Introducció: La diabetis tipus 1 (DM1) es caracteritza per un procés d'arteriosclerosi accelerat, sent la malaltia coronària la seva primera causa de mort. Aquest augment del risc cardiovascular no s'explica completament pels factors de risc clàssics. Per aquest motiu, en els últims anys, s'han descrit una sèrie de possibles nous factors de risc cardiovascular, coneguts com a "no clàssics", com la inflamació sistèmica de baix grau (ISBG) o la disfunció endotelial. La rigidesa arterial (RA) central es considera un signe d’arteriosclerosi preclínica. En diverses poblacions, l’estudi de la RA mitjançant la velocitat de l'ona del pols aòrtica (VOPa) (gold standard) ha demostrat aportar informació addicional als factors de risc clàssics en la predicció d’episodis cardiovasculars. Tot i que la determinació de la VOPa és relativament senzilla, existeixen pocs estudis realitzats en la DM1. A més a més, els mecanismes fisiopatològics implicats en la seva aparició no estan clarament establerts. Es creu que la RA es desenvoluparia a través d'una complexa interacció entre canvis estructurals (sobreproducció de col·lagen i disminució relativa d'elastina) i funcionals (vasoconstricció) que contribuirien a l’aparició d'aquesta. Objectius: Avaluar la RA central en un grup de persones amb DM1 i sense malaltia cardiovascular prèvia en comparació amb un grup controls sans, i avaluar els possibles mecanismes fisiopatològics implicats en el seu desenvolupament, centrant-nos en el paper de la ISBG i la disfunció endotelial. Mètodes: Estudi de casos i controls incloent un total de 136 individus, 68 casos i 68 controls, aparellats per edat i sexe i tots sense malaltia cardiovascular prèvia. L'anàlisi es va realitzar de forma estratificada per sexe. Es va avaluar la RA central mitjançant la mesura de la VOPa per tonometria d'aplanament. Addicionalment, es van determinar les concentracions sèriques dels marcadors d'ISBG (PCRus, IL-6, sR1TNFα i sR2TNFα, sTWEAK i sCD163) i es va realitzar l'avaluació de la disfunció endotelial mitjançant pletismografia arterial perifèrica i marcadors sèrics (ICAM-1, VCAM-1 i E-Selectina). Resultats: Els individus amb DM1 van presentar un increment de la VOPa en comparació amb els del grup control, diferències que es van mantenir estadísticament significatives després d'ajustar per la resta de factors de risc cardiovascular clàssics. Els homes amb DM1 van presentar un augment de les concentracions sèriques dels marcadors d'ISBG (PCRus, IL-6, sR1TNFα i sR2TNFα), increment que es va associar a l'augment de VOPa. Addicionalment, els pacients amb DM1 van presentar una disminució de les concentracions sèriques de sTWEAK i un augment de les concentracions de sCD163 (només en homes), tot i que cap dels dos marcadors es va associar a l'increment de RA després d'ajustar per la resta de factors de risc cardiovascular. Per últim, les dones amb DM1 van presentar més disfunció endotelial en comparació amb el grup control, no obstant aquest augment no es va associar a l'increment de RA. Conclusions: Els individus amb DM1 sense malaltia cardiovascular prèvia presenten un increment de la VOPa en comparació amb els controls sans, de forma independent de la resta de factors de risc cardiovascular clàssics. Els homes amb DM1 presenten un augment d'ISBG que està associat a l'increment de la VOPa. Les persones amb DM1 presenten una disminució de les concentracions sèriques de sTWEAK i un augment de les de CD163 (homes); no obstant, aquests dos marcadors no s'associen a l'increment de la VOPa en aquesta població. Les dones amb DM1 presenten més disfunció endotelial en comparació amb els controls, tot i que l'augment de disfunció endotelial no s'associa amb l'increment de la VOPa característic de la DM1. / Introduction: Type 1 diabetes (T1DM) results in an accelerated arteriosclerotic process. In fact, coronary heart disease is the major cause of mortality in T1DM. The increased cardiovascular risk is not fully explained by classical cardiovascular risk factors. Recently, other "non-classical" risk factors, such as low-grade inflammation or endothelial dysfunction, have been described that could also be related to increased cardiovascular risk. Central arterial stiffness (AS) is an early sign of arteriosclerosis. Aortic pulse wave velocity (aPWV) is considered the gold standard for measuring AS. aPWV predicts cardiovascular events independently of classical cardiovascular risk factors in several populations. However, studies in T1DM are scarce. Furthermore, the exact mechanisms responsible for the increase in AS in T1DM are not fully understood and are likely to reflect complex interaction between structural (overproduction of abnormal collagen and diminished quantities of normal elastin) and functional changes (vasoconstriction), contributing to the increase in AS. Objectives: To evaluate AS in a group of subjects with T1DM, without previous cardiovascular disease, compared with a control group, and to evaluate the possible pathophysiological mechanisms involved in its increase, focusing on the role of low-grade inflammation and endothelial dysfunction. Methods: Sixty-eight subjects with T1DM and 68 age and sex-matched healthy subjects were evaluated. All statistical analyses were stratified by gender. AS was assessed by aPWV (applanation tonometry). Additionally, serum concentrations of low-grade inflammation markers were assessed (hsCRP, IL-6, sR1TNFα, sR2TNFα, sTWEAK and sCD163). Endothelial dysfunction was assessed by reactive hyperemia peripheral arterial tonometry and by serum concentrations of endothelial dysfunction markers (ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin). Results: Subjects with T1DM had higher aPWV compared with healthy subjects. These differences remained significant after adjusting for classical cardiovascular risk factors. Men with T1DM had higher serum concentrations of low-grade inflammation markers (hsCRP, IL-6, sR1TNFα and sR2TNFα). Low-grade inflammation was associated with the increased in aPWV. Additionally, subjects with T1DM had lower serum concentrations of sTWEAK and higher serum concentrations of sCD163 (only in men), but none of these changes were associated with AS after adjusting for the remaining cardiovascular risk factors. Finally, women with T1DM had more endothelial dysfunction compared with the control group, but this increase was not associated with the increase in aPWV. Conclusions: AS assessed as aPWV is increased in subjects with T1DM without clinical cardiovascular disease, independently of classical cardiovascular risk factors. Men with T1DM have higher serum concentrations of low-grade inflammation markers and this increase is independently associated with AS. sTWEAK is decreased in subjects with T1DM. Additionally, men with T1DM have higher serum concentrations of sCD163. However, these two markers are not associated with AS. Endothelial dysfunction is increased in women with T1DM compared with healthy women, although endothelial dysfunction is not associated with AS in this population.

La Diabetis tipus 1 (T1D) és una malaltia autoimmunitària crònica caracteritzada per la pèrdua selectiva de les cèl·lules beta productores d'insulina del pàncrees. La seva 1111etiologia no està clara encara, però es creu que té un origen multifactorial que involucra factors genètics, ambientals i estocàstics. Quan es perd la tolerància als autoantígens, es produeix una infiltració dels illots pancreàtics per cèl·lules T CD8+, macròfags, cèl·lules T CD4+ i cèl·lules B, entre altres tipus cel·lulars que orquestren la seva destrucció. A la T1D la pèrdua de tolerància s'ha associat a l'existència de defectes funcionals i baixa freqüència de cèl·lules Treg i cèl·lules iNKT en ratolins NOD. Per tant, aquest estudi analitza la funció reguladora de les cèl·lules iNKT humanes aïllades de controls sans i de pacients amb T1D al debut clínic de la malaltia. Les dades mostren que les cèl·lules iNKT tenien la capacitat per suprimir la proliferació de les cèl·lules T efectores. Curiosament, la supressió era depenent de la secreció de citocina IL-13, fenomen que es va confirmar quan es recuperava la proliferació de les cèl·lules T efectores en bloquejar la IL-13 amb un anticòs monoclonal. En canvi, les cèl·lules iNKT derivades de pacients T1D no presentaven capacitat supressora i aquest defecte funcional es va poder relacionar amb una disminució en la secreció d'IL-13. Atès que les cèl·lules iNKT poden modular la funció d'altres cèl·lules immunes, es va analitzar la seva capacitat per cooperar amb cèl·lules Treg i millorar la seva funció reguladora, prevenint millor la destrucció de les cèl·lules beta. Els resultats van mostrar que les cèl·lules iNKT individus sans tenien un efecte adjuvant en la supressió de cèl·lules T efectores per cèl·lules Treg. L’efecte adjuvant era depenent de la secreció de la citocina IL-13 i independent del contacte cèl·lula-cèl·lula. Per entendre el possible paper d'aquestes cèl·lules reguladores a la T1D, es va analitzar la freqüència, la localització anatòmica i la funcionalitat al pàncrees de pacients amb T1D. La freqüència d’ambdós tipus cel·lulars augmentava al pàncrees al debut de la T1D però gairebé desapareixien al pàncrees dels pacients de llarga evolució. Aquests resultats contrastaven amb els obtinguts a ratolins NOD, on la freqüència d'aquestes dues poblacions seguia augmentant a l'etapa diabètica. La distribució també Les cèl·lules iNKT i Treg presentaven una distribució diferencial dins i al voltant dels illots pancreàtics i al teixit exocrí que canviava amb la progressió de la diabetis. Al debut de la malaltia les cèl·lules Treg eren reclutades als illots pancreàtics, mentre que les cèl·lules iNKT es mantenien preferentment al teixit exocrí. Finalment, les cèl·lules iNKT i Treg aïllades del pàncrees d'un pacient amb T1D eren funcionals, és a dir, que les cèl·lules iNKT eren específiques per al glicosfigolípid αGalCer i les cèl·lules Treg suprimien la proliferació de les cèl·lules T efectores. Per tant, el conjunt de dades mostrava que alteracions en la secreció d'IL-13 per cèl·lules iNKT a l'inici de la malaltia podrien conduir a la progressió de la resposta autoimmunitària a la Diabetis tipus 1. A més, la seva cooperació amb cèl·lules Treg i la presència dels dos tipus cel·lulars a l'òrgan diana de la resposta suggerien que la seva cooperació pot tenir lloc in situ i controlar així la destrucció de les cèl·lules beta pancreàtiques. Per tant, les noves dades sobre la funció reguladora de les cèl·lules iNKT, la identificació de glicoesfingolípids que milloren la secreció d’IL-13 per cèl·lules iNKT i la cooperació de Treg i cèl·lules iNKT, proporcionen un punt de partida per al disseny de noves estratègies terapèutiques que permetin eludir les restriccions de les immunoteràpies amb cèl·lules restringides per MHC. / Type 1 Diabetes is a chronic autoimmune disease characterized by the selective loss of insulin producing pancreatic β cells. Its etiology is unclear yet but is thought to have a multifactorial origin involving genetic, environmental and stochastic factors. When tolerance to autoantigens is lost, there is an infiltration of the pancreatic islets with CD8+ T cells, macrophages, CD4+ T cells and B cells, among other cell types that orchestrate their destruction. In T1D tolerance breakdown has been associated to the existence of functional defects and low frequencies of Foxp3+ Treg and iNKT cells in NOD mice. Therefore this study analyzes the regulatory function of human iNKT cells isolated from PBMCS of healthy controls and T1D patients at disease onset. The data show that iNKT cells have the capacity to suppress the proliferation of T effector cells. Interestingly suppression is dependent on the secretion of the cytokine IL-13, a phenomenon that was confirmed when using a blocking antibody to IL-13 resulted on the recovery of T effector cell proliferation. Conversely, regulation was impaired in iNKT cells derived from T1D patients and this functional defect could be related to a decrease in the secretion of IL-13. Since iNKT cells can modulate the function of other immune cells, we analyzed their capacity to interact with Treg cells and improve their regulatory function to better prevent the destruction of pancreatic β cells. The results showed that healthy individuals’ iNKT cells had an adjuvant effect on the suppression of T effector cells by Treg cells. The contribution of iNKT cells was again dependent on the secretion of the immunoregulatory cytokine IL-13 and independent of cell-cell contacts. To understand the possible role of these regulatory cells in T1D, their frequency, anatomical localization and functionality was studied in the pancreas of patients with T1D. We quantified the number of iNKT and Treg cells at different stages of the disease development both in human and NOD mice samples and we analyzed their distribution in and around the pancreatic islets and the exocrine tissue compartment. iNKT and Treg cells showed a differential distribution at disease onset as Tregs were concentrated inside the pancreatic islets while iNKT cells were mainly located in the exocrine tissue. Further, both populations almost disappeared from the pancreas of long-termT1D patients. These results contrasted with those obtained from NOD mice where the frequency of these two populations continued to rise at the diabetic stage. In addition, iNKT and Treg cells isolated from the pancreas of a T1D patient at disease onset were both functional, that is to say that iNKT cells were specific for the glycosphigolipid αGalCer and the Treg cells suppressed the proliferation of T effector cells. Therefore, the set of data shows that alterations in the secretion of IL-13 by iNKT cells at disease onset could lead to the progression of the autoimmune response in T1D. Their cooperation with Treg cells and the presence of both cell types at the target organ of the autoimmune response suggests that their cooperation can take place in situ controlling the destruction of the pancreatic β cells by autoreactive T cells. Thus, the new data on the regulatory function of iNKT cells, the identification of glycosphingolipid agonists enhancing iNKT cells’ IL-13 secretion and the cooperation of Treg and iNKT cells to regulate autoreactive T cells provide a starting point to the design new therapeutic strategies that bypass the constrains of the MHC-restricted immunotherapies.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / INTRODUCTION. It has been demonstrated that Glucagon-like peptide-1 (GPL-1) has a protective effect on endothelial cells. GLP-1 improves endothelial function in diabetes, however the mechanisms underlying the GLP-1 protective effects have not yet been fully elucidated. Additionally, it has been proposed that GLP-1 could restore high glucose - endoplasmic reticulum (ER) stress induction. Recent evidences claim a resistance of GLP-1 action that has been shown in pancreatic 13-cells of diabetic patients. A proposed mechanism to explain this resistance to the GLP-1 action in diabetes is the activation of PKCI3, induced by hyperglycaemia, which is able to reduce the expression of GLP-1 receptor. AIM. The aim of this thesis project was to decipher if GLP-1 acute treatment is able to counteract chronic high glucose-induced damage in Human umbilical Vein Endothelial cells (HUVECs). METHODS. In this study HUVECs were cultured for 21 days under normal glucose (5mmol/L, NG) or high glucose (25mmol/L glucose, HG) concentrations. GLP-1 and Ruboxistaurin were added alone or in combination, 1 hour before cell harvesting. Analysis of GLP-1 receptor protein levels as well as of gene expression of different ER stress-related genes, proliferation markers, antioxidant cell response-related genes and PKA subunits was performed. ROS production was also measured in HUVECs exposed to mentioned treatments. RESULTS. GLP-1 receptor expression was reduced in HUVECs exposed to chronic high glucose concentrations and it was partially restored after treatment with the chemical PKCI3 specific inhibitor, Ruboxistaurin. GLP-1, added as an acute treatment in endothelial cells, had the capacity to induce the expression of detoxifying enzymes Nrf2 targets, to increase transcript levels of scavenger genes, to attenuate the high glucose-induced PKA subunits expression, ER stress and also the apoptotic phenotype of HUVECs only when high glucose-induced PKCI3 overexpression was reduced by Ruboxistaurin. In the same direction, ROS production induced by high glucose was reduced by GLP-1 in the presence of PKCI3 inhibitor. CONCLUSIONS. This study suggests that PKCI3 increase, induced by high glucose, could have a role in endothelial GLP-1 resistance, reducing GLP-1 receptor levels and disrupting GLP-1 canonical pathway. / INTRODUCCIÓN. Se ha demostrado que el Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) tiene un efecto protector sobre las células endoteliales. GLP-1 mejora la función endotelial en la diabetes, sin embargo los mecanismos subyacentes a los efectos protectores de GLP-1 aún no han sido completamente aclarada. Además, se ha propuesto que el GLP-1 podría restaurar la función del retículo endoplasmático (ER), cuyo estés es inducido en condiciones de alta glucosa. Evidencias recientes afirman que existe una resistencia a las propiedades beneficiosas del GLP-1. Esto se ha demostrado en las células beta del páncreas de pacientes diabéticos. Un mecanismo propuesto para explicar esta resistencia a la acción de GLP-1 en la diabetes es la activación de PKCβ, inducida por la hiperglucemia, que se ha visto está involucrada en la reducción de la expresión del receptor del GLP-1 en el endotelio glomerular de modelos animales de diabetes. OBJETIVO. El objetivo de este proyecto de tesis fue descifrar si el tratamiento agudo con GLP-1 puede contrarrestar el daño inducido por condiciones de alta glucosa crónica en las células endoteliales humanas de la vena umbilical (HUVECs) y también corroborar los efectos de dicha molécula en caso de que se inhiba la activación de PKCI3 inducida por las altas concentraciones de glucosa. MÉTODOS. En este estudio las células HUVEC se cultivaron durante 21 días bajo las dos condiciones de glucosa normal (5 mmol/L, NG) o alta glucosa (25 mmol/L, HG). Se añadieron GLP-1 y Ruboxistaurin, el inhibidor específico de PKCI3, solos o en combinación, 1 hora antes de la recolección de células. Se realizó un análisis de los niveles de proteína del receptor del GLP-1, así como de la expresión génica de diferentes relacionados con el estrés del ER, la proliferación, el proceso de apoptosis, y también los genes relacionados con la respuesta antioxidante. La producción de ROS fue además medida en las HUVECs expuestas a los diferentes tratamientos mencionados. RESULTADOS. La expresión del receptor del GLP-1 fue reducida en las HUVECs expuestas a concentraciones de alta glucosa crónica y fue parcialmente restaurada después del tratamiento con el inhibidor específico de PKCI3, Ruboxistaurin. GLP-1, añadido como un tratamiento agudo en las células endoteliales, tuvo la capacidad de inducir la expresión de enzimas desintoxicantes que son dianas de Nrf2, el regulador más importante de la respuesta antioxidante en las células. Además, el GLP-1 aumentó los niveles de transcriptos de los marcadores de estrés de ER inducido por la alta glucosa y los marcadores de proliferación en las HUVECs sólo cuando la sobreexpresión PKCβ inducida por la alta glucosa se redujo en presecia de su inhibidor. En la misma dirección, la producción de ROS inducida por la alta glucosa disminuyó cuando las HUVECs se trataron con GLP-1 en presencia del inhibidor de PKCI3. CONCLUSIONES. Este estudio sugiere que el aumento de PKCβ, inducido por la alta glucosa, podría tener un papel en la resistencia a las acciones protectoras del GLP-1 a nivel endotelial, reduciendo los niveles del receptor del GLP-1 e interrumpiendo su vía canónica.

El treball de recerca que presentem en aquesta memòria ha tingut com a objectius principals aprofundir en l’estudi, per una banda, de la funció efectora dels limfòcits B en la T1D, i, per l’altra, del paper de les cèl·lules del SNP com a dianes en el procés de desenvolupament de la malaltia. Amb aquest objectiu vàrem generar els ratolins NOD transgènics de limfòcits B, el 280.IgH.NOD i el 280.IgH.IgL.NOD, portadors de BCRs amb especificitat per la periferina, i per una altra banda el ratolí NOD knockout pel gen de la periferina, el ratolí NOD.Per-/-. L’estudi d’aquests models ha mostrat que en els ratolins 280.IgH.NOD i el 280.IgH.IgL.NOD la incidència de la malaltia s’incrementa i s’accelera el seu debut, mentre que en el ratolí ratolí NOD.Per-/- la incidència de la malaltia no varia en relació amb el ratolí NOD però en canví sí que s’hi observa un retard lleuger en el debut. Això ens permet concloure que tot i que la periferina és diana de la malaltia de l’atac durant el procés diabetogènic, i per tant és un autoantigen rellevant en la resposta autoimmunitària en la T1D, la resposta contra altres autoantígens fa que aquesta resposta no sigui imprescindible per tal que el procés es desenvolupi plenament. També ens permet concloure que la resposta autoimmunitària contra el SNP està directament lligada al procés diabetogènic. / El trabajo de investigación que presentamos en esta memoria ha tenido como objetivos principales profundizar en el estudio, por un lado, de la función efectora de los linfocitos B en la T1D, y por otro, el estudio del papel de las células del SNP como dianas en el ataque autoinmune. Con este objetivo se generaron los ratones NOD transgénicos de linfocitos B, el 280.IgH.NOD y el 280.IgH.IgL.NOD, portadores de BCRs con especificidad para la periferina, y el ratón NODPer-/-, un ratón knockout por el gen de la periferina. El estudio de estos modelos ha mostrado que tanto en los ratones 280.IgH.NOD como en los 280.IgH.IgL.NOD la incidencia de la enfermedad se incrementa y se acelera el debut, mientras que en el ratón NOD.Per-/- la incidencia de la enfermedad no varia en comparación con el ratón NOD, pero, en cambio, se observa un ligero retraso en el debut de esta. Esto nos permite concluir que aunque la periferina es diana del ataque durante el proceso diabetogéinco, y por lo tanto es un autoantígeno relevante en la respuesta autoinmune en la T1D, la respuesta contra otros autoantígenos hace que la respuesta anti-periferina no sea imprescindible para el desarrollo de la enfermedad. También nos permite concluir que la respuesta autoinmune contra el SNP está estrechamente relacionada con el proceso diabetogénico. / The main objectives of the present study were to explore the role of B cells in T1D, and to analyze the involvement of some functional defects of PNS neurons in promoting the disease. For this purpose we generated the 280.IgH.NOD and the 280.IgH.IgL.NOD mice bearing BCRs with specificity for Peripherin, and on the NOD.Per-/- mouse knockout of the Peripherin gene. The results indicate that whereas diabetes incidence increases and disease onset accelerates in 280.IgH.NOD and 280.IgH.IgL.NOD, disease incidence is unchanged and diabetes onset is slightly delayed in NOD.Per-/-, compared to the NOD mouse. This allows us to conclude that although Peripherin is a target of the autoimmune response and therefore is a relevant autoantigen in T1D, it is not essential for the full development of the disease. Furthermore, the results allow us to conclude that the autoimmune response against PNS is directly linked to the diabetogenic process.

La diabetis de tipus 1 (T1D) és una malaltia autoimmune en què les cèl·lules beta del pàncrees productores d’insulina són atacades pel sistema immunitari propi, la qual cosa provoca la deficiència de la producció d’insulina (insulinopènia) i l’aparició de la malaltia. En aquest treball de recerca es dóna a conèixer una de les dianes moleculars de les cèl·lules beta responsable de la seva mort a causa de l’atac limfocític. L’expressió de la CDK11 sofreix una reducció en les cèl·lules endocrines dels illots pancreàtics durant l’atac autoimmune en el model murí NOD (non obese diabetic) de T1D. El gen que codifica per a la CDK11 té 2 productes gènics en humans: p58 i p110 (p130 en el ratolí). La CDK11p110 està implicada en la transcripció i splicing de l’mRNA i s’expressa al llarg de tot el cicle cel·lular de manera ubiqua. La CDK11p58 s’expressa només durant la mitosi (fase G2/M) i està implicada en els processos apoptòtics. Davant d’aquests fets, s’ha estudiat la relació causal entre la disminució de la CDK11 i el debut diabètic en el ratolí NOD. Es va generar el ratolí NODCDK11HTZ, que tenia 1 al·lel de la CDK11 eliminat, i, per tant, era hemideficient en CDK11. Els ratolins HTZ presentaven una incidència acumulativa de diabetis inferior, comparada amb els ratolins WT, i aquesta millora al fenotip diabètic venia determinada per una resistència de les cèl·lules beta pancreàtiques a l’apoptosi induïda per la infiltració limfocitària. El conjunt de la fisiologia de l’illot pancreàtic no semblava que estigués alterat per l’hemideleció de la CDK11, ja que les proves d’IPGTT i IPITT, així com les fluctuacions de calci intracel·lular, no es veien modificades en els ratolins HTZ. Pel que fa a les poblacions de la infiltració limfocítica, no es veien canvis entre els 2 genotips, tant en el nombre de cèl·lules T, B, macròfags i DC com en el seu estat d’activació. Les proporcions de cèl·lules T reguladores tampoc no es veien modificades com a conseqüència de l’hemideleció de la CDK11. No obstant això, l’efecte protector davant l’apoptosi de l’hemideleció de la CDK11 era dependent de la infiltració limfocítica, ja que els ratolins NOD/SCID CDK11 HTZ i WT no presentaven diferents nivells d’apoptosi beta cel·lular entre ells. A més a més, la diabetogenicitat dels leucòcits derivats dels ganglis limfàtics pancreàtics de ratolins HTZ era la mateixa en transferències adoptives a ratolins NOD/SCID, comparada amb la diabetogenicitat dels leucòcits derivats del ratolins WT. Segons aquests resultats, es pot concloure que l’hemideleció de la CDK11 protegeix els ratolins NOD de la diabetis autoimmune in situ i de manera independent del cicle cel·lular, i inhibeix la mort de la cèl·lula beta quan la infiltració limfocítica ataca els illots dels ratolins NOD. Llavors la repressió de l’expressió de la CDK11 prèvia al debut diabètic de la T1D respondria a un mecanisme protector davant l’apoptosi induïda per inflamació. / La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune donde las células beta pancreáticas productoras de insulina son atacadas por el sistema inmune propio, lo que provoca la deficiencia de la producción de insulina (insulinopenia) y la aparición de la enfermedad. En este trabajo de investigación se da a conocer una de las dianas moleculares de las células beta responsable de la muerte de estas como consecuencia del ataque linfocítico. La expresión de la CDK11 sufre una reducción en las células endocrinas de los islotes pancreáticos durante el ataque autoinmune en el modelo murino NOD (non obese diabetic) de T1D. El gen que codifica para la CDK11 tiene 2 productos génicos en humanos: p58 y p110 (p130 en el ratón). La CDK11p110 está implicada en la transcripción y splicing del mRNA y se expresa a lo largo de todo el ciclo celular de manera ubicua. La CDK11p58 se expresa solo durante la mitosis (fase G2/M) y está implicada en los procesos apoptóticos. Ante estos hechos, se ha estudiado la relación causal entre la reducción de la CDK11 y el debut diabético en el ratón NOD. Se generó el ratón NODCDK11HTZ que tenía un alelo de la CDK11 eliminado, y, por lo tanto, era hemideficiente en CDK11. Los ratones HTZ presentaban una incidencia acumulativa de diabetes inferior comparada con los ratones WT, y esta mejora en el fenotipo diabético venía determinada por una resistencia de las células beta pancreáticas a la apoptosis inducida por la infiltración linfocitaria. El conjunto de la fisiología del islote pancreático no parecía que estuviera alterado por la hemideleción de la CDK11, ya que las pruebas de IPGTT y IPITT, así como las fluctuaciones de calcio intracelular, no se veían modificadas en los ratones HTZ. Además, no se veían cambios en las poblaciones del infiltrado linfocítico, tanto en el número de células T, B, macrófagos y DC como en su estado de activación. Las proporciones de la células T reguladoras tampoco se veían modificadas como consecuencia de la hemideleción de la CDK11. No obstante, el efecto protector frente a la apoptosis de la hemideleción de la CDK11 dependía del infiltrado linfocítico, ya que los ratones NOD/SCID CDK11 HTZ y WT no presentaban distintos niveles de apoptosis beta celular entre ellos. Por último, la diabetogenicidad de los leucocitos derivados de los ganglios linfáticos pancreáticos de ratones HTZ era la misma en transferencias adoptivas a ratones NOD/SCID, comparada con la diabetogenicidad de los leucocitos derivados de los ratones WT. Según estos resultados, se puede concluir que la hemideleción de la CDK11 protege a los ratones NOD de la diabetes autoinmune in situ y de forma independiente del ciclo celular, e inhibe la muerte de la célula beta cuando el infiltrado linfocítico ataca los islotes de los ratones NOD. Entonces la represión de la expresión de la CDK11 previa al debut diabético de la T1D respondería a un mecanismo protector frente a la apoptosis inducida por inflamación. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease in which insulin-producing beta pancreatic cells are attacked by the body’s own immune system, leading to an insulin production deficiency (insulinopenia) and the appearance of the disease. This thesis unveils one of the molecular targets involved in beta cell apoptosis caused by lymphocytic attack. CDK11 expression is reduced in the endocrine cells of the islets of Langerhans during the autoimmune attack in the murine model NOD (Non Obese Diabetic) of T1D. CDK11 has two gene products in humans: p58 and p110 (p130 in mouse). CDK11p110 is involved in mRNA transcription and splicing and is expressed ubiquitously throughout the cell cycle. CDK11p58 is expressed only during mitosis (G2/M phase) and is involved in apoptotic procedures. Faced with these events, the causal relationship between CDK11 reduction and diabetes onset in the NOD mouse has been studied. The NODCDK11HTZ mouse, which had one CDK11 allele deleted and was therefore CDK11 hemideficient, was produced. HTZ mice had a reduced accumulative diabetes incidence compared with WT mice, and this improvement in the diabetic phenotype incidence was determined by a resistance of beta pancreatic cells to apoptotic cell death induced by the lymphocytic infiltrate. Overall islet physiology did not seem to be altered by the hemideletion of CDK11 gene, because IPGTT and IPITT tests, as well as intracellular calcium flux, were not modified in HTZ mice. Moreover, the lymphocytic infiltrate populations presented the same number of T, B macrophages and DCs in both genotypes, as well as the same activation level. Furthermore, T regulatory cell ratios were not modified as a consequence of CDK11 hemideletion. However, the protective effect against apoptosis by CDK11 hemideletion required the lymphocytic infiltrate, since NOD/SCID CDK11 HTZ and WT mice did not show different betacell apoptotic levels. Finally, pancreatic lymph node leucocyte diabetogenicity of HTZ mice was the same as WT mice when they were adoptively transferred to NOD/SCID mice. Bearing these results in mind, it can be concluded that CDK11 hemideletion protects NOD mice from autoimmune diabetes in situ in a cell cycle-independent manner, inhibiting beta cell death when the lymphocytic infiltrate attacks the islets of Langerhans of NOD mice. Therefore, CDK11 downregulation prior to T1D onset corresponds to a protective mechanism against inflammation induced beta cell apoptosis.

La polineuropatía diabética es una complicación muy frecuente en la diabetes tipo 2, el factor de riesgo más importante de ulcera y está involucrada en la mayoría de amputaciones no traumáticas del pie. Su evolución es lenta y silenciosa y, una vez establecida, es sustancialmente irreversible. Disponer de más factor tiempo para una prevención secundaria de la polineuropatía diabética realmente efectiva requiere nuevos enfoques en la investigación de sus marcadores de riesgo. OBJETIVOS: Investigar posibles marcadores de riesgo, innovadores o poco estudiados, de polineuropatía diabética. METODOLOGIA. Se realizaron tres estudios observacionales en muestras aleatorias de personas con diabetes tipo 2: 1) Descriptivo transversal para evaluar la relación entre los niveles circulantes del Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-beta-1) total y la presencia de polineuropatía diabética; 2) Prospectivo de seguimiento a tres años explorando el polimorfismo ("I/D" inserción/ delección) del gen del enzima conversor de la angiotensina (ACE) como factor de riesgo de desarrollar polineuropatía diabética; 3) Prospectivo de seguimiento a diez años, analizando la presencia previa de enfermedad cardiovascular y su relación con la aparición posterior de polineuropatía diabética. RESULTADOS: El TGF-beta-1 aparece como una molécula biomarcadora importante para la detección de polineuropatía diabética. El genotipo (D/I) del gen del ACE se erige como un factor protector en el desarrollo de la polineuropatía diabética. A los diez años de seguimiento, las personas con diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular al inicio del estudio presentaron mayor riesgo de desarrollar polineuropatía diabética. CONCLUSIONES: Los tres estudios aportan resultados orientados a identificar personas susceptibles de desarrollar polineuropatía diabética. La posibilidad de que dicha identificación se lleve a cabo antes de sus manifestaciones clínicas permitiría anticipar las medidas de prevención secundaria e intensificar las actuaciones sobre sus factores de riesgo. / La polineuropatia diabètica és una complicació molt freqüent en la diabetis tipus 2, el factor de risc més important d'úlcera i està involucrada en la majoria d'amputacions no traumàtiques del peu. La seva evolució es lenta i silenciosa i, una vegada establerta, és substancialment irreversible. Disposar de més factor temps per una prevenció secundària de la polineuropatia diabètica realment efectiva exigeix nous enfocaments en la investigació dels seus marcadors de risc. OBJECTIUS: Investigar possibles marcadors de risc, innovadors o poc estudiats, de polineuropatia diabètica. METODOLOGIA: Es varen fer tres estudis observacionals en mostres aleatòries de persones amb diabetis tipus 2: 1) Descriptiu transversal per avaluar la relació entre els nivells circulants del Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-beta-1) total i la presència de polineuropatia diabètica; 2) Prospectiu de seguiment a tres anys explorant el polimorfisme ("I/D" inserció/delecció) del gen de l'enzim conversor de l'angiotensina (ACE) com a factor de risc de desenvolupar polineuropatia diabètica; 3) Prospectiu de seguiment a deu anys, analitzant la presència prèvia de malaltia cardiovascular i la seva relació amb l'aparició posterior de polineuropatia diabètica. RESULTATS: El TGF-beta-1 apareix com una molècula biomarcadora important per la detecció de polineuropatia diabètica. El genotip (D/I) del gen de l'ACE s'erigeix com un factor protector en el desenvolupament de la polineuropatia diabètica. Als deu anys de seguiment, les persones amb diabetis tipus 2 i malaltia cardiovascular a l'inici de l'estudi presentaren major risc de desenvolupar polineuropatia diabètica. CONCLUSIONS: Els tres estudis aporten resultats orientats a identificar persones susceptibles de desenvolupar polineuropatia diabètica. La possibilitat que aquesta identificació es dugui a terme abans de les seves manifestacions clíniques permetria anticipar les mesures de prevenció secundària i intensificar les actuacions envers els seus factors de risc. / Diabetic Polyneuropathy (DPN) is the commonest of its microangiopathic complications. It is the main risk factor for ulcers and is involved in the majority of non-traumatic lower extremity amputations. Its natural history is silent and insidious; nevertheless, once established it substantially irreversible. Hence, new research strategies on DPN risk factors are needed to provide health practitioners with more time for a more efficient secondary prevention. OBJETIVES: To look after for novel or surrogate DPN risk factors METHODOLOGY: three observational studies were performed on randomly selected samples of patients with Type 2 Diabetes mellitus (T2DM): 1) Descriptive cross-sectional study designed to evaluate the relationship between circulating plasma Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-beta-1) and the presence of DPN; 2) Prospective (three years of follow-up) study exploring the Angiotensin-converting enzyme (ACE) gene single polymorphism ("I/D" insertion/ deletion) as a genetic biomarker of the risk factor for DPN development; 3) Prospective (10 years of follow-up) study assessing the relationship between DPN development and a history of previous cardio-vascular disease (CVD). RESULTS: TGF-beta-1 appears as an important biomarker molecule for DPN screening. The (D/I) genotype of the ACE gene polymorphism stands as a protective factor in the development of DPN. After ten year of follow-up, those T2DM patients with prior history of CVD disclose a higher risk of developing DPN. CONCLUSIONS: the three aforementioned studies provide results oriented at identifying potential candidates to develop DPN. This identification is likely to be performed prior to the development of DPN clinical manifestations. The latter would allow implementation of secondary prevention measures and intensify the treatment of its risk factors.

La hepatopatía alcohólica es un proceso multifactorial y entre los mecanismos implicados en su desarrollo cabe destacar la producción de acetaldehído, la disminución selectiva de los niveles de glutation (GSH) mitocondrial y la hipoxia en la zona centrilobular del hígado consecuencia del metabolismo oxidativo del etanol. Una de las características predominantes del daño hepático inducido por el alcohol en el hígado, son las alteraciones morfológicas y funcionales que se observan en las mitocondrias. Por tanto, uno de los objetivos de la presente tesis fue evaluar: 1. El papel del acetaldehído en la regulación y transporte de glutation a la mitocondria, así como en la composición lipídica y las propiedades físicas de la membrana mitocondrial.El primer trabajo aporta información sobre el mecanismo implicado en la disminución selectiva de glutation mitocondrial, debido al consumo crónico de etanol. El acetaldehído, el primer metabolito del metabolismo oxidativo del etanol, redujo la afinidad (aumento la Km) de los dos componentes implicados en el transporte de GSH a la mitocondria y esto fue acompañado de una disminución de los niveles de glutation mitocondrial (mGSH). Esta disfunción en el transporte de mGSH se relacionó con un aumento en la viscosidad de la membrana mitocondrial consecuencia de un aumento en los niveles de colesterol en la mitocondria. Por otro lado, el acetaldehído indujo la expresión de los factores GADD153, marcador de estrés en el retículo endoplasmático, y SREBP-1, implicado en la activación de enzimas responsables de la síntesis de colesterol. Por ultimo, el descenso en los niveles de mGSH, sensibilizó las células HepG2 a los efectos citotóxico del TNF-alfa.Hay evidencias que muestran un deposito de colesterol en la membrana mitocondrial, lo que conlleva una disminución de la fluidez de la bicapa lipídica. Dada la implicación de la apertura del poro mitocondrial a citoquinas (TNF-alfa, Fas) en la hepatopatía alcohólica y con el fin de esclarecer las consecuencias que tiene el aumento en colesterol sobre el proceso de la permeabilidad transitoria mitocondrial (MPT), nos planteamos:2. Evaluar el efecto de la fluidez de la membrana mitocondrial inducido por el colesterol sobre la apertura del poro mitocondrial.El enriquecimiento de colesterol en mitocondrias de hígado de rata fue acompañado de una resistencia a la apertura del poro mitocondrial inducida por el agente atractilósido. Como consecuencia de ello, se observó una disminución en la liberación de los factores proapoptóticos : citocromo C, Smac/DIABLO y factor inductor de apoptosis (AIF). El aumento en la rigidez de la membrana mitocondrial debido a la acumulación de colesterol se relacionó con esta falta de respuesta al atractilósido, ya que la fluidificación de la membrana mitocondrial restauró la respuesta a este agente. Por tanto, el proceso de la permeabilidad transitoria mitocondrial muestra un dependencia a las propiedades fisicoquímicas de la membrana mitocondrial.El estado hipermetabólico inducido en los hepatocitos por el metabolismo del etanol, da lugar a un desequilibrio entre la demanda y aporte de oxígeno a lo largo del acino hepático, lo que desencadena una hipoxia relativa en los hepatocitos perivenosos respecto a los periportales. En diversos estudios se involucra a la mitocondria como sensor celular frente a la hipoxia, al generar de radicales libres (ROS) que actúan como segundos mensajeros. Puesto que el mGSH es la única defensa antioxidante frente a los ROS mitocondriales, decidimos estudiar :3. El papel del glutation mitocondrial en la supervivencia celular durante la hipoxia.La exposición de las células HepG2 a un 5% de oxígeno provocó un aumento de radicales libres procedentes de la mitocondria que actúan como segundos mensajeros sobre los factores de transcripción NF-kappa-B y HIF-1alfa. Ambos factores mostraron su actividad transactivadora al inducir la expresión de sus genes diana : TNF-alfa, cIAP2 y VEGF. Bajo estas circunstancias las células no sufrieron cambios en la viabilidad celular, pero la disminución de los niveles de GSH y más en concreto del pool mitocondrial durante la hipoxia, provocó un aumento en la producción de ROS desencadenando la muerte celular. Nuestros resultados muestran que el glutation mitocondrial es un factor crítico en el control de la viabilidad celular en respuesta a la hipoxia.

El objetivo general de esta Tesis Doctoral es profundizar en el conocimiento sobre la insuficiencia renal, una complicación frecuente y asociada a mal pronóstico que pueden presentar los pacientes con cirrosis hepática. Los trabajos diseñados para tal objetivo están enfocados por un lado, a investigar la capacidad predictiva de mortalidad de la clasificación de pacientes acorde al grado de ACLF sobre la clasificación AKIN y a evaluar eficacia y seguridad del tratamiento con vasoconstrictores de los pacientes con SHR tipo-1 y sepsis asociada . El resultado principal del primer estudio fue que la clasificación ACLF tiene una mayor capacidad predictiva de mortalidad a 28 y 90 días en comparación con la clasificación AKIN. Se evaluó la clasificación de ACLF en todos los pacientes al momento de la inclusión y a las 48 horas, y la clasificación AKIN a las 48 horas (puesto que se basa en los cambios en la concentración sérica de creatinina en dos determinaciones distintas obtenidas con una diferencia de 48 horas). El 19,2% de los pacientes desarrollaron AKI durante las primeras 48 horas después de la inclusión. Los pacientes que desarrollaron AKI presentaron un marcado deterioro de la función hepática y niveles más elevados de CrS, recuento de leucocitos y proteína C reactiva. La presencia de AKI ha demostrado tener una asociación estadio-dependiente con el pronóstico. La presencia de ACLF en el momento de la inclusión estuvo asociada fuertemente con la mortalidad. La clasificación ACLF fue superior a la AKIN para predecir la mortalidad libre de trasplante tanto a los 28 como a los 90 días. Se analizó también la presencia y grado de ACLF luego de las 48 horas de la inclusión y coincidiendo con el tiempo en que deben determinarse los valores de creatinina sérica para el diagnóstico de AKI según los criterios AKIN. El segundo estudio proporciona evidencia que indica que el tratamiento con terlipresina y albúmina es eficaz y seguro para el SHR tipo-1 asociado a sepsis. El tratamiento con terlipresina y albúmina produce una mejora del volumen arterial efectivo y este efecto hemodinámico es beneficioso logrando revertir el SHR tipo-1 en el 67% de los pacientes. Los resultados de este estudio apoyan el concepto de que, independientemente de la presencia de infección bacteriana, los mecanismos fisiopatológicos del SHR tipo-1 son similares. La falta de respuesta al tratamiento con terlipresina y albúmina no parece estar relacionada con la gravedad de la disfunción circulatoria presente en el momento previo al inicio del tratamiento ni a un efecto hemodinámico insuficiente logrado con el tratamiento, con el retraso en el inicio del tratamiento con vasoconstrictores, con la mayor gravedad del SHR tipo-1 (determinado por los niveles de CrS previos al inicio del tratamiento), ni con la presencia de daño tubular renal significativo (evaluado mediante la medición b-2 microglobulina y NGAL, biomarcadores de daño tubular renal, antes del comienzo del tratamiento). El hallazgo más atractivo ha sido la relación observada entre la respuesta al tratamiento y la gravedad del ACLF. Nuestros resultados muestran que el tratamiento no fue eficaz en pacientes con ACLF muy severo, como se indica por un CLIF-SOFA Score igual o mayor que 11, mientras que si fue eficaz en pacientes con ACLF menos grave (CLIF-SOFA Score < 11). / Cirrhosis is a chronic liver disease that accounts for approximately 1 to 2% of all deaths in Europe. Prognostic stratification of patients with cirrhosis is a common clinical practice. The first study that composes this doctoral thesis compares the prognostic accuracy (28-day and 90-day transplant- free mortality) of the Acute-on-Chronic Liver Failure (ACLF) classification to that of Acute Kidney Injury (AKI) classification. The study was performed in 510 patients with an acute decompensation of cirrhosis. The presence of ACLF and AKI were strongly associated with mortality. ACLF classification was more accurate than AKI classification in predicting 90-day mortality in the whole series of patients. Moreover, assessment of ACLF classification at 48 hours had significantly better prognostic accuracy compared to that of both AKI classification and ACLF classification at enrollment. The major conclusion of this study is that the ACLF stratification is more accurate than AKI stratification in the prediction of short-term mortality in patients with acute decompensation of cirrhosis. The second study was designed with the aim to investigate the effects of early treatment with terlipressin and albumin on circulatory and kidney function in patients with type-1 HRS and sepsis and assess factors predictive of response to therapy. In this prospective study 18 consecutive patients with type-1 HRS associated with sepsis were included. Treatment was associated with marked improvement in arterial pressure and suppression of the high levels of plasma renin activity and norepinephrine. Response to therapy was achieved in 12/18 patients (67%) and was associated with improved 3-month survival compared to patients without response. Non-responders had significantly lower baseline heart rate, poor liver function tests, slightly higher serum creatinine, and higher Child-Pugh and MELD scores compared to responders. Interestingly, non- responders had higher values of CLIF-SOFA score compared to responders (14 ± 3 vs. 8 ± 1, respectively p <0.001), indicating greater severity of acute-on-chronic liver failure (ACLF). A CLIF-SOFA score ≥11 had 92% sensitivity and 100% specificity in predicting no response to therapy. No significant differences were observed between responders and non-responders in baseline urinary kidney biomarkers. Treatment was safe and no patient required withdrawal of terlipressin. Conclusions: Early treatment with terlipressin and albumin in patients with type-1 HRS associated with sepsis is effective and safe. Patients with associated severe ACLF are unlikely to respond to treatment.

La tesis dirige la atención hacia las caídas en los pacientes con cirrosis, un problema que hasta ahora no había sido objeto de estudio en estos pacientes, pese a sus importantes consecuencias por lo que respecta a morbilidad, mortalidad, calidad de vida y coste económico y social. Los dos estudios que componen la tesis analizan el problema de las caídas en los pacientes con cirrosis desde diferentes perspectivas. Se incluye en los anexos un estudio previo que realiza un análisis retrospectivo en una cohorte de pacientes con cirrosis hepática. En este primer artículo se describe por primera vez como la presencia de trastornos cognitivos (encefalopatía hepática mínima) se asocia a la presencia de caídas en estos pacientes. Este estudio supone el punto de partida de esta tesis, que incluye dos estudios clínicos que evalúan la relación entre las caídas, el deterioro cognitivo y la calidad de vida en los pacientes con cirrosis. El primer estudio de la presente tesis analiza de forma prospectiva el valor predictivo del Psychometric Hepatic Encephalopathy Score (PHES), como instrumento para evaluar el deterioro cognitivo, para identificar a aquellos pacientes con cirrosis con riesgo de caídas. Este estudio incluye una cohorte prospectiva compuesta por 122 pacientes seguidos durante un año, y confirma la relación entre deterioro cognitivo y caídas. Los resultados tienen elevada trascendencia, ya que se establece un método para identificar a los pacientes cirróticos con alto riesgo de caídas: la presencia de un valor alterado en los resultados de la batería neuropsicológica que constituye el PHES. Los pacientes con PHES alterado tuvieron una probabilidad de presentar caídas del 52.3% al año de seguimiento. Cabe destacar el elevado uso de recursos sanitarios (hospitalización, estancias en urgencias y consultas ambulatorias) como consecuencia de las caídas y la identificación de otros factores que intervienen en el incremento del riesgo de caídas, como son el género femenino y los fármacos antidepresivos. En el segundo estudio se analiza la relación entre caídas y calidad de vida desde una perspectiva física y mental en los pacientes con cirrosis mediante el cuestionario de calidad de vida SF-36. Este estudio demuestra la importancia de las caídas en el deterioro de calidad de vida que sufren los pacientes con cirrosis, ya que las caídas fueron un factor independiente relacionado con peor calidad de vida en el análisis multivariado. Otros factores asociados con el deterioro de la calidad de vida fueron: el género femenino, la presencia de anemia, la hiponatremia, el antecedente de hemorragia digestiva y el deterioro cognitivo. En resumen, los estudios que componen la presente tesis demuestran como las caídas son un problema importante en los pacientes con cirrosis, establecen un método (el PHES) para identificar a los pacientes con alto riesgo de caer, y demuestran que las caídas en la cirrosis, además de otras consecuencias como complicaciones y hospitalizaciones, son un factor importante en el deterioro de calidad de vida. / The thesis directs attention towards falls in patients with liver cirrhosis, a problem that until now had not been studied in these patients, despite its important consequences regarding morbidity, mortality, quality of life impairment and economic and social costs. The two studies included in the thesis analyze the problem of falls in patients with cirrhosis from different perspectives. A previous study carried out a retrospective analysis in a cohort of patients with cirrhosis and is included in the annexes. In this first article it was described for the first time how the presence of cognitive impairment (minimal hepatic encephalopathy) is associated with falls in these patients. This study represents the starting point of this thesis, which includes two clinical studies evaluating the relationship between falls, cognitive impairment and quality of life in patients with cirrhosis. The first study of this thesis prospectively analyzed the predictive value of the Psychometric Hepatic Encephalopathy Score (PHES), as an instrument to assess cognitive impairment, to identify those patients with cirrhosis at risk of falls. This study includes a prospective cohort composed by 122 patients followed for one year, and confirms the relationship between cognitive impairment and falls in cirrhosis. The results of this study establish a method to identify cirrhotic patients with high risk of falls: the presence of an altered value in the results of the neuropsychological battery that constitutes the PHES. Patients with altered PHES showed a probability of falling of 52.3% at one year-follow-up. It is interesting to point out the high use of health resources (hospitalization, stays in emergency room and outpatient consultations) as a result of falls, as well as the identification of other factors involved in the increase of the risk of falls in patients with cirrhosis, such as female gender and antidepressant drugs. The second study analyzes the relationship between falls and quality of life from a physical and mental perspective in patients with cirrhosis using the quality of life SF-36 questionnaire. This study demonstrates the importance of falls in the deterioration of quality of life in patients with cirrhosis, since previous falls were an independent factor associated with worse quality of life in the multivariate analysis. Other factors associated with impaired quality of life were: female gender, the presence of anemia, hyponatremia, previous gastrointestinal bleeding and cognitive dysfunction. In summary, the studies that compose the present thesis demonstrate that falls are a significant problem in patients with cirrhosis, establish a method (the PHES) to identify patients at high risk of falling, and demonstrate that falls are an important factor in the deterioration of quality of life in cirrhosis.

Tesi realitzada en el Laboratori de Diabetes i Obesitat de l’IDIBAPS / El pàncrees és una glándula secretora formada per teixit exocrí i endocrí. El compartiment endocrí està format per les cèl.lules alfa(productores de glucagó), les cèl.lules beta (productores d’insulina), les cèl.lules delta (somatostatina), les cèl.lules PP (polipèptid pancreàtic) i las cèl.lules epsilon (grelina). La Diabetis Mellitus és un grup de malalties metabòliques que es caracteritzent per mantenir nivells elevats de glucosa en sang com a resultat de la incapacitat de produir o utilitzar insulina. Actualment, el tractament de la diabetis es basa en injeccions periòdiques d’insulina. Per solucionar i millorar la vida d’aquests pacients hi ha molts grups que treballen per trobar nous fonts de cèl.lules productores d’insulina que puguin recuperar la massa de cèl.lules beta perduda durant la diabetis. Per a tal fi, és necessari conèixer en detall els pasos que succeèixen per generar una cèl.lula productora d’insulina a partir de cèl.lules indiferenciades. Durant l’organogènesi pancreàtica s’activen un conjunt de factors de transcripció que són essencials per a la correcta formació de l’òrgan, entre ells el factor proendocrí Neurogenina3 (Neurog3). Neurog3 és un factor de transcripció de la família bHLH que té un paper fonamental en la diferenciació endocrino-pancreàtic, ja que en la seva absència no es formem cap dels llinatges endocrins del pàncrees. Math6 és un altre factor de transcripció bHLH que s’expressa en el pàncrees embrionari però es desconeix la seva funció específica. El gen de Math6 es induit per Neurog3 en cèl.lules en cultiu, fet pel qual es va proposar que Math6 funcionaria per sota de Neurog3 en el programa de diferenciació endocrino-pancreàtica. L’objectiu general d’aquesta tesi doctoral ha estat ampliar el coneixement sobre el paper de Math6 en el desenvolupament pancreàtic. En el primer objectiu hem realitzat una caracteriztació bioquímica de l’activitat transcripcional de Math6, on els resultats mostren que actua com un repressor transcripcional. En el segon objectiu hem identificat gens regulats per Math6 durant la diferenciació endocrina emprant microarrays d’expressió en un model cel.lular de diferenciació endocrina. Aquest model es basa en l’expressió de Neurog3 en cèl.lules ductals pancreàtiques, on hem sobreexpresat o silenciat Math6. L’estudi de canvis globals en el perfil d’expressió gènica d’aquestes cèl.lules ens ha permés identificar la regulació del cicle cel.lular com a funció potencial de Math6. Aquestes dades han estat corroborades a nivell funcional al demostrar que el silenciament gènic de Math6 inhibeix la proliferació i produeix l’acumulació de les cèl.lules en les fases G2/M del cicle. Hem demostrat també que una disregulació del complex cicinaB1/Cdk1 podria ser el causant d’aquest canvi en la distribució de les cèl.lules al llarg del cicle cel.lular. En el tercer objectiu, hem caracteritzat el model gen-anul.lat específic de pàncrees de Math6 durant el desenvolupament pancreàtic i la seva funció pancreàtica adulta. A estadi P1 (dia del naixement), observem un augment de les cèl.lules beta sense canvis evidents en altres tipus cel.lulars endocrins, l’animal no desenvolupa cap fenotip funcional. L’ànalisi de l’expressió génica realitzat als estadis e14.5-15.5 (moment de màxima expansió endocrina) mostra una disminució a e14.5 dels factors de diferenciació endocrina Neurog3, NeuroD1 i Nkx6.1, indicant cert endarreriment en l’activació del programa de diferenciació endocrina. Per tant, amb aquesta tesi hem demostrat l’activitat transcripcional represora de Math6 i hem definit la seva dèbil intervenció en el programa de diferenciació endocrina. Addicionalment, hem identificat per primera vegada la relació de Math6 i el control de la progressió del cicle cel.lular. / The bHLH transcription factor Neurogenin3 (Neurog3) initiates the endocrine differentiation program in the embryonic pancreas. We previously identified the bHLH factor Math6 as a component of the pancreatic transcriptional cascade downstream of Neurog3. Math6 is found in Neurog3+ endocrine progenitors and, mirroring Neurog3, is down-regulated in mature islet cells. While Math6 is essential for early embryonic development, the function of this factor during endocrine differentiation remains elusive. This thesis has aimed to gain insight into the molecular function of Math6 during the endocrine differentiation program initiated by Neurog3 in the pancreas. In the first objective we have done a biochemical characterization of the transcriptional activity of Math6, where the results have shown that it acts a transcriptional repressor. In the second objective, we have identified Math6’s target genes during the endocrine differentiation process using microarrays in a cellular model (mouse ductal cells). The study of global changes in the expression profile of these cells has allowed us to identify the cell cycle regulation as a potential function of Math6. All the data have been functionally corroborated, Math6 silencing inhibits the cellular proliferation and produces an increase in the number of cells in G2/M phases. We have also demonstrated that the deregulation of the cyclinB1/Cdk1 complex could be the cause of these changes along the cell cycle phase distribution. In the third objective, we have characterized the Math6 pancreas specific KO mice model during development and adulthood. At P1 stage (day of birth), we observe an increase in somatostatin cells but not in other endocrine cells, and the animal does not develop any functional phenotype. The gene expression profile at e14.5-15.5 (maxim endocrine expansion) shows a decrease in the expression of Neurog3, NeuroD1 and Nkx6.1, suggesting a delay in the activation of the endocrine differentiation program. In summary with this work we have demonstrated that Math6 possess a repressor transcriptional activity and we have defined that it has a weak role in the endocrine differentiation program. Moreover, these results uncover for the first time a potential function of Math6 as a regulator of cell cycle progression.