La malaltia de Gaucher és una malaltia d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica Glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C.Fins al moment s'han descrit més de 200 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP.Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la Glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids.Algunes de les mutacions descrites en el gen GBA són al·lels complexos, que són portadors de diferents mutacions, produïts per processos de recombinació entre el gen i el seu pseudogèn.En aquest treball presentem el cas d'un individu que va ser dignosticat erròneament com a homozigot per a la mutació N370S, quan realment era portador d'un al·lel complex no descrit fins al moment.A més, hem volgut caracteritzar millor l'al·lel mutant RecNciI i per a això hem analitzat aquesta mutació en població espanyola i argentina, ja que és molt freqüent en aquesta última població, utilitzant diferents mètodes. D'aquesta manera també hem pogut trobar nous individus que tenien al·lels Rec i no s'havien pogut detectar, i entendre millor els mecanismes mitjançant els quals es produeixen aquests al·lels.També s'han analitzat mostres de pacients de la malaltia de Gaucher que eren candidats de ser portadors de mutacions en el gen PSAP. Aquest anàlisi ens ha permès decriure una mutació en la Saposina D que juntament amb una altra mutació ja descrita prèviament és la causant de la patologia.Fins al moment s'han desenvolupat diferents tècniques de teràpia gènica, però en general tenen moltes limitacions. Per una banda els vectors utilitzats poden generar reaccions immunes (adenovirus) o integracions a l'atzar en el genoma (retrovirus). Per altra banda, el gen forani deixa d'expressar-se després d'un cert temps. Per tot això és lògic que s'hagin desenvolupat noves estratègies per a la teràpia de malalties genètiques. Una d'aquestes aproximacions és l'utilització de quimeraplasts, molècules quimèriques de RNA-DNA capaces de promoure la correcció d'una mutació mitjançant els mecanismes de reparació de la cèl·lula. En la malaltia de Gaucher una de les mutacions més freqüents és la L444P. Hem intentat corregir aquesta mutació utilitzant quimeraplasts en fibroblasts d'un pacient de la malaltia de Gaucher homozigot per la mutació L444P.Els resultats obtinguts mostren una molt baixa, o nul·la, eficiència de correcció. Recentment s'han publicat diferents treballs on descriuen també resultats negatius per altres malalties utilitzant aquesta tècnica, deixant en entredit l'eficàcia d'aquesta tècnica.Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. La teràpia de reducció de substrat es basa en la inhibició parcial de la glucosilceramida sintasa (GCS), enzim encarregat de sintetitzar glucosilceramida a partir de ceramida i glucosa. D'aquesta manera s'evita l'acúmul de glucosilceramida que provoca la malaltia.En els darrers anys, els siRNAs (small interference RNAs) s'han utilitzat en diferents tipus d'experiments per inhibir l'expressió gènica. L'objectiu d'aquest treball és la inhibició de la expressió del gen de la GCS mitjançant siRNAs com una possible alternativa terapèutica per a la malaltia de Gaucher.Vam dissenyar quatre siRNAs per a inhibir el gen GCS humà i els vam transfectar en cèl·lules HeLa. Amb dos d'aquests siRNAs vam aconseguir reduir la expressió de GCS a nivell de RNA. També vam comprovar la reducció tant a nivell d'activitat enzimàtica com de formació de glucosilceramida.Després d'aconseguir silenciar el gen de la GCS utilitzant siRNAs, vam decidir probar-ho utilitzant shRNAs (short-hairpin RNAs). Els shRNAs són siRNAs generats per un plasmidi on se li ha insertat la seqüència que s'ha de transcriure per formar aquest shRNA. Vam generar dos shRNAs diferents aconseguint inhibir també l'expressió de GCS. / "Characterization of mutations causing Gaucher disease. Gene therapy approach."The glycosphingolipid (GSL) lysosomal storage disorders are a group of inherited genetic diseases caused by mutations in the genes coding for enzymes involved in GSL catabolism. These diseases are characterised by the accumulation of the GSL substrates within lysosomes of cells, which results in cellular dysfunction and damage. The most common of the glycosphingolipidoses is Gaucher disease (GD), an autosomal recessive trait due to the accumulation of glucosylceramide caused by deficient activity of the enzyme glucocerebrosidase (EC 3.2.1.45).The glucocerebrosidase gene, lies on a gene-rich region which includes the metaxin gene and the glucocerebrosidase and metaxin highly homologous pseudogenes. The presence of these repetitions leads to DNA rearrangements. Some of these rearrangements give rise to complex alleles that cause the disease, of which RecNciI is the most prevalent. We analysed Gaucher disease patients from Argentina and Spain bearing this allele, and patients who carried mutation L444P, one of the three changes present in the RecNciI allele. Only two patients bearing mutations in the PSAP gene, and not in the GBA gene, have been reported. In both cases, one mutant allele remained unidentified. We report here the identification of the second mutation in one of these patients, being the first complete genotype described so far in a SAP-C deficient-GD patient. This mutation, p.Q430X, is the first one reported in the saposin D domain and probably produces a null allele by nonsense mediated mRNA decay.A number of gene therapy approaches have been developed for the treatment of genetic diseases, most of them based on the use of viral vectors. However, in general they have not been successful and some complications. To overcome these limitations, novel strategies have recently emerged. One of them is chimeraplasty, based on the correction of single-base mutations by mismatch repair mechanisms using chimeric RNA/DNA oligonucleotides, named chimeraplasts. Mutation L444P is one of the most common mutations in many populations. We have attempted to correct mutation L444P in fibroblasts from a Gaucher disease patient using a chimeraplast approach. Our results show a very low efficiency (if any) of chimeraplast correction. In the last few years, small interference RNAs (siRNAs) have been used in a number of different experimental settings to silence gene expression. Enzyme replacement and substrate deprivation therapies are the current approaches to treat Gaucher disease. We present here a new approach based on the inhibition of the GCS gene using siRNAs as a possible future therapeutic strategy for Gaucher disease. A clear reduction in GCS RNA levels, enzyme activity and glucosylceramide synthesis was achieved. Similar results were obtained when using plasmids expressing shRNAs. Also, siRNAs to inhibit the mouse homolog Ugcg gene were successfully assayed.

Aquest treball és una contribució als estudis de diversitat del genoma humà i pretén estudiar la variació genètica existent a nivell mundial en dos gens, causants de malaltia, el gen CFTR i el gen GBA, en cromosomes d'individus sans. Mutacions en aquests gens produeixen la fibrosi quística i la malaltia de Gaucher respectivament. La fibrosi quística és la malaltia autosòmica recessiva més comuna en poblacions europees. La malaltia de Gaucher és la malaltia lisosòmica d'acumulació lipídica més freqüent. L'estudi analitza la variació genètica en diferents polimorfismes d'ambdós gens; reconstrueix els haplotips i analitza la seva distribució geogràfica; i analitza l'extensió i distribució geogràfica del desequilibri de lligament entre loci. Pel gen GBA, hem ampliat la regió, abastant fins al gen PKLR (que codifica per a la piruvat quinasa). A més a més, pel cas de CFTR, pot ajudar a entendre l'origen de les mutacions més freqüents causants de fibrosi quística. / This work is a contribution to human genome diversity studies and it aims to study the world-wide genetic variation that exists in two disease genes, CFTR and GBA gene, in healthy chromosomes. Mutations in these genes are known to cause cystic fibrosis and Gaucher disease respectively. Cystic fibrosis is the most common severe autosomal recessive disease in patients of European descent. Gaucher disease is the most frequent lysosomal storage disorder. The study analyzes the genetic variation in CFTR and GBA polymorphisms; estimates haplotype frequencies and describes their geographic distribution; and measures linkage disequilibrium between loci. For GBA gene, we have extended the analysis covering PKLR gene (that encodes for a pyruvate kinase). Moreover, for CFTR gene, we have tried to understand the origin of the most common cystic fibrosis causing mutations.