La infecció pel VIH-1 es caracteritza per una dràstica davallada en el recompte de cèl·lules T CD4+ que condueix a un estat d’immunodeficiència de l’individu, afavorint l’aparició de manifestacions definitòries de sida com són les infeccions oportunistes. Tot i això, la dinàmica de la pèrdua de cèl·lules T CD4+ no és igual en tots els pacients. En un extrem, hi podem trobar individus en els quals la pèrdua de cèl·lules T CD4+ és accentuadament ràpida, de manera que presenten recomptes de cèl·lules T CD4+ inferiors a les 350 cèl·lules/μl en menys de 3 anys (pacients ràpid progressors, RP). A l’altre extrem hi trobem un grup molt reduït d’individus que mantenen els recomptes de cèl·lules T CD4+ elevats (>400 cèl·lules/μl) i constants tot i presentar una replicació vírica activa a nivells elevats (pacients virèmics no progressors, VNP). La glicoproteïna de l’embolcall víric (Env) representa un dels principals determinants virològics de la citopaticitat del VIH-1, afectant tant les cèl·lules infectades com les no infectades a través de diversos mecanismes directes i indirectes. Per una banda, la unió de gp120 a la molècula CD4 (receptor víric) i a les molècules CXCR4 o CCR5 (coreceptors vírics i determinants del tropisme) així com la capacitat fusogènica de gp41 contribueixen de manera directa a la destrucció de cèl·lules T CD4. Per altra banda, la capacitat de gp41 (a través de l’epítop 3S) d’induir l’expressió a la superfície de les cèl·lules T CD4 del lligand NKp44L contribueix de manera indirecta en la seva destrucció, ja que l’expressió del lligand les sensibilitza per ser destruïdes mitjançant cèl·lules NK activades. Els objectius d’aquesta tesi són, per una banda, el desenvolupament d’un model in vitro per a l’estudi del tropisme i la capacitat fusogènica de l’Env així com la seva relació amb la destrucció de cèl·lules T CD4 per apoptosi i autofàgia i, per altra banda, avaluar la contribució relativa dels diferents mecanismes citopàtics descrits anteriorment en la destrucció de cèl·lules T CD4 in vivo caracteritzant Env aïllades de pacients RP i VNP. En aquest cas, també s’ha avaluat el paper de la resposta humoral anti-Env en els dos grups de pacients. En primer lloc, s’ha desenvolupat un mètode per a l’avaluació in vitro del tropisme i la fusogenicitat de diferents Env cocultivant cèl·lules 293T que expressaven l’Env i cèl·lules TZM-bl com a diana. A més a més, també s’ha demostrat la relació entre la capacitat fusogènica i hemifusogènica de l’Env i la inducció de mort cel·lular tant per apoptosi com per autofàgia. En segon lloc, s’han caracteritzat les Env dels pacients VNP i RP en termes de tropisme, fusió i inducció del lligand NKp44L a la superfície de les cèl·lules T CD4+. En cap cas es van observar diferències significatives que poguessin explicar la diferent dinàmica de pèrdua de cèl·lules T CD4 entre ambdós grups de pacients en relació amb aquests factors virològics. Finalment, s’ha avaluat la resposta humoral anti-Env, analitzant la resposta anti-gp120, la resposta contra l’epítop 3S de gp41 i la resposta humoral neutralitzant. Els resultats van mostrar una major presència d’anticossos contra l’epítop 3S de gp41 i la seva regió juxtaposada en els individus VNP en comparació amb els RP, evitant l’expressió in vivo del lligand NKp44L a la superfície de les cèl·lules T CD4 dels pacients VNP i possiblement contribuint a la seva protecció en aquest grup d’individus. Pel que fa a la resposta humoral neutralitzant, els resultats suggereixen que la seva contribució en el fenotip de VNP és residual ja que va presentar un ventall reduït de poca potència. / La infección por VIH-1 se caracteriza por una drástica caída en el recuento de células T CD4+ que conduce a un estado de inmunodeficiencia del individuo, favoreciendo la aparición de eventos definitorios de sida como son las infecciones oportunistas. Aun así, la dinámica de pérdida de células T CD4+ no es idéntica en todos los pacientes. En un extremo podemos encontrar individuos que presentan una pérdida de células T CD4+ acentuadamente rápida, de modo que, después de la seroconversión, sus recuentos de células T CD4+ llegan a valores inferiores a las 350 células/μl en un período de tiempo inferior a los 3 años (pacientes rápido progresores, RP). En el otro extremo, encontramos un grupo muy reducido de individuos que mantienen los recuentos de células T CD4+ elevados (>400 células/μl) y constantes aunque presentan una replicación viral activa y elevada (pacientes virémicos no progresores, VNP). La glicoproteína de la envuelta viral (Env) representa uno de los principales determinantes virológicos de la citopaticidad del VIH-1, afectando tanto las células infectadas como las no infectadas a través de distintos mecanismos directos e indirectos. Por un lado, la unión de gp120 a la molécula CD4 (receptor viral) y a las moléculas CXCR4 o CCR5 (coreceptores virales y determinantes del tropismo) así como la capacidad fusogénica de gp41 contribuyen directamente a la destrucción de células T CD4+. Por otro lado, la capacidad de gp41 (a través del epítopo 3S) de inducir la expresión en la superficie de las células T CD4+ del ligando NKp44L contribuye indirectamente en su destrucción, ya que la expresión del ligando provoca que las células T CD4+ sean susceptibles de ser destruidas mediante células NK activadas. Los objetivos de esta tesis fueron, por un lado, desarrollar un modelo in vitro para el estudio del tropismo y la capacidad fusogénica de la Env así como su relación con la destrucción de células T CD4 por apoptosis y autofagia y, por otro lado, determinar la contribución relativa de los distintos mecanismos citopáticos descritos anteriormente en la destrucción de células T CD4 in vivo caracterizando Env aisladas de pacientes RP y VNP. Adicionalmente, también se planteó el estudio de la respuesta humoral anti-Env en los pacientes RP y VNP. En primer lugar, se desarrolló un método para la evaluación in vitro del tropismo y la fusogenicidad de distintas Env cocultivando células 293T transfectades con las distintas Env y células TZM-bl como diana. Asimismo, se demostró la relación entre la capacidad fusogénica y hemifusogénica de la Env y la inducción de muerte celular tanto por apoptosis como por autofagia. En segundo lugar, se caracterizaron las Env de los pacientes VNP y RP en términos de tropismo, fusión e inducción del ligando NKp44L en la superficie de las células T CD4+. En ningún caso se obtuvieron diferencias significativas que pudiesen explicar la distinta dinámica de pérdida de células T CD4 observada entre ambos grupos de pacientes en relación con estos factores virológicos. Finalmente, se evaluó la respuesta humoral anti-Env, analizando la respuesta anti-gp120, la respuesta contra el epítopo 3S de gp41 y la respuesta humoral neutralizante. Los resultados mostraron una mayor presencia de anticuerpos dirigidos contra el epítopo 3S de gp41 y su región yuxtapuesta en los individuos VNP en comparación con los RP, evitando la expresión in vivo del ligando NKp44L en la superficie de las células T CD4 de los pacientes VNP y, posiblemente, contribuyendo a su protección en este grupo de individuos. En relación con la respuesta humoral neutralizante, los resultados obtenidos sugirieron que su contribución al fenotipo de VNP es residual ya que presentó un abanico reducido y de baja potencia. / HIV-1 infection is characterized by an important decrease on CD4+ T cell counts, resulting in weakened immune responses that lead to AIDS-defining events such as opportunistic infections. However, the dynamics of the CD4+ T cell loss is highly heterogeneous among HIV-infected individuals. On the one hand, some patients show a markedly fast decay on the CD4+ T cell counts, reaching values lower than 350 CD4 T cell/μl within the first three years after seroconversion (rapid progressors, RP). On the other hand, a really limited group of HIV-infected individuals shows high and maintained CD4+ T cell counts (>400 cells/μl) despite an active and high viral replication (viremic non progressors, VNP). The envelope glycoprotein (Env) represents one of the main virological determinants of HIV-1 cytopaticity, affecting both infected and non-infected cells through direct and indirect mechanisms. By one side, the binding of gp120 to the CD4 molecule (viral receptor) and CXCR4 or CCR5 (viral coreceptors which determine the viral tropism) in combination with the fusogenic capacity of gp41 directly contribute to the destruction of the CD4+ T cells. By the other side, gp41 induces the expression of NK cells ligand NKp44L on the surface of the CD4+ T cells through its 3S epitope, indirectly contributing to its destruction since the expression of the ligand renders these cells highly sensitive to be killed by activated NK cells. The objectives of this thesis were, by one hand, to develop an in vitro method to evaluate the Env tropism and fusogenic ability and its relation with CD4 T cells destruction by apoptosis and autophagy, and, by the other hand, to evaluate the relative contribution of the different cytopatic mechanisms described above in the destruction of CD4+ T cells in vivo, characterizing Env isolated from RP and VNP individuals. Moreover, the role of the humoral immune responses against Env was also evaluated for both groups of HIV-infected individuals. Therefore, a method for the in vitro evaluation of the tropism and the fusogenicity of different Env was developed based on the coculture of Env-transfected 293T cells with TZM-bl as target cells. Furthermore, the relation between the fusogenic and hemifusogenic ability of Env and the induction of cell death by both, apoptosis and autophagy, was demonstrated. Secondly, Env from VNP and RP patients were characterized in terms of tropism, fusion and induction of NKp44L on the surface of primary CD4+ T cells. No significant differences related to those virological factors which could explain the different loss of CD4 T cells between both groups of patients were observed. Finally, the anti-Env humoral response was evaluated, analyzing anti-gp120 response, anti-3S response and the neutralizing humoral response. The results showed a higher presence of antibodies directed against the 3S epitope of gp41 and its juxtaposed region in the VNP individuals compared with the RP. In vivo, this response could avoid the expression of NKp44L on the surface of CD4 T cells from VNP individuals contributing to its protection in this group of patients. Related to the neutralizing humoral response, the results suggested that its contribution to the VNP phenotype was residual, since VNP individuals were unable to mount a broad and potent neutralizing response against HIV-1.

Determinar l'acció d'uns anticossos anti-gangliòsids d'un pacient amb polineuropatia crònica motora desmielinitzant associada a un component monoclonal IgM, sobre conducció nerviosa i sobre la neurotransmissió d'un mamífer adult tant en un estudi agut com crònic i, comprovar que els gangliòsids estan relacionats amb l'entrada de calci al terminal nerviós.Metodologies emprades:Determinació de l'especificitat del sèrum del pacient amb tècniques d'ELISA i d'immunoHPTLC utilitzant gangliòsids comercials i gangliòsids purificats de cervell boví, de cervell humà i de cultiu de cèl·lules YAC-1.Purificació d'anticossos de la classe IgM mitjançant cromatografia d'afinitat amb anticossos de cabra contra IgM humana.Tècniques d'immunohistoquímica per comprovar la fixació de l'anticòs a la regió presinàptica de la unió neuromuscular.Inoculació local repetitiva dels anticossos anti-gangliòsid en el múscul LAL de ratolins, cada 24 h durant 15 dies. Utilització de prendisolona per a reduir la resposta inflamatòria local. Els controls es van realitzar amb el mateix protocol però injectant les IgM desnaturalitzades per calor (90 ºC, 20 min) i altres solucions fisiològiques sobre el múscul.Estudis electrofisiològics convencionals de neurografia motora per determinar potencials motors compostos.Estudis electrofisiològics intracel·lulars per a comprovar l'efecte del sèrum (i la seva component monoclonal) del malalt tant en incubacions agudes com en els músculs tractats crònicament amb les IgManti-GM2.Resultats i conclusions:S'ha portat a terme un estudi sobre el paper del sèrum d'un pacient amb una neuropatia crònica desmielinitzant motora pura i un component monoclonal IgM que mostra afinitat per GM2 en la unió neuromuscular. Els estudis electrofisiològics aguts in vitro han mostrat que les IgM del pacient indueixen una reducció de la transmissió neuromuscular que està provocat per un bloqueig en l'entrada de calci a través dels canals tipus P/Q dependents de voltatge, molt probablement alterant algun mecanisme regulador controlat per gangliòsids. En aquest estudi també hem trobat que els gangliòsids contra els que van dirigits els anticossos del malalt es troben habitualment a nivell de sinapsis neuromuscular (tant en l'axó com en la cèl·lula de Schwann) i en el nervi intramuscular (tant en la beina de mielina com en l'axó motor). Pel que fa a l'aplicació crònica dels anticossos anti-gangliòsids del pacient sobre un múscul d'un mamífer adult el que provoquen són alteracions morfològiques (trobem sinapsis amb creixements i/o retraccions axonals) i alteracions funcionals (tenim un bloqueig de la neurotransmissió i l'aparició d'un nou canal de calci) en les unions neuromusculars. Les neurografies motores d'aquest músculs mostren bloqueig de la conducció axonal. / Objective:To determine the action of anti-gangliosides antibodies of a patient with a chronic motor demyelinating polyneuropathy associated with a IgM monoclonal component on the nerve conduction and on the neurotransmission of a adult mammalian both in a acute and chronic study and, to investigate that the gangliosides are involved in the entry of calcium in the nerve. Methods:Determination the serum specificity of the patient with ELISA and immuneHPTLC techniques using commercial and purified gangliosides of bovine brain, human brain and YAC-1 cells. IgM antibodies purifying with affinity chromatography with goat antibodies against human IgM.Immunehistochemistry techniques to search the antibody fixation at the presynapticc region of the neuromuscular junction. Passive transfer of anti-gangliosides antibodies into the LAL muscle of mice, every 24 h during 15 days. Utilization of prendisolone to reduce the inflammatory response. The controls followed the same protocol but the injection contain desnaturalized IgM (90 ºC, 20 min) and other physiological solution on the muscle. Conventional electrophysiological studies of motor to determinate compost motors action potentials.Intracellular electrophysiological studies to investigate the serum of patient effect (and the this monoclonal component) both in acutes incubations and in the muscles chronically treated with the anti-gangliosides IgM.Results and conclusions:We are made a study about the paper of the serum of a patient with a chronic motor desmielinating polineuropathy associated and an IgM monoclonal component that showed affinity for the GM2 on the neuromuscular junction. The electrophysiological acute studies in vitro have showed that that IgM induced a neuromuscular transmission reduction by the block of calcium entry through the calcium channels dependent voltage P/Q types, probably by the alteration of a regulatory mechanism controlled for gangliosides. In this study we also have found that the gangliosides against the antibodies of patient are normally localized in the region of the neuromuscular synapses (both in the axon and the Schwann cell) and in the intramuscular nerve (both in the myelin and the motor axon). The chronic passive transfer of antibodies anti-gangliosides on the adult mammalian muscle induced morphological alterations, (synapses with sprouts and/or axonal retractions) and functional alterations (neurotransmission block and a new calcium channel were found) on the neuromuscular junctions. In that muscles, the motor neurographies showed axonal conduction block.

Las funciones del hígado son importantes debido a su localización estratégica, entre el sistema digestivo y el resto del cuerpo (la circulación sistémica). La generación de los anticuerpos contra los transportadores de nucleósidos sodio-dependientes rCNT1 (pirimidina preferente) y rCNT2 (purina preferente) permitieron identificar la presencia de estos dos transportadores en hígado. El primer objetivo de esta tesis es establecer la localización y la distribución subcelular de rCNT1 y rCNT2 en hepatocitos de rata. Los hepatocitos representan un 60-80% de la masa celular total del hígado; son células altamente polarizadas y se caracterizan por tener una membrana plasmática diferenciada en tres dominios funcionales diferentes: la membrana basal la apical y la lateral. Por estas características y por ser muy activos metabolitamente, las células hepáticas son un buen modelo para el estudio de las rutas endocíticas. Examinamos la localización subcelular de tres maneras distintas. Primero, detectamos por técnicas de transporte y por Western blot la expresión de CNT1 y CNT2 en fracciones enriquecidas en membranas plasmáticas canaliculares y basolaterales. Segundo, determinamos la cantidad proteica y la distribución de CNT1 y CNT2 en fracciones purificadas de endosomas de hígado de rata, mediante utilización de anticuerpos contra estos transportadores. Tercio, por técnicas de microscopía electrónica. Estos estudios indican que el transportador de nucleosidos CNT1 llega en la membrana canalicular, en la cual el transportador es biológicamente activo, por una ruta indirecta a través de la membrana basolateral. Su inserción se realiza cerca de microdominios especializados enriquecidos en caveolas. CNT2 se detecta de manera casi exclusiva en preparaciones enriquecidas en membranas plasmáticas basolaterales en las cuales el transportador es activo. Estos estudios nos indican que los dos transportadores CNT1 y CNT2 tienen una ubicación diferente en células hepáticas, por lo que estos dos transportadores parecen estar diferencialmente regulados. En la segunda parte de esta tesis examinamos las interacciones entre el transportador concentrativo de adenosina CNT2 y los receptores purinérgicos. Las células hepáticas previamente tratadas, a corto plazo, con el agonista del receptor A1, (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine (RPIA) produce el incremento de la actividad de transporte de CNT2. Este efecto se inhibe en presencia de inhibidores de los canales KATP y se mimetiza en presencia de activadores de dichos canales. Estos estudios revelan que en células hepáticas, la actividad de transporte de CNT2 se regula por activación de los receptores A1, vía los canales KATP. Se ha demostrado también que la inducción de la actividad de transporte de CNT2 mediante la apertura de los canales KATP es dependiente de la activación de la PKC. Por ultimo, observamos que la glicemia y el metabolismo de la glucosa podrían afectar la regulación purinérgica de CNT2 ya que la inducción de la actividad de CNT2 mediante el receptor A1 puede ser modulada con la concentración en glucosa del medio. Estudiamos en la tercera parte de esta tesis el papel del óxido nítrico y de la PKC en la activación post-traduccional de CNT2 en células hepáticas. Medimos la actividad de transporte de CNT2 en células Fao y en cultivo primario de hepatocitos después de incubar las células con diferentes activadores e inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS). El resultado fue que la inhibición de la NOS provoca un aumento de la actividad de transporte de CNT2 de un 60%. Mediante inhibidores de la actividad de la PKC y bloqueadores de los canales KATP, determinamos que la disminución de la concentración intracelular de óxido nítrico contribuye en la activación, a corto plazo, del transportador CNT2 mediante la activación, independientemente de la PKC, de los canales KATP. / INGLÉS:The first part of this these study of the subcellular localization and trafficking of CNT1 and CNT2 in rat hepatocytes. These studies indicated that the Na+-dependent nucleoside transporter CNT1 is present in a caveolin-enriched plasma membrane fraction (CEF), in transcytotic endosomes, and in canalicular membranes isolated from quiescent rat liver in which the transporter appears to be biologically active. Plasma membrane preparations enriched in basolateral markers showed Na+-dependent nucleoside transport activity that is mostly, if not exclusively, accounted for by CNT2, a transporter protein that it is not detected in CEF nor in the endosomal fractions. The two CNT transporters are spatially segregated and that this is due to their localization being regulated by distinct trafficking pathways in hepatocytes. CNT1 as being the first transporter that follows the transcytotic pathway for insertion into the apical side of liver parenchymal cells. The second part is focused on interactions between CNT proteins and purinergic receptors. These studies reveal a novel mechanism of regulation of the high affinity concentrative adenosine transporter, CNT2, via activation of adenosine A1 receptor in liver. This regulation is mediated by the activation of ATP-sensitive K(+) (K(ATP)) channels. The transient increase in CNT2-mediated transport activity triggered by (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine is fully inhibited by K(ATP)-channel blockers and mimicked by a K(ATP) channel opener. The extent of the purinergic modulation of CNT2 can be modulated by the glucose concentration, a finding that indicates that glycemia and glucose metabolism may affect this cross-regulation among A(1)R, CNT2, and K(ATP) channels. The third part involves a study of the effects of endogenous nitric oxide (NO) synthesis on the concentrative adenosine transporter, CNT2. Inhibition of endogenous NO synthesis (using either L-NAME and L-NMMA) in hepatoma FAO cells and in primary cultures of rat hepatocytes increases the functional activity of CNT2. This effect can be reversed by the addition of NO donors. Unlike the purinergic-mediated response, the activation triggered by NO inhibitors is poorly dependent on extracellular glucose, although interestingly, it can still be inhibited by the addition of K(ATP) channels blocker, glibenclamide.

El síndrome antifosfolipídico (SAF) se caracteriza clínicamente por la aparición de fenómenos trombóticos recurrentes, complicaciones obstétricas, tales como abortos o pérdidas fetales recurrentes, y trombocitopenia. Inmunológicamente se define por la presencia de los anticuerpos antifosfolipídicos (AAF), un grupo heterogéneo de autoanticuerpos que reconocen complejos constituidos por fosfolípidos de membrana y proteínas plasmáticas que actúan como cofactores. Los mejor conocidos y que ayudan a establecer el diagnóstico de la enfermedad son los anticuerpos con actividad anticoagulante lúpico y los anticuerpos anticardiolipina. Recientemente se han descrito otros AAF que son capaces de reconocer directamente la proteína que actúa como cofactor en ausencia de fosfolípidos, tales como los anticuerpos anti-beta2 glicoproteína I y los anticuerpos antiprotrombina. El papel de éstos últimos todavía no es bien conocido. Además, aunque parece clara la asociación entre los AAF y la aparición de trombosis, los mecanismos directamente responsables de las mismas tampoco se conocen con exactitud.Nuestra hipótesis de trabajo fue la siguiente: los anticuerpos dirigidos contra la protrombina podrían participar de forma activa en la fisiopatología de las trombosis y su presencia, junto con otros anticuerpos antifosfolipídicos, podría ser de gran ayuda para predecir el riesgo para desarrollarlas. Su capacidad trombogénica podría deberse a una acción inhibitoria sobre el sistema anticoagulante de la proteína C y provocar con ello una resistencia adquirida a la acción de la proteína C activada. Este efecto inhibitorio sobre el sistema de la proteína C alteraría el equilibrio existente a favor de un estado procoagulante. Para verificar la misma se plantearon tres objetivos fundamentales: profundizar en el conocimiento de las características clínicas del síndrome antifosfolipídico, estudiar el papel de los anticuerpos antiprotrombina en su fisiopatología y analizar la resistencia adquirida a la acción de la proteína C activada como un posible mecanismo de las trombosis asociadas a los anticuerpos antifosfolipídicos.Para responder a estos objetivos se diseñaron tres estudios. El primero fue un estudio clínico en el que se analizaron las características clínicas y evolutivas de 100 pacientes diagnosticados de síndrome antifosfolipídico con una mediana del tiempo de seguimiento de 49 meses. Se observó que los pacientes con antecedentes de trombosis tienen un alto riesgo de recurrencias y que la anticoagulación oral administrada de forma indefinida es la mejor profilaxis; además, la administración de tratamiento profiláctico durante el embarazo de las pacientes con el mencionado síndrome reduce de forma considerable el riesgo de abortos o pérdidas fetales. En el segundo estudio se estandarizó una técnica de ELISA para la detección de los anticuerpos antiprotrombina y se estudió su presencia en una serie de 177 pacientes con síndrome antifosfolipídico primario o lupus eritematoso sistémico. Se obtuvo una prevalencia global del 47%, significativamente superior a la observada en el grupo control formado por 87 voluntarios sanos (5%). Además en pacientes con lupus eritematoso sistémico su isotipo IgG constituye un factor de riesgo independiente para el desarrollo de trombosis. Finalmente, en el tercer estudio se analizó la resistencia adquirida a la acción de la proteína C activada, aquella que no era debida a la presencia del factor V Leiden, en 103 pacientes con lupus eritematoso sistémico y en 103 voluntarios sanos. Inicalmente se observó que la presencia del factor V Leiden es baja y similar a la población general (4%). La resistencia adquirida alcanzó una prevalencia aproximadamente del 20% y se asoció de forma significativa con la presencia de los anticuerpos antifosfolipídicos, especialmente con el isotipo IgG de los anticuerpos anticardiolipina y antiprotrombina. Por último su presencia se asoció con una mayor prevalencia de trombosis arteriales y de fracasos de los embarazos. / The main objectives of our work were to reach a higher knowledge about the clinical characteristics of patients with the antiphospholipid syndrome (APS), to study the role of antiprothrombin antibodies in the pathogenesis of this syndrome, and to analyze the acquired activated protein C resistance as a possible thrombotic mechanism in such patients. To answer these objectives three studies were made: The first was a clinical study in which the clinical characteristics and follow-up of 100 patients with the APS were analyzed. The median length of follow-up from time of diagnosis was 49 months. It was observed that patients with APS have a high risk of recurrent thromboses. Moreover, long-term oral anticoagulation seems to be the best prophylactic treatment to prevent recurrences. Prophylactic treatment with aspirin during pregnancy reduced the rate of miscarriages remarkably. In the second study antiprothrombin antibodies were measured by an ELISA previously standardized in our laboratory and their presence was studied in a series of 177 patients with primary APS or with systemic lupus erythematosus. Their prevalence was 47%, significantly higher than in a control group (5%) consisting of 87 healthy volunteers. Moreover, IgG isotype of antiprothrombin antibodies was an independent risk factor for thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Finally, in the third study the clinical significance of acquired activated protein C resistance (not due to the presence of factor V Leiden), was studied in 103 patients with systemic lupus erythematosus and in 103 normal volunteers as the control group. First, the prevalence of factor V Leiden was low and similar to that seen in the whole population (4%). However, the prevalence of the acquired form was higher (20% approximately) and it was significantly associated with antiphospholipid antibodies, mainly with the IgG isotype of anticardiolipin antibodies and antiprothrombin antibodies. Moreover, its presence was associated with a higher prevalence of arterial thrombosis and pregnancy losses.

El efecto deletéreo de la presencia de anticuerpos anti-HLA donante-específicos (ADS) pre-trasplante renal en la supervivencia del injerto a corto plazo quedó patente en las primeras experiencias clínicas en los años 60. Sin embargo, resulta controvertido el papel que juegan los ADS anti-HLA que aparecen post-trasplante. La experiencia preliminar de nuestro grupo de trabajo y de otros sugiere que la aparición de ADS post-trasplante se relaciona con el desarrollo de un episodio de rechazo agudo de características diferenciadas. Diseñamos los estudios que componen esta tesis con objeto de definir adecuadamente el rechazo agudo humoral o rechazo agudo asociado a la aparición de ADS, así como determinar su incidencia, características clínicas, serológicas e histológicas y valorar la eficacia de una propuesta terapéutica alternativa en una población determinada. Estudiamos el grupo de enfermos que recibió un trasplante renal en el Massachusetts General Hospital de Boston entre julio de 1995 y julio de 1999 (n=232). Revisamos la evolución clínica de los 81 receptores que habían sufrido algún episodio de rechazo agudo durante los tres primeros meses post-trasplante; realizamos pruebas cruzadas donante-específicas con los sueros peri-rechazo; utilizamos técnicas de inmunofluorescencia para detectar depósitos de la fracción C4d del complemento en las biopsias correspondientes y examinamos las características histológicas de las mismas con las tinciones tradicionales. Las conclusiones fundamentales de nuestros estudios son las siguientes:1) El rechazo agudo humoral es una entidad clínica y patológica diferenciada que podemos diagnosticar con criterios: -CLÍNICOS: Disfunción renal severa precoz típicamente córtico-resistente y con frecuencia resistente al tratamiento anti-linfocitario convencional.-SEROLÓGICOS: Acompañada de la aparición de anticuerpos donante- específicos en el momento del rechazo, habitualmente IgG anti-HLA de clase I o de clase II (sin descartar un posible papel patogénico de IgM).-HISTOLÓGICOS: Con depósitos difusos de C4d en capilares peritubulares.2)La presencia de sólo dos de los tres criterios anteriores permitiría establecer el diagnóstico de "probable rechazo agudo humoral", en cuyo caso probablemente resulta acertado aplicar la misma pauta terapéutica.3) La incidencia de rechazo agudo humoral en la población estudiada es de 7.7%.4) Los factores de riesgo claramente identificados son: sensibilización (pre-trasplante o histórica) y retrasplante renal.5) El estudio histológico tradicional resulta con frecuencia insuficiente para diagnosticar el rechazo agudo humoral, aunque la presencia de neutrófilos en capilares peritubulares y/o glomerulares, la necrosis fibrinoide arterial o glomerular y la presencia de trombos de fibrina en glomérulos resultan datos sugestivos. En virtud de estos parámetros sugerimos distinguir entre rechazo agudo humoral tipo 1 (con afectación capilar) y rechazo agudo humoral tipo 2 (con afectación arterial) con severidad y pronóstico diferenciados.6) El rescate con plasmaféresis, tacrólimus y micofenolato muestra una eficacia elevada en los casos severos de rechazo agudo humoral (89% de éxito a corto plazo en nuestra serie). Parece aconsejable asociar gamaglobulina policlonal al tratamiento, como medida profiláctica e inmunomoduladora. Fármacos recientemente incorporados al mercado o en fase de estudio clínico podrían constituir alternativas eficaces en el control de las respuestas humorales post-trasplante en el futuro.

Los reservorios del VIH-1 se establecen en fases muy iniciales de la infección. Un estudio reciente documenta la presencia de gran cantidad de ARN vírico en ganglios linfáticos de individuos expuestos dos días después de la aparición de síntomas asociados con la infección aguda, incluso antes de la detección de anticuerpos.También se ha demostrado la existencia de un pequeño pool de células de vida media larga, linfocitos T CD4+ infectados, a partir del cual se puede recuperar el virus mediante técnicas de cultivo ultrasensible, teniendo la mayoría de los linfocitos T CD4+ fenotipo memoria. La vida media de este reservorio es contradictoria, estimándose entre 6 y 43 meses aunque datos recientes sugieren que podría durar más de 60 meses. De todas maneras los linfocitos T CD4+ infectados que permanecen latentes son sólo uno de los reservorios en la infección por el VIH-1 existiendo otros como pueden ser el sistema nervioso central, el semen, el tejido renal y el tejido linfático que es el motivo principal de nuestros estudios.Los principales marcadores para el seguimiento y pronóstico de los pacientes infectados con el VIH-1 son la carga viral plasmática y las subpoblaciones de linfocitos T en sangre periférica. Su eficacia para el estudio de la replicación viral y la inmunodeficiencia o como predictores de la evolución de pacientes con o sin tratamiento ha sido ampliamente demostrada. Sin embargo, en ocasiones, pueden no ser suficiente para el estudio de los cambios acaecidos después de la terapia antirretroviral administrada ya que diversos trabajos han evidenciado discrepancias entre los hallazgos en sangre periférica y en tejido linfático, tanto al valorar la replicación viral como los cambios en los niveles de las subpoblaciones de linfocitos. Incluso se ha descrito la existencia de pacientes con carga viral plasmática indetectable pero con presencia de carga viral en varios compartimentos, entre ellos el tejido linfático. Esto podría explicar casos clínicos de respuesta discordante de pacientes con caída de linfocitos T CD4+ a pesar de tener un buen control de la replicación viralEl manejo de la infección por el VIH-1 se basa actualmente en el uso de tratamientos antirretrovirales altamente efectivos combinados con la monitorización del efecto virológico del tratamiento en plasma. El objetivo de estos tratamientos es suprimir la replicación viral con tal de prevenir el desarrollo de resistencias y la progresión clínica, y permitir así la restauración de la función inmune.En diversos estudios de investigación se produce la discusión de cómo se produce la restauración inmunológica, de cual es la replicación viral residual después de la supresión de la viremia o porque existen discrepancias entre la carga viral y la respuesta de las células CD4+ en algunos pacientes infectados por el VIH-1 que reciben terapia antirretroviral. Este conocimiento de la dinámica de la replicación viral y de las poblaciones linfocitarias es esencial para poder combatir esta infección. Se cree que la CVTL influye sobre la CVP y los parámetros del sistema inmunológico del tejido linfático y de la sangre periférica tanto antes como después de TARGA, además de correlacionarse con los cambios anatomopatológicos en tejido linfático.Está demostrado que los pacientes con CVP < 200 copias/ml y CVTL detectable tienen más posibilidad de fracaso que aquellos con CVTL indetectable. Por lo tanto, el conocimiento de las relaciones entre el tejido linfático y la sangre periférica permitiría identificar marcadores en periferia, más accesibles y repetibles, que nos indicasen qué pacientes están realmente inhibidos en tejido linfático y por tanto tienen menor riesgo de fracaso. Esto permitiría modificar las pautas de TARGA para evitar dicho fracaso. Estos últimos interrogantes y el comportamiento diferente entre la sangre periférica y el tejido linfático ha promovido que las investigaciones actuales profundicen en el estudio de este tejido para poder dilucidar su papel como reservorio de la replicación viral y poder valorar con mayor exactitud el efecto de la medicación antirretroviral y la recuperación inmunológica con inmunoterapia o para pronosticar el tiempo con viremia suprimida después del tratamiento.Siguiendo esta línea, en nuestros estudios, hemos investigado las relaciones entre los cambios producidos en la carga viral y las subpoblaciones de linfocitos en el tejido linfático amigdalar y en sangre periférica con el objetivo de buscar marcadores más exactos para el seguimiento y pronóstico de los pacientes infectados con el VIH-1, así como la influencia de esta carga viral, antes o después de la instauración del tratamiento, en la persistencia de las alteraciones en el sistema inmunológico del tejido linfático1º ARTÍCULO: PREDICTORS OF TONSILLAR TISSUE HIV-1 VIRAL BURDEN AT BASELINE AND AFTER 1 YEAR OF ANTIRETROVIRAL THERAPY. Antiviral Therapyt 8:635-637. ABSTRACT En pacientes naive infectados de forma crónica por el VIH, se observa una correlación entre la carga viral de tejido amigdalar y diferentes parámetros inmunológicos y virológicos de sangre periférica, que no se observan después de 1 año de tratamiento antirretroviral de alta actividad (TARGA). Los regímenes que contienen un inhibidor de la proteasa son los mejores predictores de una buena respuesta virológica en el tejido amigdalar después de un año de TARGA.Palabras clave: carga viral en tejido amigdalar, carga viral plasmática, marcadores, activación inmune.2º ARTÍCULO: IMMUNOARCHITECTURE OF LYMPHOID TISSUE IN HIV-INFECTION DURING ANTIRETROVIRAL THERAPY CORRELATES WITH VIRAL PERSISTENCE. Modern Pathology (2005) 18, 127-136La carga viral plasmática y las determinaciones de las subpoblaciones linfocitarias en sangre periférica son los marcadores usados para monitorizar la infección por VIH. Sin embargo, la replicación viral y la mayoría de los cambios inmunológicos suceden en los tejidos linfoides (TL) Hemos estudiado las biopsias amigdalares de 30 pacientes en estadíos tempranos de la enfermedad, antes del inicio de cualquier tratamiento y después de 12 y 36 meses de tratamiento antirretroviral de alta actividad (TARGA). Se ha investigado el ARN del VIH mediante técnicas de PCR (carga viral en TL), la inmunoexpresión de la proteína p24 viral y la arquitectura del tejido linfoide y subpoblaciones celulares por medio de un morfómetro. La carga viral en TL y la inmunoexpresión de p24, la cual fue encontrada asociada principalmente a células foliculares dendríticas, desciende significativamente después del tratamiento, pero no desaparece en todos los casos, incluso después de 36 meses de tratamiento. Fue observada una mejoría significativa de la arquitectura del TL después del tratamiento, con recuperación de las estructuras foliculares. Estos cambios histológicos se correlacionan con la carga viral en TL. Además, el número de células CD4+ se incrementa, mientras los linfocitos CD8+ y citotóxicos (CD8+granzymeB+) descienden significativamente, la última tanto en el área folicular como interfolicular. Sin embargo estos niveles celulares después del tratamiento no alcanzan los de los pacientes control sanos. Las células naive (CD45RA+) y memoria (CD45RO+) aumentan significativamente después del tratamiento. En conclusión, en la infección por VIH el impacto del tratamiento sólo puede ser establecido completamente en los reservorios de TL, donde la mayoría de los virus se almacenan y se asocian a celulas foliculares dendríticas. TARGA produce una recuperación significativa de la arquitectura del TL y de las subpoblaciones linfocitarias, las cuales estan asociadas a un descenso en la carga viral en TL. Sin embargo estos parámetros estudiados en TL no se restablecen completamente, incluso después de 36 meses de TARGA.Palabras clave: TARGA, VIH, Inmunohistoquímica, tejido linfoide, morfometro, p24.

Esta tesis plantea por primera vez la existencia de canalopatías autoinmunes en el sistema nervioso central, aportando los resultados obtenidos de dos trabajos importantes. Se conocía la existencia de autoanticuerpos contra canales iónicos dependientes de voltaje en síndromes neurológicos periféricos. Dada la asociación entre síndromes que afectan al SNP y síndromes neurológicos centrales, se quiso estudiar si los autoanticuerpos contra canales iónicos dependientes de voltaje presentes en los síndromes neurológicos periféricos, podían estar presentes en síndromes neurológicos centrales. Esto se quiso estudiar en los anticuerpos contra canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC) presentes en el síndrome miasténico de Eaton-Lambert (SMEL). Dada la conocida asociación entre el SMEL y la degeneración cerebelosa paraneoplásica subaguda (DCP), quedaba por determinar si la DCP podía estar asociada o no los anticuerpos anti-VGCC. Posteriormente, se amplió el estudio de los anticuerpos antineuronales contra canales iónicos en asociación con síndromes neurológicos del SNC, a los canales de potasio dependientes de voltaje (VGKC). Se conocía la presencia de anticuerpos anti-VGKC en la neuromiotonía. Surgió la posibilidad de una asociación entre la encefalitis límbica y otros anticuerpos o trastornos. Además, un 40% de los pacientes con encefalitis límbica quedaban por determinar séricamente, por la ausencia de anticuerpos (seronegativos) o la presencia de anticuerpos no caracterizados. Se estudió de la presencia de anticuerpos anti-VGKC en pacientes con una encefalitis límbica, de origen paraneoplásico o idiopático.Con los trabajos realizados, se ha abierto la posibilidad a la existencia de canalopatías autoinmunes en el SNC, como la ataxia causada por la degeneración cerebelosa asociada al cáncer de pulmón de célula pequeña y la encefalitis límbica. La relación causal del anticuerpo con el síndrome neurológico no se ha dilucidado, dado que es difícil demostrar si los anticuerpos son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica o si son sintetizados en el propio SNC, causando la posterior disfunción neuronal.Los anticuerpos descritos hasta ahora en el SNC eran utilizados como marcadores de síndromes paraneoplásicos y por lo tanto, no eran patogénicos y su diana era intracelular. En cambio, los anticuerpos que se han descrito en esta tesis como causantes de las canalopatías autoinmunes son patogénicos y en principio tienen dianas extracelulares: los canales iónicos neuronales. Esta diferencia plantea interesantes preguntas sobre la relación entre el SNC y el sistema inmune. Aunque a nivel práctico, nos permite tener una herramienta diagnóstico-terapéutica frente a pacientes que presenten estos síndromes, pues aquellos pacientes que presentan anticuerpos, especialmente si tienen una encefalitis límbica, responden muy bien a tratamiento inmunosupresor. Por lo tanto, los anticuerpos descritos en esta tesis permiten ser utilizados como un marcador diagnóstico y de control de mejoría clínico-inmunológica. Esto es un avance para manejo de estos pacientes neurológicos.

Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein hormone, the molecule comprises a single polypeptide chain of 165 aminoacids with two disulfide bonds, 1 O-linked (Ser-126), and 3 N-linked (Asn-24, 38, 83) glycans representing about 40 % of the total mass (30 kDa). It is secreted primarily by adult kidneys in response to tissue hypoxia and it is involved in the maturation and ultimately regulation of the level of red blood cells. The recombinant analogue (rhEPO), available since 1989 has found widespread use in the treatment of different diseases. Besides, rhEPO is illicitly used by athletes to boost the delivery of oxygen to the tissue and enhance performance in endurance sports. Current tests to differentiate between endogenous EPO and its recombinant analogues are based on differences in their isoelectric focussing (IEF) profiles and on differences in their molecular weight (SDS-PAGE). In this study, different methods to facilitate the detection of recombinant EPOs and analogues in antidoping control have been developed: A plasmatic EPO immunopurification method; a new screening method based on immunoaffinity techniques to detect the abuse of recombinant erythropietins in urine; and a liquid chromatography-mass spectrometry method that allows to detect the unambiguous differing structure between exogenous EPOs and endogenous, the N-glycolyl-neuraminic acid. / La eritropoetina (EPO) és una hormona glicoproteica formada per una cadena peptídica de 165 aminoàcids que conté dos ponts disulfur, un O-glicà (Ser-126) i tres N-glicans (Asn-24, 38, 83) que representen al voltant d’un 40% de la seva massa molar (~ 30kDa). Es produeix principalment en el ronyó, en resposta a la reducció d’oxigen en el teixits, i estimula l’eritropoesi a la medul·la òssia. La EPO recombinant (rhEPO) s’administra com a fàrmac pel tractament de diferents malalties. També s’ha observat la seva utilització en esportistes amb l’objectiu d’augmentar el nivells d’oxigen als teixits i així incrementar el seu rendiment. Els mètodes que s’utilitzen per diferenciar la EPO orinaria endògena de l’exògena estan basats en diferencies dels seus perfils isoelectroforètics (IEF) o en els seus pesos moleculars (SDS-PAGE). El problema d’aquests mètodes és que són llargs, costosos i només poden utilitzar la orina com a matriu biològica. En aquest estudi, s’ha dut a terme el desenvolupament dels següents mètodes que faciliten la detecció d’EPOs recombinants i anàlegs en el control antidopatge: Un mètode d’immunopurificació d’EPO en plasma; un mètode d’screening ràpid basat en tècniques d’immunoafinitat per detectar l’abús d’ eritropoietines recombinants en orina; i un mètode de cromatografia liquida acoblada a espectrometria de massa que permet detectar una clara diferencia estructural entre la majoria de les EPOs exògenes i la endògena, el N-glicolil-neuraminic àcid.

EGFR is a transmembrane tyrosine kinase receptor from the HER family which, upon ligand stimulation, activates different signaling pathways involved in tumorogenesis. EGFR can be targeted by monoclonal antibodies, as cetuximab and panitumumab, which bind to EGFR preventing ligand stimulation of the receptor. Cetuximab and panitumumab are approved for colorectal cancer treatment. However, its clinical success is uniformily limited by the development of acquired drug resistance. We describe a new mechanism of acquired resistance to cetuximab in colorectal cancer that was due to a missense mutation in the EGFR ectodomain (S492R mutation). Upon chronic exposure to cetuximab, colorectal cancer cell lines acquired S492R mutation and became resistant to the treatment. We observed that cetuximab was not able to bind mutant EGFR. Notably, this amino acid change did not affect the ability of panitumumab to bind to EGFR, and panitumumab effectively suppressed growth of mutant cells. EGFRS492R mutation was detected in 2 out of 10 tumor specimens from patients following progression on cetuximab. One of these patients was subsequently treated with single agent panitumumab yielding a partial response. The S492R mutation defines a novel biomarker of resistance to cetuximab but not to panitumumab in colorectal cancer / EGFR és un receptor transmembrana tirosina cinasa de la família HER el qual, després de l’estimulació mitjançant lligands, activa vies de senyalització involucrades en processos tumorogènics. L’EGFR es pot inhibir amb anticossos monoclonals, com cetuximab i panitumumab, que s’uneixen al receptor prevenint-ne l’activació per part dels lligands. Cetuximab i panitumumab estan aprovats per al tractament del càncer colorectal, però el seu ús es veu limitat per el desenvolupament de resistència adquirida al tractament. Nosaltres describim un mecanisme de resistència adquirida a cetuximab en càncer colorectal degut a l’adquisió d’una mutació en el domini extracel•lular de l’EGFR, la mutació S492R. Durant l’exposició crònica a cetuximab, linies cel•lulars de càncer colorectal van adquirir la mutació S492R tornat-se resistents al tractament. Cetuximab no era capaç d’unir-se a l’EGFR mutat. Aquests canvi d’aminoàcid no afectava a l’habilitat que té panitumumab a unir-se al EGFR, pertant, panitumumab suprimia el creixement de les cèl•lules tumorals mutades. Vam detectar la mutació EGFRS492R en 2 de 10 mostres tumorals de pacients que havien recaigut al tractament amb cetuximab. Un d’aquest pacients va ser posteriorment tractat amb panitumumab obtenint-ne una resposta tumoral parcial. La mutació S492R defineix un nou mecanisme de resistència a cetuximab però no a panitumumab en el tractament del càncer colorectal.

Una de les àrees més prometedores en recerca biomèdica i farmacèutica és el disseny molecular computacional, que intenta establir relacions entre propietats físico-químiques i activitat biològica. L'èxit d'aquestes tècniques depen críticament de la qualitat de la descripció molecular. En aquest sentit, metodologies basades en potencials d'interacció molecular (MIP) són eines útils per la comparació de compostos que presenten comportaments biològics semblants. Aquest projecte desenvolupa eines per comparar molècules basades en la caracterització de llurs MIPs. El programa de similaritat molecular MIPsim ha estat desenvolupat i aplicat a diferents problemes biològics. Aquesta tesi consisteix en quatre estudis científics que mostren l'ús del MIPSim en aliniament molecular, catalisi enzimàtica, en acoratge de molècules dins el lligand i en estudis 3D-QSAR. / One of the most promising areas in biomedical and pharmaceutical research is computer assisted molecular design, which tries to stablish relationships between physicochemical properties and biological activity. The success of these techniques depends critically on the quality of the molecular description. In this sense, methodologies based on molecular interaction potentials (MIP) are useful tools for the comparison of compounds displaying related biological behaviours. This project aims to develop tools to compare 'molecules based on the characterization 'of their MIPs. To this end, the molecular similarity program MIPSim has been further developed and applied to different biological problems. This thesis consists on four scientific studies showing the use of MIPSim for molecular alignment, enzymatic catalysis, ligand-protein docking and 3D-QSAR analyses.