L'aterosclerosi és una malaltia progressiva que es caracteritza per una acumulació de lípids en el subentoteli vascular. Evidències observacionals suggereixen que la peroxidació lipídica, la resposta inflamatòria i els processos trombogènics tenen un paper important en la patogènesi de l'aterosclerosi i les seves complicacions clíniques. Diversos estudis han demostrat l'existència de LDL oxidades, d'alguns dels seus components oxidats, de nivells elevats de citocines proinflamatòries i del principal inductor de la trombosi, el factor tissular, en plasma de pacients d'alt risc cardiovascular i en plaques ateroscleròtiques humanes on també s'ha observat acumulació de cèl·lules inflamatòries. Malgrat aquests coneixements no es disposa d'evidències directes que relacionin la peroxidació lipídica amb la inflamació. Un fet remarcable en aquest àmbit és el potencial del PPAR en l'aterosclerosi. El PPAR és un receptor nuclear diana de les tiazolidinadiones, fàrmacs utilitzats en el tractament de la diabetis mellitus tipus 2. Aquests fàrmacs mostren un efecte global antiateroscleròtic en models animals d'aterosclerosi i en estudis clínics amb humans. A nivell in vitro s'ha demostrat que aquests fàrmacs poden tenir un paper antiinflamatori important. A més, PPAR s'expressa de forma elevada en plaques ateroscleròtiques on colocalitza amb lípids oxidats. Recentment s'ha suggerit que la LDL oxidada podria ser una font de lligands endògens del PPAR tot i que encara no s'han establert. Els estudis que es presenten en aquesta tesi doctoral engloben nous coneixements de la peroxidació lipídica en la patogènesi de l'aterosclerosi i en concret en la inflamació i la trombosi. I donen suport a la teoria que la modificació oxidativa dels lípids té un paper important en la progressió de la malaltia aterotrombòtica. Els resultats que s'exposen en aquesta tesi doctoral demostren que el 2,4-decadienal, un aldehid apolar producte final de l'oxidació dels àcids grassos poliinsaturats majoritaris de les LDL, contribueix a la coneguda citotoxicitat de la LDL oxidada en cèl·lules musculars llises humanes. L'efecte citotòxic observat no és promogut per apoptosi cel·lular donat que no es produeix la fragmentació del DNA característica d'un estat apoptòtic. El 2,4-decadienal i l'hexanal, un altre aldehid apolar, a concentracions no citotòxiques aturen el creixement cel·lular i disminueixen els nivells de mRNA dels gens p53 i c-myc que estan involucrats en la regulació de l'apoptosi. Aquests resultats suggereixen que la citotoxicitat dels aldehids podria explicar-se per un fenomen de necrosi cel·lular. D'altra banda ambdós aldehids augmenten els nivells de mRNA i de proteïna del factor tissular. Nosaltres suggerim que aquest efecte podria ser a través de l'activació del factor de transcripció AP-1 format pel complex cFos-cJun prèvia síntesi de novo de c-Fos. Aquest efecte es reverteix amb un tractament previ amb simvastatina, un fàrmac hipolipemiant amb propietats antioxidants i antitrombòtiques. Pel que fa a la implicació de PPAR en l'aterosclerosi, 1) hem identificat dos elements de resposta PPAR en el promotor del gen del TNF humà que suggereixen una implicació directa de PPAR en la inflamació. Aquest estudi aporta més dades al coneixement del mecanisme d'acció de les tiazolidinadiones i descriu una nova via de modulació de l'expressió del TNF; 2) proposem el 2,4-decadienal com a candidat a mediador de PPAR en la placa d'ateroma donat que els resultats obtinguts demostren que activa PPAR. Augmenta la translocació de PPAR del citosol al nucli i augmenta la transcripció regulada per PPAR; 3) aportem evidències que descartarien l'efecte proateroscleròtic (augment de CD36) no desitjable de les tiazolidinadiones en pacients diabètics tipus 2. Aquests pacients tenen nivells elevats d'àcids grassos lliures circulants i les dades obtingudes demostren que la darglitazona, una tiazolidinadiona, en presència d'àcids grassos lliures no altera l'expressió de CD36 ni en monòcits ni en macròfags humans i no modifica el contingut lipídic dels macròfags. / Atherosclerosis is a progressive disease characterized by an accumulation of lipids in the subendothelial wall. Experimental evidence suggest that lipid peroxidation, inflammatory response and thrombogenic processes play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis and its clinical complications. Oxidized LDL particles, some of their oxidative compounds, elevated levels of proinflammatory cytokines and tissue factor (the main inducer of thrombosis) have been detected in plasma of patients with high cardiovascular risk. It has also been reported the presence of all these components in human atherosclerotic plaques where also has been observed an accumulation of inflammatory cells. However, no direct evidence exist about a direct relation between lipid peroxidation and inflammation. A recent interesting finding is the possible role of PPAR in atherosclerosis. PPAR is the nuclear receptor target of thiazolidinediones, drugs used in the treatment of non insulin dependent diabetes mellitus. These drugs have shown a net antiatherosclerotic effect in animal models and in clinical studies in humans. In vitro experiments have shown that thiazolidinediones may have an important antiinflammatory action. PPAR is overexpressed in atherosclerotic plaques where colocalizes with oxidized lipids. Recently, oxidized LDL has been pointed as an important source of PPAR ligands.The work presented in this thesis shows new knowledge of the lipid peroxidation role in the pathogenesis of atherosclerosis emphasized in the action on inflammation and thrombosis. In summary, the obtained results support the theory that lipid oxidative modification plays an important role in the progression of atherothrombotic disease.Results show that the apolar aldehyde 2,4-decadienal, an end product of the oxidation of the main polyunsaturated fatty acids present in LDL, contributes to the well-known toxicity of oxidized LDL in human smooth muscle cells. The cytotoxic effect observed may not be promoted by an apoptotic state because the characteristic DNA ladder is not induced. 2,4-decadienal and hexanal, another apolar aldehyde, at non cytotoxic concentrations produce cell growth arrest and decrease p53 and c-myc mRNA levels, genes involved in the regulation of apoptosis. These results suggest that the cytotoxicity of aldehydes may be explained by cell necrosis.On the other hand, both aldehydes increase tissue factor mRNA and protein levels. We suggest that this effect may be produced through the activation of the transcription factor AP-1 formed by the complex cFos-cJun and by previous synthesis of c-Fos. This effect is prevented by a pretreatment with simvastatin, a hypolipidemic drug with antioxidant and antithrombotic properties.Concerning PPAR implication in atherosclerosis, 1) we have identified two PPAR response like elements in the human TNF promoter which suggest a direct link between PPAR and inflammation. This study adds more data in the knowledge of the mechanism of action of thiazolidinediones and describes a new pathway to modulate TNFexpression; 2) we propose that 2,4-decadienal may be a PPAR mediator in the atheromatous plaque based on our results that show PPAR activation by 2,4-decadienal. 2,4-decadienal increases PPAR translocation from the citosol to the nucleus and increases the transcription regulated by PPAR; 3) we also show evidence that the non desirable proatherosclerotic effect (CD36 induction) of thiazolidinediones would not be produced in type 2 diabetic patients. These patients have high levels of circulating fatty acids and our results show that darglitazone, a thiazolidinedione, in the presence of fatty acids neither alters CD36 expression in human monocytes and macrophages nor modifies macrophage lipid content.

La heparina es una familia de cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs) formados por residuos de glucosamina y ácido urónico, cuya eficacia y seguridad en la profilaxis y tratamiento de las enfermedades trombóticas están bien establecidas.El descubrimiento de que parecía posible desdoblar el efecto inhibidor del factor Xa de la inhibición de la trombina, con las fracciones de bajo peso molecular de la heparina despertó grandes expectativas y condujo a la introducción en terapéutica de las heparinas y heparinoides de bajo peso molecular. Debido a los distintos procedimientos de obtención y a las diferentes unidades utilizadas por los fabricantes para expresar la actividad de sus productos, las comparaciones entre los distintos preparados eran complicadas.Esta situación indujo a la realización de la presente tesis en la que se comparó el efecto de distintos GAGs sobre la hemostasia en un modelo de trombosis in vitro.Los productos estudiados fueron: Fragmin® (Kabi) y Fraxiparinc® (Sanofi), dos heparinas de bajo peso molecular que se obtienen a partir de la heparina por despolimerización y purificación; Lomoparán® (Organon) un hiparinoide de bajo peso molecular que se produce directamente de mucosa intestinal porcina; Org 31550 es un derivado sintético del pentasacárido natural de unión a la ATIII y está exento de toda acción inhibidora de la trombina; la heparina no fraccionada estudiada (HNF, Laboratorios Rovi) es la disponible comercialmente y se obtiene de mucosa intestinal porcina.Debido a las distintas unidades empleadas por los fabricantes, en primer lugar hubo que seleccionar la concentración óptima que sería utilizada en las perfusiones, para cada uno de los productos. De forma arbitraria se decidió utilizar la mínima necesaria que inhibiera la formación de trombina en sangre mantenida en reposo a temperatura ambiente. Como indicador de la formación de trombina se determinó la concentración de fibrinopéptido A (FPA).A continuación se estudió el efecto de los GAGs sobre el funcionalismo plaquetario a las dosis seleccionadas. Para ello se realizaron perfusiones en las que se cuantificó el depósito de plaquetas sobre la superficie expuesta al flujo y se evaluó la formación de microagregados plaquetarios.Las perfusiones se realizaron en una cámara de perfusión desarrollada por Sakariassen. La superficie adhesiva era matriz extracelular (MEC) de células endoteliales (CE) cultivadas in vitro. Expuesta al flujo esta matriz induce la adhesión plaquetaria, pero no la formación de trombos. Para obtener una matriz trombogénica que permitiera estudiar la formación de fibrina y trombos plaquetarios, las células fueron estimuladas con un éster de forbol que induce en las CE la síntesis y depósito de factor tisular en la MEC que activará la cascada de la coagulación que conducirá a la producción de trombina.En la evaluación en face de la adhesión plaquetaria se cuantificó la superficie cubierta (SC) por plaquetas. Los trombos plaquetarios se evaluaron en sección transversal que permite cuantificar la superficie cubierta por trombos de diferentes alturas. Al finalizar las perfusiones se midió la formación de microagregados (SPD) realizando recuentos en EDTA y en glutaraldehído en un contador automático fijando la ventana de recuento entre 3,2 y 16 fl. La idea es que los microagregados formados durante la perfusión se deshacen al colocarlos en una EDTA, y por el contrario son fijados en glutaraldehído y no son valorados por el contador.El siguiente paso consistió en encontrar un método fiable que permitiera cuantificar la fibrina depositada sobre la matriz. En primer lugar se comparó la técnica que se pensaba utilizar, que es la del Fg-PO con la del Fg marcado con iodo 125 que se considera el patrón pero que tiene el inconveniente de que obliga a trabajar con material radioactivo. Para el estudio comparativo se realizaron perfusiones sobre matriz trombogénica en las que la fibrina se midió con las dos técnicas a la vez.Una vez establecida la técnica a utilizar se estudió el efecto de los glicosaminoglicanos y de las condiciones de flujo sobre la formación de fibrina, utilizando las mismas condiciones de perfusiones que antes.RESULTADOSSe observa que Fragmin y Fraxiparine son casi igualmente efectivas inhibiendo la formación de trombina en la sangre en reposo en términos de molaridad (33,2 Y 36,8 nmol/ml aunque difieren considerablemente cuando se expresan en las U del fabricante (20 y 40 U/mi). Mucha mayor cantidad se requiere de Lomoparan (146,4 nmol/ml) y del pentasacárido 31550 (95,2 nmol/ml) posiblemente debido a su menor actividad inhibidora de la trombina. Como cabía esperar por su actividad anti-trombina mucha menor cantidad de HNF fue necesaria (1,9 nmol/ml).Con la sangre anticoagulada con Lomoparan, la SC por plaquetas es significativamente mayor a los otros GAGs. Respecto al SPD la cifra de Lomoparan es menor aunque sólo es estadísticamente significativa comparada con la obtenida con Fragmin. Al estudiar la relación entre SC y SPD en cada una de las perfusiones realizadas, se observa que presentan una correlación lineal inversa estadísticamente significativa. Parece probable que la mayor SC observada con Lomoparan sea debido a su menor capacidad de formación de microagregados.Cuando se estudió el efecto sobre la formación de agregados, sólo en la superficie cubierta por agregados mayores de 10 milimicras se observaron diferencias, siendo menor para heparina no fraccionada y Lomoparan que para Fragmin y Fraxiparine. Sabemos que la formación de trombos plaquetarios en estas condiciones es un proceso trombina dependiente. Por lo tanto las diferencias observadas en los agregados de mayor tamaño posiblemente sea debida a diferencias en la cantidad de trombina formada. Presentando la HNF la mayor capacidad de inhibición, y tras ella Lomoparan, Fragmin y Fraxiparine.Tras realizar los estudios comparativos se decidió utilizar el marcaje con yodo pues a pesar de que la manipulación del material radioactivo es más engorrosa, proporciona unos resultados fiables.Una vez seleccionada la técnica a utilizar, se estudió el efecto de los glicosaminoglicanos y del flujo sobre el depósito de fibrina.La cantidad de fibrina depositada en las perfusiones realizadas con sangre anticoagulada con la HNF, a ambos coeficientes de cizalladura es casi inexistente. Ni la microscopía óptica ni la electrónica, mostraron fibrina en absoluto; estas cifras probablemente muestran los valores de fondo correspondientes al Fg-Yodo asociado a la MEC y/o a las plaquetas.Por el contrario, la fibrina formada con los otros GAGs varió considerablemente dependiendo del tipo de anticoagulante y el coeficiente de cizalladura. A 300 s(-1) el pentasacárido Org 31550 proporcionó las cantidades mayores de fibrina formada, seguido por Fraxiparine y Fragmin. Lomoparan inhibió el depósito de fibrina en mayor proporción.Cuando el coeficiente de cizalladura se aumentó a 1.300 s(-1) la cantidad de fibrina disminuyó. Para el pentasacárido y la HNF, la reducción no alcanzó significación estadística. Sí lo fue para Fraxiparine, Fragmin y Lomoparán, en los que rondó alrededor del 80%.La generación del FPA siguió el mismo patrón que la fibrina, es decir el menor aument o correspondió a la HNF, ya continuación Lornoparan, Fragmin y Fraxiparine y el mayor al pentasacárido. El aumento en los niveles de fibrinopéptido A se detuvo al fmalizar la perfusión en todos los GAGs excepto para el pentasacárido. En este caso, a los 15' de acabar la perfusión los niveles de FPA habían crecido aproximadamente un 30%. Esto probablemente indica que una vez se ha formado trombina escapa a los mecanismos de inhibición y continua ejerciendo su acción en la fase líquida.Entre los GAGs de bajo peso molecular Lomoparán posee un efecto antitrombina mayor que Fragmin y Fraxiparine. Este mayor potencial antitrombólico podría deberse a la presencia de dermatán sulfato, pues recientemente se ha demostrado que los complejos de dermatán sulfato-cofactor JI de la heparina son capaces de inhibir a la trombina unida a la fibrina mientras que los complejos de antitrombina III-heparina no lo son. El perfil de acción de Fragmin y Fraxiparine es más o menos igual con una tendencia de Fraxiparine hacia un menor efecto antitrombótico.Las diferencias observadas en la generación de FPA comparando los dos coeficientes de cizalladura no fueron estadísticamente significativas. Esto sugiere que la menor cantidad de fibrina depositada a alto coeficiente de cizalladura posiblemente se debe a una menor polimerización de los monómeros de fibrina inducida por el flujo que a un defecto en la formación de trombina. / Low molecular weight heparin(oid)s (LMWH) differ markedly in terms of molecular composition and activity. In order lo gel more insight into the effect on platelets and fibrin deposition we have compared Fragmin® (KabiVitrum, FA), Fraxiparine® (Choay Laboratories, FP), Lornoparan®, a LMW heparinoid (Organon, LO), a synthetic derivative of rhe natural pentasaccharide, Organon 31550 (PE) and unfractionated heparin (Rovi Laboratories, UH) in a perfusion systern. The concentration selected for perfusion studies was the lowest which inhibited thrombin generation (measured as increase in fibrinopeptide A, FPA) in blood stored for 3 hours at room temperature. Blood from healthy donors was anticoagulated with FA 20 U/ml, FP 40 U/ml, LO 15 U/ml, PE 200 U/ml and UH 5 U/ml. Perfusions were carried out in a rectangular chamber at a shear rate of 300 and 1300 s(-1) for 5 minutes. The extracellular matrices (ECM) used as adhesive surface were obtained from cultured human umbilical vein endothelial cells. A part of these cells were stimulated with phorbol myristate acetate for 16 hours to induce tissue factor synthesis and thrombin formation in the ECM.The extent of platelet aggregation during perfusion was measured as single platelet disappearance (SPD) by comparing platelet counts in EDTA and glutaraldehyde. Fibrin deposition was measured with IUI-fibrinogen. FPA generation during perfusion was assessed with a RIA kit. In the perfusions performed al 1300 s(-1)' for 5 min, over non stimulated ECM, LO showed a significantly higher platelet adhesion than the other heparins. This correlated with a significantly lower SPD during perfusion. In perfusions carried out at 300 s(-1) over stimulated ECM, all LMWH's and PE gave significantly more fibrin deposition than UH. LO gave less fibrin than the others LMWH's. When the shear rate was increased to 1,300 s(-1) the amount of fibrin deposited on !he ECM decreased, with no changes in the amount of FPA generated, indicating that probably it was due to a defect on fibrin polymerisation more than to a impairment of thrombin formation. In conclusion: in this experimental model, LO exerts less effect on platelets than the other heparins studied. All LMWH's tested and PE, but not UH, a1low local thrombin generation and fibrin deposition on subendothelium. LO inhibited fibrin deposition to a larger extent than the other LMWH's.

El síndrome antifosfolipídico (SAF) se caracteriza clínicamente por la aparición de fenómenos trombóticos recurrentes, complicaciones obstétricas, tales como abortos o pérdidas fetales recurrentes, y trombocitopenia. Inmunológicamente se define por la presencia de los anticuerpos antifosfolipídicos (AAF), un grupo heterogéneo de autoanticuerpos que reconocen complejos constituidos por fosfolípidos de membrana y proteínas plasmáticas que actúan como cofactores. Los mejor conocidos y que ayudan a establecer el diagnóstico de la enfermedad son los anticuerpos con actividad anticoagulante lúpico y los anticuerpos anticardiolipina. Recientemente se han descrito otros AAF que son capaces de reconocer directamente la proteína que actúa como cofactor en ausencia de fosfolípidos, tales como los anticuerpos anti-beta2 glicoproteína I y los anticuerpos antiprotrombina. El papel de éstos últimos todavía no es bien conocido. Además, aunque parece clara la asociación entre los AAF y la aparición de trombosis, los mecanismos directamente responsables de las mismas tampoco se conocen con exactitud.Nuestra hipótesis de trabajo fue la siguiente: los anticuerpos dirigidos contra la protrombina podrían participar de forma activa en la fisiopatología de las trombosis y su presencia, junto con otros anticuerpos antifosfolipídicos, podría ser de gran ayuda para predecir el riesgo para desarrollarlas. Su capacidad trombogénica podría deberse a una acción inhibitoria sobre el sistema anticoagulante de la proteína C y provocar con ello una resistencia adquirida a la acción de la proteína C activada. Este efecto inhibitorio sobre el sistema de la proteína C alteraría el equilibrio existente a favor de un estado procoagulante. Para verificar la misma se plantearon tres objetivos fundamentales: profundizar en el conocimiento de las características clínicas del síndrome antifosfolipídico, estudiar el papel de los anticuerpos antiprotrombina en su fisiopatología y analizar la resistencia adquirida a la acción de la proteína C activada como un posible mecanismo de las trombosis asociadas a los anticuerpos antifosfolipídicos.Para responder a estos objetivos se diseñaron tres estudios. El primero fue un estudio clínico en el que se analizaron las características clínicas y evolutivas de 100 pacientes diagnosticados de síndrome antifosfolipídico con una mediana del tiempo de seguimiento de 49 meses. Se observó que los pacientes con antecedentes de trombosis tienen un alto riesgo de recurrencias y que la anticoagulación oral administrada de forma indefinida es la mejor profilaxis; además, la administración de tratamiento profiláctico durante el embarazo de las pacientes con el mencionado síndrome reduce de forma considerable el riesgo de abortos o pérdidas fetales. En el segundo estudio se estandarizó una técnica de ELISA para la detección de los anticuerpos antiprotrombina y se estudió su presencia en una serie de 177 pacientes con síndrome antifosfolipídico primario o lupus eritematoso sistémico. Se obtuvo una prevalencia global del 47%, significativamente superior a la observada en el grupo control formado por 87 voluntarios sanos (5%). Además en pacientes con lupus eritematoso sistémico su isotipo IgG constituye un factor de riesgo independiente para el desarrollo de trombosis. Finalmente, en el tercer estudio se analizó la resistencia adquirida a la acción de la proteína C activada, aquella que no era debida a la presencia del factor V Leiden, en 103 pacientes con lupus eritematoso sistémico y en 103 voluntarios sanos. Inicalmente se observó que la presencia del factor V Leiden es baja y similar a la población general (4%). La resistencia adquirida alcanzó una prevalencia aproximadamente del 20% y se asoció de forma significativa con la presencia de los anticuerpos antifosfolipídicos, especialmente con el isotipo IgG de los anticuerpos anticardiolipina y antiprotrombina. Por último su presencia se asoció con una mayor prevalencia de trombosis arteriales y de fracasos de los embarazos. / The main objectives of our work were to reach a higher knowledge about the clinical characteristics of patients with the antiphospholipid syndrome (APS), to study the role of antiprothrombin antibodies in the pathogenesis of this syndrome, and to analyze the acquired activated protein C resistance as a possible thrombotic mechanism in such patients. To answer these objectives three studies were made: The first was a clinical study in which the clinical characteristics and follow-up of 100 patients with the APS were analyzed. The median length of follow-up from time of diagnosis was 49 months. It was observed that patients with APS have a high risk of recurrent thromboses. Moreover, long-term oral anticoagulation seems to be the best prophylactic treatment to prevent recurrences. Prophylactic treatment with aspirin during pregnancy reduced the rate of miscarriages remarkably. In the second study antiprothrombin antibodies were measured by an ELISA previously standardized in our laboratory and their presence was studied in a series of 177 patients with primary APS or with systemic lupus erythematosus. Their prevalence was 47%, significantly higher than in a control group (5%) consisting of 87 healthy volunteers. Moreover, IgG isotype of antiprothrombin antibodies was an independent risk factor for thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Finally, in the third study the clinical significance of acquired activated protein C resistance (not due to the presence of factor V Leiden), was studied in 103 patients with systemic lupus erythematosus and in 103 normal volunteers as the control group. First, the prevalence of factor V Leiden was low and similar to that seen in the whole population (4%). However, the prevalence of the acquired form was higher (20% approximately) and it was significantly associated with antiphospholipid antibodies, mainly with the IgG isotype of anticardiolipin antibodies and antiprothrombin antibodies. Moreover, its presence was associated with a higher prevalence of arterial thrombosis and pregnancy losses.

En esta tesis, fruto de cinco años de trabajo, en los laboratorios de Hemoterapia y Coagulación así como en el de Bioquímica pretendemos el estudio y puesta a punto de las técnicas necesarias para medir algunas de las funciones plaquetarias; aplicación clínica en enfermos con sospecha de padecer procesos trombóticos y con ello su posible profilaxis así como su modificación en trombosis constituidas. Por fin, interrelación entre lípidos y funciones plaquetarias. Dentro de las funciones plaquetarias hemos estudiado la adhesividad y la agregación. Estas dos funciones en dos grupos de sujetos sanos y enfermos con predisposición o trombosis constituidas. Dentro de los enfermos predispuestos hemos estudiado arterioesclerosis, diabetes, enfermedades infecciosas, cáncer, corazón-pulmonares. Entre los sanos, hemos estudiado mujeres que tomaban anticonceptivos (combinación de d,l norgestrel - 0,5 mgs. y etinilestradiol - 0,05 mgs.). En el estudio lipídico se midieron por métodos químicos las cifras de lípidos totales, colesterina, triglicéridos, las lipoproteínas por electroforesis en acetato de celulosa y cromatografía en capa fina. Esta última nos ha servido para control de las determinaciones químicas. Se utilizó un inhibidor de la agregación «in vitro» dipiridamol para in-tentar sensibilizar la prueba y para comprobar si habría efectos diferencia-les sobre la agregación plaquetaria en individuos normales y en los diferentes enfermos. Junto con el Prof. Castillo estudiamos los efectos del Dipiridamol «in vitro», en sujetos sanos con medidas de la agregación previa y a las dos horas de 10 mgs. intramuscular.

La trombofilia és la tendència genètica al tromboembolisme venós. Amb la finalitat d'aprofundir en les bases genètiques de la trombofília hereditària, l'objectiu principal d'aquesta tesi és la identificació dels factors genètics que determinen la variabilitat dels nivells de FVII a la població espanyola. En primer lloc, es va calcular l'heretabilitat dels nivells de FVII en un 53%, i mitjançant una anàlisi global del genoma es va localitzar el gen responsable de la variabilitat dels nivells de FVII en la zona 13q, just on es localitza el gen estructural del FVII (F7). Aquest resultat indica que els factors genètics que determinen la variabilitat de FVII en plasma es troben en el gen estructural. A continuació es va realitzar una anàlisi genètica exhaustiva i es van obtenir 49 posicions polimòrfiques al llarg del gen (F7), la majoria canvis d'una sola base (SNPs). A més, mitjançant una anàlisi de l'organització haplotípica de la variació en la seqüència del (F7), es va observar que existeixen tres clars llinatges d'haplotips que s'han mantingut paral·lelament en la població espanyola per selecció estabilitzadora, molt probablement per un avantatge dels individus heterozigots. L'anàlisi d'associació entre aquests llinatges i els nivells de FVII indica que un d'ells, caracteritzat pels al·lels [-670C, -630G, -402A] està associat a nivells elevats en la població, i un altre, caracteritzat pels al·lels [-2989A, -401T, -323ins10, -122C] està associat a nivells reduïts.Les anàlisis posteriors de transfecció in vitro amb els diferents al·lels utilitzant un sistema reporter GFP (Green Fluorescent Protein) van permetre determinar que les variants -323ins10 i -122C tenen un efecte reductor sobre els nivells de proteïna, i que la variant -402A provoca un augment significatiu dels nivells de FVII. Finalment, la nova variant -2989A incrementa també de forma molt significativa els nivells d'expressió. Aquests resultats es confirmen a més en un estudi cas-control amb pacients amb trombosi venosa profunda, així com en dues famílies amb deficiència de FVII. El disseny, l'estratègia i la metodologia emprades són un bon exemple de com localitzar i identificar loci implicats en caràcters complexes. / There is a definite genetic predisposition to venous thromboembolism. The levels of FVII in plasma has been clearly implicated in thrombophilia. The aim of this thesis was to identify and characterize the genetic factors that determine the variability of FVII plasma levels in the Spanish population. First, the heritability of FVII levels was calculated as 53%indicating a substantial genetic component. A Genome Wide Scan allowed the localization of the responsible gene on the long arm of chromosome 13, exactly where the FVII "(F7)" structural gene has been located. This indicates that the genetic factors that determine FVII variability are localized in the structural gene.Second, from an exhaustive genetic analysis, we obtained 49 polymorphisms (variants) in the "F7" gene. Further, by an analysis of sequence variations and haplotype organization, three main haplotype lineages were detected that have been maintained presumably by balanced selection, probably due to an advantage of heterozygous individuals. The association analysis among these lineages and the FVII levels indicates that one of these lineages, containing allelic variants [-670C, -630G, -402A] was associated with elevated FVII levels. Also, another lineage, containing allelic variants [-2989A, -401T, -323ins10, -122C] was associated with reduced levels of FVII. Posterior functional analyses of "in vitro" transfection of the different variants in a "reporter" system with GFP "(Green Fluorescent Protein)" showed that allelic variants -323ins10 i -122C significantly reduce expression levels while allelic variant -402A significantly increases them. The new allelic variant -2989A also increases expression levels significantly. Finally, these results have been confirmed in a case-control study with patients with deep venous thrombosis and in a study of two families with a FVII deficiency. The strategy and methodology of the present work are good examples of how to localize and identify genes implicated in complex human diseases.

El curso clínico de la trombocitemia esencial (TE) se caracteriza por un elevado riesgo de aparición de complicaciones trombóticas, las cuales constituyen la principal causa de muerte en estos pacientes. Si bien la causa fundamental de la trombosis en esta enfermedad parece ser el aumento del número de plaquetas y sus alteraciones bioquímicas y funcionales, no existe una correlación clara entre estos factores y el desarrollo de trombosis. El objetivo de la presente tesis fue conocer el papel de la activación plaquetaria y leucocitaria en la trombosis de los pacientes con TE. Para ello, se determinó mediante citofluorometría el estado de activación plaquetaria y leucocitaria en 53 pacientes con TE (26 con historia de trombosis previa) y en otros tantos sujetos sanos de igual edad y sexo. Las determinaciones incluyeron la expresión de P-selectina en plaquetas (en condiciones basales y después del estímulo con ADP, trombina, ácido araquidónico [AA] o colágeno), los complejos plaqueta-neutrófilo y plaqueta-monocito, el CD11b en neutrófilos y monocitos y la expresión de factor tisular en los monocitos (FTm). Además, se investigaron el porcentaje de plaquetas reticuladas (PR), la resistencia adquirida a la proteína C activada (RAPCA), la expresión plaquetaria de factor tisular (FT) y las concentraciones plasmáticas de FT, factores de la coagulación, P-selectina soluble (sP-selectina), CD40 ligando soluble (sCD40L), antígeno del factor de von Willebrand (VWF:Ag), trombomodulina soluble (sTM), dímero D y fragmento 1+2 de la protrombina. Estos parámetros se correlacionaron también la presencia de la mutación V617F de JAK2 o su carga mutacional.En comparación con los controles, los pacientes con TE tenían una mayor expresión de P-selectina basal e inducida por trombina o AA, así como unos valores significativamente más elevados de complejos plaqueta-neutrófilo y plaqueta-monocito, expresión de CD11b en neutrófilos y expresión basal de FTm. La P-selectina basal e inducida por AA, el CD11b monocitario, la expresión de FTm inducida por lipopolisacárido, el porcentaje de PR, RAPCA y las concentraciones plasmáticas del factor V, factor VIII, VWF:Ag, sP-selectina y sCD40L se hallaron significativamente más elevadas en pacientes con historia de trombosis que en aquellos sin trombosis. En el estudio multivariado, el porcentaje de PR, la concentración de factor V y la presencia de RAPCA se asociaron independientemente con un aumento del riesgo de trombosis. Los pacientes con la mutación V617F de JAK2 tuvieron unos valores más elevados de P-selectina basal e inducida por AA que los pacientes sin esta condición. Finalmente, se objetivó un efecto dosis del porcentaje mutacional (>/- 12%), asociándose éste a una mayor concentración de FT, sP-selectina, sCD40L, FVW:Ag y menor de proteína S (PS).Estos resultados sugieren que la activación plaquetaria y monocitaria, así como la renovación plaquetaria, factor V y RAPCA pueden desempeñar un papel importante en la patogenia de la trombosis de los pacientes con TE, así como la posibilidad de la detección de pacientes con un mayor riesgo trombótico. La asociación entre la carga alélica de V617F con la disminución de PS o incremento de FT y de los marcadores solubles de activación plaquetaria y endotelial sugiere que dicha mutación podría promover un estado pretrombótico en la TE. EXTRACTO. Si bien la causa fundamental de la trombosis en la trombocitemia esencial (TE) parece ser el aumento del número de plaquetas y sus alteraciones bioquímicas y funcionales, no existe una correlación clara entre estos factores y el desarrollo de trombosis. Los resultados de la presente tesis doctoral sugieren que la activación plaquetaria y monocitaria, así como la renovación plaquetaria, factor V y la resistencia adquirida a la proteína C activada pueden desempeñar un papel importante en la patogenia de la trombosis de los pacientes con TE, así como la posibilidad de la detección de pacientes con un mayor riesgo trombótico. La asociación entre la carga alélica de V617F con la disminución de proteína S libre o incremento de factor tisular y de los marcadores solubles de activación plaquetaria y endotelial sugiere que dicha mutación podría promover un estado pretrombótico en la TE. PALABRAS CLAVE. Trombocitemia esencial, trombosis, activación plaquetaria, activación leucocitaria, coagulación, mutación V617F de JAK2. / "ROLE OF THE PLATELET AND LEUKOCYTE ACTIVATION IN THE PATHOGENESIS OF THE THROMBOSIS IN ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA", by EDUARDO ARELLANO RODRIGOTEXT:The mechanisms accounting for the increased risk of thrombosis in patients with essential thrombocythemia (ET) are not well known. The aim of the present thesis was to ascertain the role of platelet and leukocyte activation in the thrombosis of ET and its relationship with the JAK2 mutation.In 53 ET patients (26 with a history of thrombosis), platelet P-selectin (measured both at baseline and after stimulation with ADP, thrombin, arachidonic acid (AA), and collagen) and leukocyte CD11b expression, reticulated platelets (RP) percentage, platelet and monocyte tissue factor (mTF) expression, acquired activated protein C resistance (aAPCR), and plasma levels of tissue factor (TF), coagulation factors, soluble P-selectin (sP-selectin), soluble CD40 ligand (sCD40L), von Willebrand factor antigen (VWF:Ag), thrombomodulin, D-dimer and prothrombin fragment 1+2 were compared with those in matched healthy individuals and correlated with thrombosis occurrence and JAK2 mutational load. As compared with controls, ET patients had significantly higher values of baseline P-selectin and thrombin- and AA-induced platelet P-selectin expression, as well as higher platelet-neutrophil and platelet-monocyte complexes, neutrophil CD11b expression and baseline mTF expression. ET patients with thrombosis had significantly higher values for platelet P-selectin, monocyte CD11b, lipopolysaccharide-induced mTF expression and RP percentage, aAPCR, and levels of factors V and VIII, VWF:Ag, sP-selectin and sCD40L than patients without thrombosis and controls. At multivariate study, RP percentage, factor V levels, and aAPCR were independently associated with an increased risk of thrombosis. Patients with the JAK2 mutation showed higher baseline and AA-induced platelet P-selectin expression than those with wild-type allele. A mutant allele dosage effect ( 12 %) was observed for sP-selectin, sCD40L, TF, VWF:Ag and free protein S (PS) levels. These results support a role for platelet and monocyte activation, platelet turnover, factor V, and aAPCR in the thrombosis of ET, as well as their potential to identify patients at greater risk of thrombosis. The association between JAK2 V617F allele burden and either decreased free PS or increased TF and markers of platelet and endothelial activation could suggest that this mutation would promote an enhanced prethrombotic state in ET. EXTRACT. The mechanisms accounting for the increased risk of thrombosis in patients with essential thrombocythemia (ET) are not well known. The aim of the present thesis was to ascertain the role of platelet and leukocyte activation in the thrombosis of ET and its relationship with the JAK2 mutation. The results of the present thesis support a role for platelet and monocyte activation, platelet turnover, factor V, and aAPCR in the thrombosis of ET, as well as their potential to identify patients at greater risk of thrombosis. The association between JAK2 V617F allele burden and either decreased free PS or increased TF and markers of platelet and endothelial activation could suggest that this mutation would promote an enhanced prethrombotic state in ET. KEY WORDS. Essential thrombocythemia, thrombosis, platelet activation, leukocyte activation, coagulation, JAK2 V617F mutation.