum of mutations responsible for the disorder in Spanish and Argentinian MPS VI patients. We identified all the ARSB mutant alleles, nine of them novel. Clinical data of Spanish and Argentinian patients was also provided. Haplotype analysis indicated a common origin for most of the mutations found more than once. It was very difficult to stablish genotype-phenotype correlations. RT-PCR studies showed that some of these alleles could be responsible of the degradation of the ARSB mRNA transcripts by the mechanism of nonsense-mediated RNA decay.In the second study, functional characterization of seven missense mutations and polyporphisms found in the ARSB gene was presented. All the ARSB mutations studied had a significant effect on enzyme activity. Mutations were expressed on COS-7 cells in their original haplotype context with respect two non-synonymous SNPs, p.V358M and p.S384N. Our results showed that change p.S384N, formerly described as a pathogenic mutation, should be considered a functional polymorphism. Western blot analyses showed that the expressed mutations significantly reduced the amount of mature protein. Sub-cellular localization studies of ARSB proteins in fibroblasts from MPS VI patients were performed. RNA analysis confirmed that nonsense-mediated RNA decay had taken place for all mutant alleles which were candidates for causing RNA degradation by this mechanism.Finally, we reported the preliminary in vitro assays for restoring some amount of full-length and active ARSB protein, by means of gentamicin-induced translational read-through of premature stop codon mutations on different termination contexts. Gentamicin treatment on transfected COS-7 cells and fibroblasts from a MPS VI patient showed a slight recovery of ARSB activity and cDNA levels.