El gen K-ras, és molt important clínicament ja que es troba mutat en un 40% dels casos de carcinomes colorectals i en un 90% dels casos de carcinomes de pàncreas, que constitueixen la segona i quarta causa de mort per càncer en països desenvolupats i juga un paper important en el desenvolupament dels sarcomes. Degut a la importància clínica del gen K-ras, un model que millori el seu coneixement en l'àmbit molecular, ajudarà a predir el comportament biològic del tumor abans de decidir el tractament més adequat per un pacient concret. Aquests coneixements, poden portar a una millora substancial des del punt de vista terapèutic. Les mutacions activants de l'oncogen K-ras, s'han localitzat al codó 12 o 13 del mateix. Prèviament, s'ha associat la presència de mutacions al codó 13 amb un fenotip tumoral menys agressiu que quan aquestes es localitzen al codó 12. Concretament, la mutació al codó 13 s'associa amb menor capacitat invasiva local i metastàsica. L'objectiu d'aquesta tesi es trobar una explicació molecular al diferent comportament clínic descrit amb anterioritat en tumors humans segons si la mutació activant es troba al codó 12 o al codó 13 del gen K-ras. També es preten trobar una explicació molecular a la transformació produïda pel gen normal sobrexpressat, que prèviament s'havia descrit que en determinats models era tumorogènic. Aquest estudi s'ha realitzat en un model in vitro (fibroblasts NIH3T3 de ratolí), transfectats establement amb el gen K-ras humà amb les distintes mutacions i en un modelo in vivo, injectant subcutàniament els transfectants en ratolins atímics i estudiant els sarcomes generats.Les conclusions d'aquest treball són que en el nostre model d'estudi, la mutació al codó 12 de K-ras confereix un fenotip més transformant que la mutació al codó 13 o que la sobreexpresió del gen normal. La causa principal d'aquestes diferències en transformació és la major activació de la via de supervivència cel·lular PI3K/AKT als transfectants amb mutació al codó 12 que els confereix major resistència a l'apoptosi, tant en el model in vitro com in vivo. Per últim, la posició del codó mutat en K-ras confereix especifitat histològica als tumors generats que de manera coherent amb el seu origen mesenquimàtic (NIH3T3) són sarcomes. Els tumors generats amb mutació al codó 12 del gen K-ras constitueixen un possible model de fibrosarcoma i els generats amb mutació al codó 13 del gen K-ras constitueixen un possible model d'histioctioma fibrós maligne; dos tipus de sarcomes humans. / K-ras gene is the most frequently mutated ras gene in human tumors. It's mutated in 40% of cases of colorectal carcinomas and 90% of pancreatic adenocarcinomas. These are the second and fourth causes of cancer death in developed countries. K-ras play also an important role in development of sarcomas. A model that improve knowledge of K-ras in a molecular way will help to decide the right treatment to a specific patient.K-ras became oncogenic by single point mutations at codon 12 or 13. Several lines of evidence suggest that the malignant potencial of tumor cells may be influenced not only by the presence or absence of K-ras mutations, but by its molecular nature. Codon 13 mutations have been associated with less aggressive tumoral phenotype than codon 12 mutations in K-ras gene. Codon 13 mutation is associated with less invasive and metastasic capacity.In this thesis, is tested whether K-ras codon 12 mutation would confer upon the cell a more oncogenic phenotype than a K-ras codon 13 mutation and try to find a molecular explanation for these differences. It is also tested the transformation capacity of the K-ras proto-oncogene and molecular explanation of this effect.To this end, NIH3T3 cells (mouse fibroblasts) are transfected with a plasmid containing human K-ras with point mutations at codon 12 or at codon 13 or containing the K-ras proto-oncogene; selected stable transfectants; and evaluated the possible changes in different functions contributing to transformation. It's tested also in vivo model. We subcutaneously injected transfectants in nude mice and generated tumors were compared morphocally, functionally, and molecularly.The conclusion of this work is that K-ras with point mutations at codon 12 confer a more aggressive transforming phenotype, increasing the thresfold of apoptotic induction. In contrast, mutations at codon 13 or the overexpression of K-ras proto-oncogene reduce this thresfold. Increased activation of cellular survive pathway PI3K/AKT confer to K-ras with point mutations at codon 12 resistance to apoptosis, in vitro and in vivo model.And last; the position of mutated codon in K-ras gene confer histologic specificity to generated tumors.Tumors derived from transfectants with K-ras point mutations at codon 12 constitute a possible animal model of human fibrosarcoma. Tumors derived from transfectants with K-ras point mutations at codon 13 constitute a possible animal model of human malignant fibrous histiocytoma.

En este trabajo de tesis hemos identificado la presencia de marcadores polimórficos dentro del gen F8 que han permitido identificar el alelo portador de la mutación en el 91% de las mujeres portadoras de hemofilia A en estudio en nuestro laboratorio. Además, hemos descrito 31 mutaciones nuevas responsables de la HA, de las cuales, 20 fueron mutaciones missense. El análisis estructural de dichas mutaciones proporciona un mejor entendimiento de la enfermedad, además ha permitido predecir el impacto que dichos cambios ocasionan en la estructura de la proteína, así como las consecuencias funcionales de las mutaciones en dicho gen, sugiriendo nuevas áreas del FVIIIa involucradas en la unión a otras macromoléculas, tales como el FIXa y el sustrato del complejo Xasa, el FXa. Por otro lado, demostramos que el uso de nuevas técnicas de cuantificación de dosis génica como la PCR a tiempo real y el MLPA junto con el estudio indirecto por marcadores son una buena herramienta para la detección de mutaciones como las deleciones y duplicaciones de uno o más exones del gen F8, en varones y mujeres portadoras de HA que con la PCR cualitativa no era posible detectar. Y por último, proponemos un algoritmo de trabajo práctico de análisis para optimizar el diagnóstico molecular de pacientes con HA y las portadoras de su familia.

La Leucoencefalopatía Megalencefálica con Quistes Subcorticales (MLC) es un tipo raro de leucodistrofia vacuolizante, que presenta como principales características clínicas macrocefalia, deterioro de las funciones motoras, epilepsia y retraso mental medio. Sin embargo, el diagnóstico de MLC se confirma mediante imágenes de resonancia magnética, donde el encéfalo se presenta atrofiado e hinchado, muestra una sustancia blanca anormalmente difusa y hay presencia de quistes subcorticales. Desde el punto de vista fisiopatológico, una biopsia obtenida de un paciente de MLC muestra la presencia de numerosas vacuolas situadas en las láminas más externas de la mielina. Se ha encontrado un primer gen responsable de la enfermedad en el 75% de los pacientes afectados, denominado MLC1. Se han descrito alrededor de 60 mutaciones, aunque existen pacientes que manifiestan las características clínicas de la enfermedad pero no presentan mutaciones en MLC1 ni presentan ligamiento con su locus, sugiriendo que existe al menos otro gen involucrado en la enfermedad. En el 25% de pacientes restantes, la enfermedad se manifiesta de dos maneras diferentes: en un caso, los enfermos presentan las mismas características clínicas que los pacientes con mutaciones en MLC1; y en el otro, presentan síntomas transitorios y los pacientes mejoran, llegando incluso a que la enfermedad remitiera. El gen MLC1 codifica para una proteína transmembrana que lleva el mismo nombre. Su función es todavía desconocida. Aunque muestra un bajo grado de homología con el canal de potasio Kv1.1 no se ha podido detectar actividad de canal iónico en diferentes sistemas heterólogos. No obstante, dicha homología, su confinamiento en la membrana plasmática y el fenotipo característico vacuolizante de los pacientes sugieren que la proteína podría estar mediando la translocación de iones a través de la superficie celular. El total desconocimiento del rol preciso de la proteína MLC1 ha imposibilitado el entendimiento del mecanismo patofisiológico de la enfermedad, y por ello, no se ha podido desarrollar ningún tratamiento efectivo para los pacientes afectados. Es por ello que nuestro grupo quiso apostar por estrategias innovadoras (combinación de bioquímica y genética) para poder encontrar otros genes responsables de la enfermedad. Usando técnicas de purificación por afinidad combinada con métodos de proteómica cuantitativa encontramos a GlialCAM como una proteína que estaba asociada con MLC1. Es por eso que decidimos estudiar (en colaboración) si los pacientes que no tenían mutaciones en MLC1 podían presentar mutaciones en GLIALCAM. Tras el análisis de 40 de estos pacientes encontramos que cuando los enfermos tenían las características clínicas típicas de MLC presentaban dos mutaciones en GLIALCAM (herencia recesiva); mientras que en el caso de aquellos que mejoraban a lo largo del tiempo, éstos solo presentaban una mutación (herencia dominante), demostrando que GLIALCAM es el segundo gen de MLC. En este estudio también se ha podido determinar que mutaciones dominantes en GLIALCAM podían también causar otras enfermedades como la macrocefalia familiar benigna y la macrocefalia con retraso mental, con o sin autismo. Estudios bioquímicos posteriores han permitido avanzar en el entendimiento de la relación que existe entre MLC1 y GlialCAM. Así se ha demostrado que GlialCAM actúa como una molécula escolta, necesaria para localizar específicamente a MLC1 en uniones celulares. De esta forma pudimos descubrir que las mutaciones en GLIALCAM provocaban un defecto en el tráfico de la proteína debido a una deficiente oligomerización. Como consecuencia, estas mutaciones provocaban la deslocalización de los complejos de MLC1-GlialCAM en las uniones astrocitarias. De forma interesante, GlialCAM permite estabilizar la proteína MLC1, sugiriendo nuevas aproximaciones terapéuticas para los pacientes afectos con MLC. Tras el descubrimiento de GlialCAM como segundo gen de MLC gracias a la aproximación proteómica, y tras comprobar que no todo GlialCAM estaba asociado a MLC1, nos planteamos volver a realizar estudios de proteómica para intentar encontrar posibles proteínas que pudiesen estar interaccionando con GlialCAM. De esta manera encontramos que el canal de cloruro ClC-2, estaba asociado con GlialCAM, y pudimos comprobar que GlialCAM también actuaba como molécula escolta para localizar específicamente a ClC-2 en las uniones entre células. Además, también era capaz de modificar sus propiedades de canal, así como aumentar su función, demostrándose interacción directa entre ambas proteínas. Igualmente que para el caso de MLC1, las mutaciones encontradas en GLIALCAM fallaban en la capacidad de concentrar a ClC-2 en las uniones astrocitarias. Por tanto, la función de GlialCAM podría ser necesaria para agrupar tanto a MLC1 como a ClC-2 en tales uniones, particularmente en los pies terminales astrocitarios, donde podrían estar llevando a cabo su función. ClC-2 podría ser necesario para desarrollar un flujo de Cl- transcelular o para compensar gradientes electroquímicos iónicos que pueden estar ocurriendo en dichas uniones durante cambios en la osmolaridad. El descubrimiento de GlialCAM como una subunidad auxiliar de ClC-2 incrementa la compleja regulación de este canal y proporciona nuevas ideas acerca del papel que ClC-2 puede estar desempeñando en las células gliales así como se sugiere que pueda estar involucrado en la fisiopatología de MLC. / Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a leukodystrophy characterized by early-onset macrocephaly and delayed-onset neurological deterioration. Recessive MLC1 mutations are observed in 75% of patients with MLC. Genetic-linkage studies failed to identify another gene. We have showed that some patients without MLC1 mutations display the classical phenotype; others improve or become normal but retain macrocephaly. To find another MLC-related gene, we used quantitative proteomic analysis of affinity-purified MLC1 as an alternative approach and found that GlialCAM, an IgG-like cell adhesion molecule, is a direct MLC1-binding partner. Analysis of 40 MLC patients without MLC1 mutations revealed multiple different GLIALCAM mutations. Patients with the classical phenotype had two mutations, and patients with the improving phenotype had one mutation. In addition, patients with dominant GLIALCAM mutations, could also had macrocephaly and mental retardation with or without autism. Therefore, we found that GLIALCAM is the second gene found to be mutated in MLC. Furthermore, we demonstrated that GlialCAM functions as an MLC1 beta-subunit, needed for proper localization of MLC1 in cell-cell junctions. We also demonstrated that MLC1 and GlialCAM form homo- and hetero-complexes and that MLC-causing mutations in GLIALCAM mainly reduce the formation of GlialCAM homo-complexes, leading to a defect in the trafficking of GlialCAM alone to cell junctions. GLIALCAM mutations also affect the trafficking of its associated molecule MLC1, explaining why GLIALCAM and MLC1 mutations lead to the same disease: MLC. In this thesis, we also identify GlialCAM as a chloride channel ClC-2 binding partner. GlialCAM and ClC-2 colocalize in Bergmann glia, in astrocyteastrocyte junctions at astrocytic end-feet around blood vessels, and in myelinated fiber tracts. GlialCAM targets ClC-2 to cell junctions, increases ClC- 2 mediated currents, and changes its functional properties. Disease-causing GLIALCAM mutations abolish the targeting of the channel to cell junctions. Hence, we describes the first auxiliary subunit of ClC-2 and suggests that ClC-2 may play a role in the pathology of MLC disease.

El curso clínico de la trombocitemia esencial (TE) se caracteriza por un elevado riesgo de aparición de complicaciones trombóticas, las cuales constituyen la principal causa de muerte en estos pacientes. Si bien la causa fundamental de la trombosis en esta enfermedad parece ser el aumento del número de plaquetas y sus alteraciones bioquímicas y funcionales, no existe una correlación clara entre estos factores y el desarrollo de trombosis. El objetivo de la presente tesis fue conocer el papel de la activación plaquetaria y leucocitaria en la trombosis de los pacientes con TE. Para ello, se determinó mediante citofluorometría el estado de activación plaquetaria y leucocitaria en 53 pacientes con TE (26 con historia de trombosis previa) y en otros tantos sujetos sanos de igual edad y sexo. Las determinaciones incluyeron la expresión de P-selectina en plaquetas (en condiciones basales y después del estímulo con ADP, trombina, ácido araquidónico [AA] o colágeno), los complejos plaqueta-neutrófilo y plaqueta-monocito, el CD11b en neutrófilos y monocitos y la expresión de factor tisular en los monocitos (FTm). Además, se investigaron el porcentaje de plaquetas reticuladas (PR), la resistencia adquirida a la proteína C activada (RAPCA), la expresión plaquetaria de factor tisular (FT) y las concentraciones plasmáticas de FT, factores de la coagulación, P-selectina soluble (sP-selectina), CD40 ligando soluble (sCD40L), antígeno del factor de von Willebrand (VWF:Ag), trombomodulina soluble (sTM), dímero D y fragmento 1+2 de la protrombina. Estos parámetros se correlacionaron también la presencia de la mutación V617F de JAK2 o su carga mutacional.En comparación con los controles, los pacientes con TE tenían una mayor expresión de P-selectina basal e inducida por trombina o AA, así como unos valores significativamente más elevados de complejos plaqueta-neutrófilo y plaqueta-monocito, expresión de CD11b en neutrófilos y expresión basal de FTm. La P-selectina basal e inducida por AA, el CD11b monocitario, la expresión de FTm inducida por lipopolisacárido, el porcentaje de PR, RAPCA y las concentraciones plasmáticas del factor V, factor VIII, VWF:Ag, sP-selectina y sCD40L se hallaron significativamente más elevadas en pacientes con historia de trombosis que en aquellos sin trombosis. En el estudio multivariado, el porcentaje de PR, la concentración de factor V y la presencia de RAPCA se asociaron independientemente con un aumento del riesgo de trombosis. Los pacientes con la mutación V617F de JAK2 tuvieron unos valores más elevados de P-selectina basal e inducida por AA que los pacientes sin esta condición. Finalmente, se objetivó un efecto dosis del porcentaje mutacional (>/- 12%), asociándose éste a una mayor concentración de FT, sP-selectina, sCD40L, FVW:Ag y menor de proteína S (PS).Estos resultados sugieren que la activación plaquetaria y monocitaria, así como la renovación plaquetaria, factor V y RAPCA pueden desempeñar un papel importante en la patogenia de la trombosis de los pacientes con TE, así como la posibilidad de la detección de pacientes con un mayor riesgo trombótico. La asociación entre la carga alélica de V617F con la disminución de PS o incremento de FT y de los marcadores solubles de activación plaquetaria y endotelial sugiere que dicha mutación podría promover un estado pretrombótico en la TE. EXTRACTO. Si bien la causa fundamental de la trombosis en la trombocitemia esencial (TE) parece ser el aumento del número de plaquetas y sus alteraciones bioquímicas y funcionales, no existe una correlación clara entre estos factores y el desarrollo de trombosis. Los resultados de la presente tesis doctoral sugieren que la activación plaquetaria y monocitaria, así como la renovación plaquetaria, factor V y la resistencia adquirida a la proteína C activada pueden desempeñar un papel importante en la patogenia de la trombosis de los pacientes con TE, así como la posibilidad de la detección de pacientes con un mayor riesgo trombótico. La asociación entre la carga alélica de V617F con la disminución de proteína S libre o incremento de factor tisular y de los marcadores solubles de activación plaquetaria y endotelial sugiere que dicha mutación podría promover un estado pretrombótico en la TE. PALABRAS CLAVE. Trombocitemia esencial, trombosis, activación plaquetaria, activación leucocitaria, coagulación, mutación V617F de JAK2. / "ROLE OF THE PLATELET AND LEUKOCYTE ACTIVATION IN THE PATHOGENESIS OF THE THROMBOSIS IN ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA", by EDUARDO ARELLANO RODRIGOTEXT:The mechanisms accounting for the increased risk of thrombosis in patients with essential thrombocythemia (ET) are not well known. The aim of the present thesis was to ascertain the role of platelet and leukocyte activation in the thrombosis of ET and its relationship with the JAK2 mutation.In 53 ET patients (26 with a history of thrombosis), platelet P-selectin (measured both at baseline and after stimulation with ADP, thrombin, arachidonic acid (AA), and collagen) and leukocyte CD11b expression, reticulated platelets (RP) percentage, platelet and monocyte tissue factor (mTF) expression, acquired activated protein C resistance (aAPCR), and plasma levels of tissue factor (TF), coagulation factors, soluble P-selectin (sP-selectin), soluble CD40 ligand (sCD40L), von Willebrand factor antigen (VWF:Ag), thrombomodulin, D-dimer and prothrombin fragment 1+2 were compared with those in matched healthy individuals and correlated with thrombosis occurrence and JAK2 mutational load. As compared with controls, ET patients had significantly higher values of baseline P-selectin and thrombin- and AA-induced platelet P-selectin expression, as well as higher platelet-neutrophil and platelet-monocyte complexes, neutrophil CD11b expression and baseline mTF expression. ET patients with thrombosis had significantly higher values for platelet P-selectin, monocyte CD11b, lipopolysaccharide-induced mTF expression and RP percentage, aAPCR, and levels of factors V and VIII, VWF:Ag, sP-selectin and sCD40L than patients without thrombosis and controls. At multivariate study, RP percentage, factor V levels, and aAPCR were independently associated with an increased risk of thrombosis. Patients with the JAK2 mutation showed higher baseline and AA-induced platelet P-selectin expression than those with wild-type allele. A mutant allele dosage effect ( 12 %) was observed for sP-selectin, sCD40L, TF, VWF:Ag and free protein S (PS) levels. These results support a role for platelet and monocyte activation, platelet turnover, factor V, and aAPCR in the thrombosis of ET, as well as their potential to identify patients at greater risk of thrombosis. The association between JAK2 V617F allele burden and either decreased free PS or increased TF and markers of platelet and endothelial activation could suggest that this mutation would promote an enhanced prethrombotic state in ET. EXTRACT. The mechanisms accounting for the increased risk of thrombosis in patients with essential thrombocythemia (ET) are not well known. The aim of the present thesis was to ascertain the role of platelet and leukocyte activation in the thrombosis of ET and its relationship with the JAK2 mutation. The results of the present thesis support a role for platelet and monocyte activation, platelet turnover, factor V, and aAPCR in the thrombosis of ET, as well as their potential to identify patients at greater risk of thrombosis. The association between JAK2 V617F allele burden and either decreased free PS or increased TF and markers of platelet and endothelial activation could suggest that this mutation would promote an enhanced prethrombotic state in ET. KEY WORDS. Essential thrombocythemia, thrombosis, platelet activation, leukocyte activation, coagulation, JAK2 V617F mutation.

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic.L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu.L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics. / Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described. 2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the -crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole -crystallin domain in E. coli cells shows that most of the -crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the -crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells. Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.

Aquest treball és una contribució als estudis de diversitat del genoma humà i pretén estudiar la variació genètica existent a nivell mundial en dos gens, causants de malaltia, el gen CFTR i el gen GBA, en cromosomes d'individus sans. Mutacions en aquests gens produeixen la fibrosi quística i la malaltia de Gaucher respectivament. La fibrosi quística és la malaltia autosòmica recessiva més comuna en poblacions europees. La malaltia de Gaucher és la malaltia lisosòmica d'acumulació lipídica més freqüent. L'estudi analitza la variació genètica en diferents polimorfismes d'ambdós gens; reconstrueix els haplotips i analitza la seva distribució geogràfica; i analitza l'extensió i distribució geogràfica del desequilibri de lligament entre loci. Pel gen GBA, hem ampliat la regió, abastant fins al gen PKLR (que codifica per a la piruvat quinasa). A més a més, pel cas de CFTR, pot ajudar a entendre l'origen de les mutacions més freqüents causants de fibrosi quística. / This work is a contribution to human genome diversity studies and it aims to study the world-wide genetic variation that exists in two disease genes, CFTR and GBA gene, in healthy chromosomes. Mutations in these genes are known to cause cystic fibrosis and Gaucher disease respectively. Cystic fibrosis is the most common severe autosomal recessive disease in patients of European descent. Gaucher disease is the most frequent lysosomal storage disorder. The study analyzes the genetic variation in CFTR and GBA polymorphisms; estimates haplotype frequencies and describes their geographic distribution; and measures linkage disequilibrium between loci. For GBA gene, we have extended the analysis covering PKLR gene (that encodes for a pyruvate kinase). Moreover, for CFTR gene, we have tried to understand the origin of the most common cystic fibrosis causing mutations.