Tesi realitzada a l'Institut d’Investigacions Biomédiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / By performing a translational study we identified a specific pattern of genes differentially regulated in patients with severe alcoholic hepatitis (AH). A functional analysis of the gene expression profile showed several pathways deregulated in AH, including cytokines- cytokine receptor interaction. Within cytokine-cytokine receptor interaction pathway, Fn14 has been identified as the only receptor belonging to TNF superfamily to be exclusively up-regulated in patients with AH, and its expression has been shown to be associated with severity of the disease and mortality. We observed that Fn14 is upregulated in experimental models of progenitor cell expansion and co-expressed with Ep-CAM in livers of patients with AH, suggesting that Fn14 may regulate ductular reaction expansion. Moreover, we showed that Fn14 hepatic expression is regulated by ethanol and pro-fibrogenic factors, suggesting that alcohol abuse together with fibrogenic mediators may be directly responsible for the induction of Fn14 expression in ALD. Furthermore, transcriptome analysis identified CCL20 as the most up-regulated cytokine in the liver of patients with AH. Hepatic expression and serum levels of CCL20 have been found elevated in patients with AH and have been showed to be associated with key clinical features of the disease such as fibrosis, endotoxemia and short-term mortality. These data suggest that besides playing a role in AH pathogenesis, CCL20 may also be considered as a potential non-invasive biomarker. We found that CCL20 hepatic expression is up-regulated in acute, chronic and acute-on chronic experimental model of liver injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) and lipopolysaccharide (LPS) and their combination, respectively. Macrophages and hepatic stellate cells have been identified as the main CCL20 producing cell types in experimental models of acute-on-chronic liver injury. Moreover, we have showed that CCL20 exerts pro-fibrogenic and pro-inflammatory and effects on primary human hepatic stellate cells and on macrophages, suggesting that CCL20 may participate in both hepatic fibrosis and inflammation during liver disease in an autocrine and paracrine manner. Finally, we have found that CCL20 mediates LPS-induced liver injury by promoting hepatocellular apoptosis, expression of pro-inflammatory and pro-fibrogenic mediators and by enhancing macrophages and neutrophils infiltrate recruitment. In conclusion, during this thesis we performed two studies leading to the identification of new potential targets for therapy in AH. The identification of Fn14 and CCL20 as new potential targets for therapy in AH and their correlations with key hallmarks of the disease such as ethanol consumption, fibrosis, progenitor cells expansion and endotoxemia underline the complexity of this disease and the crosstalk between many mediators that occurs in AH. The data presented in this thesis suggest that cytokines and cytokine-receptor pathway could represent a new potential target for therapy in ALD; and also provide new important insights and a useful resource for the study of the pathogenesis of this disease. / El consumo de alcohol es una de las causas más importantes de mortalidad que pueden prevenirse en nuestro país. La hepatitis alcohólica (HA) se caracteriza por un proceso de inflamación hepática (fundamentalmente por infiltración de células polimorfonucleares), esteatosis masiva hepática, fibrosis pericelular y daño hepatocelular. En la actualidad no existen tratamientos efectivos para el tratamiento de la HA y por esta razón, existe una clara necesidad de identificar nuevas dianas terapéuticas para tratar a estos pacientes en los diferentes estadios de la enfermedad (esteatosis, inflamación y/o fibrogénesis). El objetivo principal de esta tesis fue investigar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la HA. Para alcanzar dicho objetivo, realizamos estudios traslacionales que permitieran identificar marcadores biológicos alterados en muestras humanas procedentes de hígados de pacientes con HA para estudiar la función que tienen en el desarrollo de la enfermedad in vitro e in vivo en modelos animales de diferentes tipos de daño hepático y valorar si podrían considerarse como dianas terapéuticas. Mediante la performación de nuestros estudios, identificamos a la vía de citoquinas-receptores de citoquinas como una de las vías con el mayor número de genes diferentemente regulados en pacientes con HA con respecto a controles sanos. Estudios en muestras humanas y en modelos animales de daño hepático nos permitieron identificar al receptor de citoquinas Fn14 y a la citoquina CCL20 como importantes mediadores de la HA, correlacionados tanto con aspectos clínicos característicos así como con la gravedad de la enfermedad. La vía de citoquinas y receptores de citoquinas y, de manera específica Fn14 y CCL20 han sido identificados como novedosos mediadores implicados en la patogénesis de la HA y por lo tanto como potenciales dianas terapéuticas. Por lo tanto, gracias a la identificación de un patrón de los genes diferentemente regulados en la HA, nuestros datos proporcionan importantes resultados novedosos para el estudio de la patogénesis de la HA.

Los progenitores hematopoyéticos (PH) criopreservados previamente con dimetilsulfóxido cuando se infunden en el trasplante causan efectos adversos. Utilizando un procedimiento de depleción de dimetilsulfóxido mediante un sistema automático y cerrado, estudiamos la seguridad (ausencia de incremento del riesgo de contaminación bacteriana y número de reacciones adversas durante la infusión) y la eficacia del procedimiento de lavado (recuentos de células CD34+ y cultivo de colonias granulomacrofágicas, eritroides y megacariocíticas, así como los tiempos de injerto leucocitario y plaquetar y los requerimientos transfusionales) en 128 trasplantes (64 con PH lavados y 64 con PH no lavados en serie retrospectiva). Tras la depleción no encontramos diferencias estadísticas en la cifra de células CD34+ ni en la viabilidad celular en las muestras pre y postlavado. Tampoco demostramos inferioridad en días de injerto de leucocitos y neutrófilos entre ambos grupos. No documentamos reacción adversa durante las infusiones del grupo experimental, existiendo diferencias respecto al grupo control. / Usually, hematopoietic progenitors (HP) with dimethylsulfoxide previously cryopreserved when infused into the transplant cause adverse effects. We use a depletion dimethylsulfoxide procedure through automated and closed system. We study the safety (lack of increase in the risk of microbial contamination and the ocurrence of adverse reactions during infusion) and efficacy of the washing process (CD34 + cells count and granulomacrophages, erythroid and megakaryocytic colonies number, leukocyte and platelet engraftments and transfusion requirements) in 128 transplants (64 HP washed versus 64 HP unwashed in retrospective serie). No significant differences were found between the pre- and postwashing CD34+ cell counts or viability. No significant differences were observed between washed and nonwashed infusions in relation to the day of the leukocytes and neutrophils engraftment. Significant differences between washed and nonwashed groups were found, as no adverse reaction during infusions were documented in the washed group.

En el marco del trasplante autólogo de progenitores de sangre periférica (TASPE), cincuenta pacientes diagnosticadas de cáncer de mama fueron incluidas en un estudio prospectivo en el que se evaluaba el contenido basal de progenitores CD34+/ CD71- en médula ósea (M.O.), como parámetro predictivo de la movilización de células CD34 tras G-CSF. Además, se estudió el papel del G-CSF, tanto a corto plazo como en la regeneración de progenitores medulares al año del procedimiento. El G-CSF post-TASPE demostró acelerar la recuperación de neutrófilos, pero no hubo diferencias significativas en la recuperación plaquetaria, soporte transfusional, días de fiebre, administración de antibióticos o de estancia hospitalaria. Respecto a los precursores hematopoyéticos en M.O. un año después del TASPE, se encontraron concentraciones más bajas del total de células CD34+, tanto comprometidas (CD34+/CD33+), como inmaduras (CD34+/CD71-) en pacientes tratadas con G-CSF al compararlas con aquellas que no recibieron la citoquina. La administración de G-CSF post-TASPE no parece afectar significativamente el resultado del procedimiento, pero podría comprometer la hematopoyesis medular a largo plazo. / In the setting of autologous peripheral blood stem cell transplantation (APBSCT), fifty patients diagnosed with breast cancer were included in a prospective study evaluating the bone marrow (BM) CD34+/CD71- cell content, as a predictive parameter of the CD34 cell mobilization after rhG-CSF. We also analyzed data to compare post APBSCT rhG-CSF administration in terms of the short-term benefit and myeloid marrow regeneration after 1 year. Post-APBSCT rhG-CSF was shown to accelerate neutrophil recovery, but there were no significant differences in platelet recovery, transfusion requirements, days of fever, antibiotic administration or inhospital stay. With regard to BM hematopoietic precursors 1 year after APBSCT, significantly lower concentrations of total CD34+ cells, committed CD34+/CD33+ subsets, and more immature CD34+/CD71- cells, were found in patients treated with rhG-CSF compared with patients not having received the cytokine. Post-APBSCT rhG-CSF administration does not appear to beneficially affect procedure outcome, but might even impair long-term marrow hematopoiesis.

Introducció: El pronòstic de les alteracions del cromosoma 17 (cr17) en les síndromes mielodisplàstiques (SMD) de novo es incert. L’IPSS-revisat les inclou dins el grup de risc intermedi. Hipòtesi: Les alteracions del cr17 en pacients amb SMD de novo confereixen un mal pronóstic en quant a supervivència global (SG) i transformació a leucèmia aguda mieloide (LAM). El tipus d’anomalia del cr17 i el nombre d’alteracions citogenètiques associades condiciona el pronòstic del pacients. El FISH de 17p és útil per identificar casos amb alteracions del c17 no detectats per citogenètica convencional (CC). Pacients i mètodes: Estudi comparatiu multicèntric a partir d’una sèrie recollida pel Grupo Español de SMD (GESMD). Analitzem les característiques clíniques i factors pronòstics de 88 pacients amb SMD de novo i alteracions del cr17. Es comparen els resultats amb 1070 pacients amb alteracions cromosòmiques que no afecten al cr17. Es realitza FISH de 17p en 531 pacients amb SMD de novo, 30 d’ells amb alteracions del cr17 detectades por CC. Resultats: La incidència de d'alteracions del cr17 és del 2.4% (88 pacients) en el Registro Español de SMD (RESMD) amb una mitjana d'edat de 71.8 anys. Aquests pacients presenten característiques tipificades com de mal pronòstic: el 70% presenten excés de blastes, cariotip complex i s'inclouen en categories de mal pronòstic segons el IPSS. 66 pacients han estat èxitus (75%) amb una mitjana de SG de 8.7 mesos. El 31% van evolucionar a LAM. El i(17q) es presenta més freqüentment com alteració única o amb una altra addicional (p<0.001 ). El -17 i add(17p) es presenten més freqüentment amb un cariotip complex (p<0.001 i p<0.008 ). En els pacients amb cariotip complex, la presència de i(17q) no s’associa a un pitjor pronòstic, a diferència de quan hi ha -17 (p=0.038). Els resultats de l'anàlisi multivariant mostren que el cariotip complex i -17 són factors pronòstics independents per SG. Per a la transformació a LAM, només el cariotip complex ha resultat ser un factor pronòstic independent. S'han comparat les dades de SG i transformació a LAM dels 88 pacients amb alteracions del cr17 amb 1070 pacients amb alteracions cromosòmiques sense cr17 implicat. Els pacients amb alteracions del cr17 tenen menor SG (8.7 vs 30.0 mesos, p<0.001) i major risc de transformació a LAM (31% vs 22%, p<0.060) que el grup sense cr17 implicat. En el grup de cariotip complex, els 62 pacients amb alteracions del cr17 tenen menor SG que els 175 pacients sense cr17 implicat (5.4 vs 8.7 mesos, p=0.017). 10 pacients van presentar del(17p) per CC, aquesta deleció no es va confirmar per FISH i es van retirar de l'estudi. S'han estudiat 501 casos, sense deleció de 17p per CC, mitjançant FISH de 17p (locus de TP53) i s'han detectat 13 casos (2.6%) de pacients amb -17 o alteracions de 17p . En pacients amb cariotip alterat per CC però sense el cr17 implicat, la pèrdua de 17p es detecta en un 4.7%. En el grup de pacients amb cariotip normal per CC, la pèrdua de 17p es detecta en un 0.9% dels casos . Conclusions: Les anomalies del cr17 i el nombre d'alteracions citogenètiques associades condiciona el pronòstic en pacients amb SMD de novo. Els pacients amb i(17q) presenten un pronòstic de tipus intermedi, com descriu el IPSS-R. -17 s'associa a un pitjor pronòstic en els pacients amb cariotip complex. L'estudi mitjançant FISH de 17p s’hauria de realitzar en pacients amb citogenètica alterada sense evidència pèrdua de 17p . / Introducción: El pronóstico de las alteraciones del cromosoma 17 (cr17) en síndrome mielodisplásicos (SMD) de novo es incierto. El IPSS-Revisado incluye estas alteraciones en el grupo de riesgo intermedio. Hipótesis: Las alteraciones del cr17 en SMD de novo confieren mal pronóstico en términos de supervivencia global (SG) y trasformación a leucemia aguda mieloide (LAM). El tipo de anomalía del cr17 y número de alteraciones citogenéticas asociadas condiciona el pronóstico de los pacientes. El uso de FISH de 17p es útil para detectar casos con alteraciones del cr17 no detectados por citogenética convencional (CC). Pacientes y métodos: Estudio cooperativo multicéntrico a partir de una serie recogida por el Grupo Español de SMD (GESMD). Analizamos las características clínicas y factores pronósticos de 88 pacientes con SMD de novo y alteraciones del cr17. Se comparan los resultados con 1070 pacientes con alteraciones cromosómicas que no implican al cr17. Se realiza FISH de 17p en 531 pacientes con SMD de novo, 30 de ellos con alteraciones del cr17 detectadas por CC. Resultados: La incidencia de alteraciones del cr17 es del 2.4% (88 pacientes) en el Registro Español de SMD (RESMD) con una mediana de edad de 71.8 años. Estos pacientes presentan características tipificadas como de mal pronóstico: el 70% presentan exceso de blastos, cariotipo complejo y se incluyen en categorías de mal pronóstico según el IPSS. 66 han sido éxitus (75%) con una mediana de SG de 8.7 meses. El 31% evolucionaron a LAM. El i(17q) se presenta más frecuentemente como alteración única o con otra adicional (p<0.001). El -17 y add(17p) se presentan más frecuentemente con un cariotipo complejo (p<0.001 y p<0.008). En los pacientes con cariotipo complejo, la presencia de i(17q) no se asociació a un peor pronóstico, a diferencia de cuando hay -17 (p=0.038). Los resultados del análisis multivariante muestran que el cariotipo complejo y -17 son factores pronósticos independientes para SG. Para trasformación a LAM, sólo el cariotipo complejo ha resultado ser un factor pronóstico independiente. Se han comparado los datos de SG y transformación a LAM de los 88 pacientes con alteraciones del cr17 con 1070 pacientes con alteraciones cromosómicas sin cr17 implicado. Los pacientes con alteraciones del cr17 tienen menor SG (8.7 vs 30.0 meses; p<0.001) y mayor riesgo de transformación a LAM (31% vs 22%; p<0.060) que el grupo sin cr17 implicado. En el grupo de cariotipo complejo, los 62 pacientes con alteraciones del cr17 tienen menor SG que los 175 pacientes sin cr17 implicado (5.4 vs 8.7 meses; p=0.017). 10 pacientes presentaron del(17p) por CC; dicha deleción no se confirmó por FISH y se retiraron del estudio. Se han estudiado 501 casos, sin deleción 17p por CC, mediante FISH de 17p (locus de TP53) y se han detectado 13 casos (2.6%) de pacientes con -17 o alteraciones de 17p. En pacientes con cariotipo alterado por CC pero sin el cr17 implicado, la pérdida de 17p se detecta en un 4.7%. En el grupo de pacientes con cariotipo normal por CC, la pérdida de 17p se detecta en un 0.9% de los casos. Conclusiones: Las anomalías del cr17 y el número de alteraciones citogenéticas asociadas condiciona el pronóstico de los pacientes con SMD de novo. Los pacientes con i(17q) presentan un pronóstico de tipo intermedio, como describe el IPSS-R. -17 se asocia a un peor pronóstico en los pacientes con cariotipo complejo. El estudio mediante FISH de 17p debería realizarse en pacientes con citogenética alterada sin evidencia de pérdida de 17p. / Introduction: The prognosis of patients diagnosed of de novo myelodysplastic syndrome (MDS) with alterations of chromosome 17 (cr17) is uncertain. The R-IPSS includes these patients in the intermediate risk group. Hypothesis: Alterations of cr17 in patients with de novo MDS confer a poor prognosis in terms of overall survival (OS) and transformation to acute myeloid leukaemia (AML). The type of cr17 anomaly and the number of associated cytogenetic abnormalities is associated with the prognosis of patients. The FISH 17p is useful for detecting cases with undetected cr17 alterations by conventional cytogenetics (CC). Patients and Methods: We done a multicenter cooperative study from a series of de novo MDS patients collected by the Grupo Español de SMD (GESMD). We analyzed the clinical characteristics and prognostic factors of 88 patients with de novo MDS and abnormalities involving cr17. We compared these results with 1070 patients with chromosomal alterations not involving cr17. FISH 17p was performed in 531 patients with de novo MDS, 30 of them with abnormalities of cr17 detected by CC. Results: The incidence of abnormalities of cr17 is 2.4% (88 patients) in the Registro Español de SMD (RESMD) with a median age of 71.8 years. These patients presented characteristics associated with a poor prognosis: excess of blasts, complex karyotype and were included in categories with poor prognosis of the IPSS. 66 patients were exitus (75%) with a median OS of 8.7 months. 31% progressed to LAM. The i(17q) is presented most often in patients with a single or twice chromosome alteration (p<0.001). The -17 and add(17p) occurs more frequently in patients with a complex karyotype (p<0.001 and p<0.008). In patients with complex karyotype, the presence of i(17q) is no associated with a worse prognosis, unlike when -17 is presented (p=0.038). The results of the multivariate analysis show that the complex karyotype and -17 are independent prognostic factors for OS. Complex karyotype is an independent prognostic factor for transformation to LAM,. We compared the data of SG and LAM transformation of the 88 patients with abnormalities of cr17 with 1070 patients with chromosomal abnormalities not involving cr17. Patients with alterations of cr17 have lower SG (8.7 vs 30.0 months, p<0.001) and increased risk of transformation to AML (31 % vs 22%, p<0.060) than the group without alterations of cr17 involved. In the group of patients with complex karyotype, 62 patients with alterations of cr17 have lower SG that 175 patients without alterations of cr17 involved (5.4 vs 8.7 months, p=0.017). 10 patients had del(17p) by CC, but the deletion was not confirmed by FISH and the patients were retired from the study. 501 cases, without 17p deletion by CC, were studied using FISH 17p (locus TP53) and we detected 13 cases (2.6%) with -17 or 17p alterations. The loss of 17p was detected in 4.7% of patients with altered karyotype by CC but without the cr17 involved. The loss of 17p was detected in 0.9% of the patients with normal karyotype by CC. Conclusions: Abnormalities of cr17 and the number of associated cytogenetic alterations are associated with the prognosis of patients with de novo MDS. Patients with i(17q) have a intermediate prognosis, as stated by the IPSS-R. -17 is associated with a worse prognosis in patients with complex karyotype. The study of 17p by FISH should be performed in patients with cytogenetic abnormalities without evidence of loss of 17p.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / Un aspecte central, tant en el desenvolupament de la diabetis tipus 1 com en el de la tipus 2, és la reducció del nombre de cèl·lules beta productores d’insulina, i en ambdues condicions la pèrdua de massa beta s’ha atribuït en gran mesura a l’augment de la mort de les cèl·lules beta. A més, diversos treballs han posat de relleu la contribució fonamental de la replicació de les cèl·lules beta pel manteniment fisiològic i la regeneració de la massa de cèl·lules beta en models amb massa beta reduïda, la qual cosa pot suggerir que l’alteració de la replicació de les cèl·lules beta també pot contribuir de manera important a la reducció de la massa beta en la diabetis. El trasplantament d’illots és una teràpia prometedora per la curació de la diabetis mellitus, amb la que s’ha aconseguit un control acurat de la glucèmia de l’individu. Ara bé, el trasplantament d’illots presenta algunes limitacions importants, una de les principals és la baixa disponibilitat d’òrgans i la seva elevada demanda, agreujada per l’alt nombre d’illots requerits per restablir la normoglucèmia, probablement a causa de la important pèrdua de massa beta que té lloc els primers dies post-trasplantament. Aquesta pèrdua es deu als alts nivells d’apoptosi i de necrosi de les cèl·lules beta i a la seva limitada proliferació incapaç de compensar la mort. La interleucina 1 (IL-1) té un paper clau en la destrucció de les cèl·lules beta pancreàtiques que es dóna en la diabetis mellitus tipus 1 i tipus 2. A més, la citocina juga un paper important en l’increment de la mort beta que té lloc durant els primers dies després del trasplantament d’illots pancreàtics. El factor de creixement similar a la insulina 2 (IGF2) és un potent factor de creixement que té un rol important promovent la diferenciació i la proliferació cel·lular i actuant com a factor de supervivència en limitar l’apoptosi en diferents tipus cel·lulars. Per tant, IGF2 pot tenir un doble rol beneficiós en la massa de cèl·lules beta, actuant com a mitogen i com a factor de supervivència per les cèl·lules beta. La hipòtesi general del projecte és que el pronòstic del trasplantament d’illots pot millorar amb la utilització d’estratègies orientades a incrementar la supervivència i la replicació de les cèl·lules beta. L’objectiu general és determinar si la sobreexpressió d’IGF2 en els illots pancreàtics millora la supervivència i la regeneració de les cèl·lules beta pancreàtiques. L’objectiu de l’estudi in vitro fou caracteritzar l’efecte de la IL-1β sobre la replicació i supervivència de les cèl·lules beta i la potencial modulació per IGF2. L’objectiu de l’estudi in vivo fou determinar l’efecte de la sobreexpressió d’IGF2 sobre la massa beta trasplantada. En l'estudi in vitro, illots de rata control no infectats i illots infectats amb l’adenovirus que codifica per l’IGF2 (Ad-IGF2) es van cultivar durant 48h a 5,5 o 22,2 mM de glucosa en presència o absència de 1, 10, 30, i 50 U/ml d'IL-1β. La proliferació de les cèl·lules beta es va veure dràsticament reduïda quan els illots es van exposar a 10 U/ml d’IL-1β i es va suprimir gairebé completament en els illots exposats a 30 i 50 U/ml d’IL-1β. Concentracions més elevades de la citocina van ser necessàries per augmentar l’apoptosi de les cèl·lules beta de manera significativa. Malgrat la sobreexpressió d’IGF2 té un fort efecte mitogènic sobre les cèl·lules beta, IGF2 va preservar la replicació de les cèl·lules beta només en els illots exposats a 10 U/ml d’IL-1β, i no va tenir efecte en els illots exposats a altes concentracions de la citocina (30 i 50 U/ml). En contrast, la sobreexpressió d’IGF2 va presentar una clara protecció contra l’apoptosi induïda per IL-1β, pel que van ser necessàries concentracions superiors de la citocina per induir un augment significatiu de l’apoptosi respecte els illots control. Aquests resultats indiquen que la replicació de les cèl·lules beta és altament sensible als efectes deleteris de la IL-1β, com s’observa per la inhibició de la replicació per concentracions d’IL-1β relativament baixes, i la supressió quasi completa de la replicació de les cèl·lules beta per altes concentracions de la citocina. A més, els efectes inhibitoris de la IL-1β sobre la replicació de les cèl·lules beta no es van modificar per la glucosa, i van ser només modestament evitats per la sobreexpressió d’IGF2, en contrast amb la protecció proporcionada per la glucosa i per la sobreexpressió d’IGF2 contra l'apoptosi induïda per la IL-1β. En l'estudi in vivo, illots infectats amb l’adenovirus que codifica per l’IGF2 (grup Ad-IGF2), la luciferasa (grup control Ad-Luc), o amb illots no infectats (grup control) van ser trasplantats a rates Lewis diabètiques per estreptozotocina. Es van trasplantar 800 illots, que es una massa beta subcrítica, o 500 illots, que és una massa clarament insuficient per restaurar la normoglicèmia. Les rates trasplantades amb 800 illots que sobreexpressaven IGF2 van mostrar una millor evolució metabòlica respecte els grups control. Com era d'esperar, les rates trasplantades amb 500 illots que sobreexpressaven IGF2 o amb illots control van presentar una hiperglucèmia similar al llarg de tot l'estudi, assegurant condicions metabòliques comparables entre ambdós grups. La replicació de les cèl·lules beta va ser superior en el grup Ad-IGF2 vs el grup control els dies 3, 10, i 28 després del trasplantament. La massa beta es va reduir de manera similar el dia 3 després del trasplantament en el grup Ad-IGF2 i el grup control, es va incrementar el dia 10 i a dia 28 va ser superior en els empelts que sobreexpressaven IGF2. L'apoptosi es va incrementar de manera similar en ambdós grups, Ad-IGF2 i control, després del trasplantament. No es van trobar diferències en la secreció d'insulina entre els illots Ad-IGF2 i els illots control no infectats. En resum, la sobreexpressió de IGF2 en illots trasplantats va augmentar la replicació de cèl·lules beta, aquest increment de la replicació en els empelts d'illots que sobreexpressen IGF2 es va traduir en la regeneració de la massa beta trasplantada, fet que es reflectí en la millora del pronòstic del trasplantament. En conjunt, aquests resultats suggereixen que estratègies dirigides a augmentar la proliferació beta poden ser útils per induir la regeneració de la massa beta pel tractament de la diabetis i en el trasplantament d’illots. / β-Cell mass reduction has a central role in the development of type 1 and type 2 diabetes, and in both conditions the loss of β-cells has been largely attributed to increased β-cell death. Furthermore several reports have highlighted the fundamental contribution of β-cell replication to the physiological maintenance of β-cell mass, and to β-cell mass regeneration in models with reduced β-cell mass. This may suggest that impaired β-cell replication could contribute to the reduction of β-cell mass in diabetes. Islet transplantation restores normoglycemia in type 1 diabetic patients. However, islet transplantation presents some important limitations. A basic restriction is the low organ availability and high requirement, which is exacerbated by the high islet mass that must be transplanted to achieve normoglycemia, probably due to the massive destruction of islets taking place in the initial days after transplantation due to increased beta-cell apoptosis, necrosi and impaired beta-cell replication. IL-1β is an important contributor to β-cell damage in type 1 diabetes, and recently it has also been related to the development of type 2 diabetes. IL-1beta also could contribute to the dramatic beta cell loss that takes place after islet transplantation IGF2 is a growth promoting peptide which is able to stimulate cell differentiation, proliferation and survival. Thus, IGF2 may play a dual beneficial role on β-cell mass, acting both as a mitogenic and as a survival factor for β-cells. We investigated in vitro and in vivo effects of the IGF2 overexpression on β-cell survival and regeneration. The aim of the in vitro study was to characterise the effect of IL-1β on β-cell replication, and the potential modulation by IGF2. Since the induction of β-cell proliferation by IGFs is dependent on ambient glucose concentration, low and high glucose concentrations were used to better define the effects of IL-1β and IGF2 on β-cell replication. The aim of the in vivo study was to determine the effect of IGF2 overexpression on β-cell mass in transplanted islets. In the in vitro study, control-uninfected and adenovirus encoding for IGF2 (Ad-IGF2)-infected rat islets were cultured at 5.5 or 22.2  mmol/l glucose with or without 1, 10, 30, and 50 U/ml of IL-1β. β-Cell replication was markedly reduced by 10 U/ml of IL-1β and was almost nullified with 30 or 50 U/ml of IL-1β. Higher concentrations of IL-1β were required to increase β-cell apoptosis. Although IGF2 overexpression had a strong mitogenic effect on β-cells, IGF2 could preserve β-cell proliferation only in islets cultured with 10 U/ml IL-1β, and had no effect with 30 and 50 U/ml of IL-1β. In contrast, IGF2 overexpression induced a clear protection against IL-1β-induced apoptosis, and higher concentrations of the cytokine were needed to increase β-cell apoptosis in Ad-IGF2-infected islets. These results indicate that β-cell replication is highly sensitive to the deleterious effects of the IL-1β as shown by the inhibition of replication by relatively low IL-1β concentrations, and the almost complete suppression of β-cell replication with high IL-1β concentrations. Likewise, the inhibitory effects of IL-β on β-cell replication were not modified by glucose, and were only modestly prevented by IGF2 overexpression, in contrast with the higher protection against IL-1β-induced apoptosis afforded by glucose and by IGF2 overexpression. In the in vivo study, islets infected with adenovirus encoding for IGF2 (Ad-IGF2 group), for luciferase (Ad-Luc control group), or with uninfected islets (control group) were syngeneically transplanted to streptozotocin-diabetic Lewis rats. Eight hundred islets, a minimal mass model to restore normoglycemia, or 500 islets, a clearly insufficient mass, were transplanted. Rats transplanted with 800 Ad-IGF2 islets showed a better metabolic evolution than control groups. As expected, rats transplanted with 500 Ad-IGF2 or control islets maintained similar hyperglycemia throughout the study, ensuring comparable metabolic conditions among both groups. β-Cell replication was higher in Ad-IGF2 group than in control group on days 3, 10, and 28 after transplantation. β-Cell mass was similarly reduced on day 3 after transplantation in Ad-IGF2 and control group, it increased on day 10, and on day 28 it was higher in Ad-IGF2 than in control group. Apoptosis was similarly increased in Ad-IGF2 and control islets after transplantation. No differences in insulin secretion were found between Ad-IGF2 and uninfected control islets. In summary, IGF2 overexpression in transplanted islets increased β-cell replication, induced the regeneration of the transplanted β-cell mass, and had a beneficial effect on the metabolic outcome reducing the β-cell mass needed to achieve normoglycemia. Taken together, these results suggest that strategies aimed to preserve or increase the engrafted β-cell mass may be useful for inducing the regeneration of beta mass for the treatment of diabetes and in islet transplantation.

Increased intrahepatic vascular resistance (IHVR), mainly due to elevated vascular tone together with the maturation of hepatic fibrosis and the drop of the hepatic endothelial function, is the main factor in the development of portal hypertension (PH) in cirrhosis. This PhD thesis investigates the cellular and molecular mechanisms necessary for the identification of new therapeutic targets and evaluates the possible cross- talk between the hepatic cells in static and physiological conditions (shear stress). Study 1: Leptin is a pro-oxidant and pro-fibrotic hormone increased in patients with cirrhosis. Therefore, we evaluated whether leptin could influence the increased IHVR in PH. Cirrhotic animals with portal hypertension received the leptin receptor blocking antibody (OBR-Ab), or its vehicle, every other day for 1 week. In cirrhotic rats, leptin-receptor blockade significantly reduces portal pressure without modifying portal blood flow, suggesting a reduction in the intrahepatic resistance. Portal pressure reduction is associated with increased nitric oxide bioavailability and with decreased O2 levels and nitro-tyrosinated proteins. Thus, the blockade of the leptin signaling pathway in cirrhosis significantly reduces portal pressure, probably due to a nitric oxide-mediated reduction in the hepatic vascular tone. Study 2&3: Statins improve hepatic endothelial function and liver fibrosis in experimental models of cirrhosis, thus they have been proposed as therapeutic options to ameliorate portal hypertension syndrome. In cirrhosis, the transcription factor Kruppel-like factor 2 (KLF2) is early over-expressed during the progression of the disease, nevertheless it is not enough to slow down the development of vascular dysfunction. For this reason, we aimed to explore the effects, and the underlying mechanisms, of hepatic KLF2 over-expression in in vitro and in vivo models of liver cirrhosis. These studies demonstrate that KLF2 is induced by statins (simvastatin in primis) in both normal and cirrhotic liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), orchestrating an efficient vasoprotective response, and in cirrhotic hepatic stellate cells (HSC), inducing their apoptosis and de-activating their phenotype partly via the activation of the nuclear factor Nrf2. Simvastatin vasoprotection and its anti-fibrotic properties are attenuated or even inhibited in the presence of isoprenoids or specific siRNA for KLF2, and are magnified in cells cultured (using bi and tri- dimensional systems) under physiological shear stress conditions. Indeed, LSEC over-expressing KLF2 induce quiescence of HSC through a KLF2–nitric oxide–guanylate cyclase-mediated paracrine mechanism as well as activated HSC over-expressing KLF2 reverse their phenotype and induce an amelioration of LSEC probably through a VEGF-mediated mechanism, but no paracrine interactions between hepatocytes and HSC are observed. All these effects are amplified in cells co-cultured in a sinusoidal-like environment. Pharmacological or adenoviral up-regulation of hepatic KLF2 expression provokes a profound amelioration in portal hypertension and cirrhosis, mainly due to hepatic stellate cells inactivation and apoptosis, together with reduction in hepatic oxidative stress and improvement in endothelial function. Specific induction of hepatic KLF2 within the liver represents an easy and highly effective strategy to promote liver cirrhosis regression and portal hypertension amelioration. Overall, the studies included in this PhD thesis propose new treatments for cirrhotic portal hypertension and try to explain some of the molecular mechanisms underlying the benefits of statins, suggesting the up- regulation of KLF2 as a new and highly effective therapy to improve hepatic microcirculation and promote regression of liver cirrhosis. Therefore, acting on leptin signaling pathway or using statins could be a good therapeutic option for patients with portal hypertension and cirrhosis. / El aumento de la resistencia vascular intrahepática, debido principalmente a un aumento en el tono vascular junto a un cambio en la función endotelial hepática y a la fibrosis, es el factor principal en el desarrollo de la hipertensión portal en la cirrosis. La presente tesis doctoral se dirigió a revelar los mecanismos celulares y moleculares necesarios para la identificación de nuevas dianas terapéuticas así como investigar sobre el cross-talk entre las células hepáticas en condiciones estáticas y fisiológicas (shear stress). En el estudio 1 describimos como el bloqueo de la vía de señalización de la leptina en la cirrosis reduce significativamente la presión portal, probablemente por una mejora del tono vascular hepático debido a una mayor disponibilidad de óxido nítrico. Con el estudios 2 y 3 demostramos que las estatinas (simvastatina in primis) mejoran la función endotelial hepática, inhiben el desarrollo de fibrosis hepática e inducen también su regresión en modelos experimentales de cirrosis, a través del factor de transcripción Kruppel-like factor 2 (KLF2). KLF2 media los efectos de la simvastatina pero es también capaz de orquestar una respuesta vasoprotectora y anti-fibrótica eficiente por sí mismo, mejorando la cirrosis y disminuyendo la hipertensión portal. De hecho, la sobre-expresión de KLF2 (mediante el tratamiento con adenovirus o simvastatina) mejora la cirrosis en modelos experimentales in vitro e in vivo. Además vimos que la sobre- expresión de KLF2 mejora no solo el fenotipo de las células tratadas sino también el de las células cercanas, que no sobre-expresan KLF2, gracias a mecanismos paracrinos, bajo condiciones estáticas o mejor en condiciones fisiológicas. Globalmente, los estudios incluidos en la presente tesis doctoral proponen nuevos tratamientos para la hipertensión portal cirrótica e intentan explicar algunos de los mecanismos moleculares subyacentes los beneficios de las estatinas, proponiendo la regulación al alza de KLF2 como una nueva y altamente efectiva terapia para mejorar la microcirculación y promover la regresión de la cirrosis hepática. Por lo tanto, una acción sobre la vía de señalización de la leptina o el utilizo de las estatinas podrían ser una buena opción terapéutica para los pacientes con hipertensión portal y cirrosis.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / ANTECEDENTS: La síndrome de la hipertensió portal és la més greu complicació de les malalties cròniques del fetge. Estudis anteriors del nostre grup i altres grups de recerca en models experimentals d’hipertensió portal i cirrosi han demostrat l’existència d’un procés actiu d’angiogènesi en l’establiment d’aquesta malaltia. Aquests processos angiogènics estan regulats per factors proangiogènics, com VEGF, entre d’altres, i factors antiangiogènics. HIPÒTESI: L’ús de factors antiangiogènics endògens pot ser una estratègia d’inhibició de l’angiogènesi patològica en malalties com la hipertensió portal i la cirrosi més segura i efectiva que els tractaments antiangiogènics tradicionals. OBJECTIU: Determinar la implicació dels factors antiangiogènics endògens VASH1 i PEDF com a reguladors de l’angiogènesi patològica en la hipertensió portal i cirrosi hepàtica, i avaluar experimentalment noves estratègies terapèutiques pel tractament d’aquesta malaltia basades en aquests factors. METODOLOGIA: Anàlisi de l’expressió de PEDF i VASH1 en fetge i mesenteri en diferents models experimentals (CBDL, PPVL i/o CCl4) i en mostres de fetges cirròtics humans, determinant la seva implicació durant el procés de la malaltia i comparant amb l’expressió de factors proangiogènics com VEGF. A continuació, estudi dels efectes de la sobreexpressió de VASH1 i PEDF en les alteracions vasculars i hemodinàmiques de rates amb hipertensió portal i cirrosi biliar secundària, fent servir pautes de tractament profilàctiques (prevenció) i terapèutiques (intervenció). RESULTATS OBTINGUTS: Caracterització del patró d’expressió de VASH1 i PEDF en relació al factor VEGF, observant un augment d’aquests factors tan en fetge com en mesenteri de diferents models animals i en fetges cirròtics humans. Demostrant, en el cas de VASH1, una regulació per retroalimentació negativa de VASH1/VEGF, i en el cas de PEDF, suggerint un mecanisme compensatori dirigit a reduir els efectes patològics de VEGF. Per altra banda, la sobreexpressió de factors antiangiogènics endògens com PEDF i VASH1 es tradueix en efectes beneficiosos, tant esplàncnics com intrahepàtics, en animals amb hipertensió portal i cirrosi com són baixada de la pressió portal, disminució en la formació de vasos col.laterals portosistèmics, reducció de la fibrogènesi en fetge i disminució de l’angiogènesi en fetge i mesenteri. CONCLUSIONS: Els estudis realitzats en la present tesi doctoral evidencien que els factors antiangiogènics VASH1 i PEDF poden ser noves estratègies terapèutiques contra la hipertensió portal i cirrosi hepàtica gràcies a les seves propietats antiangiogèniques i antifibròtiques. / 1) Disruption of negative feedback loop between vasohibin-1 and vascular endothelial growth factor decreases portal pressure, angiogenesis, and fibrosis in cirrhotic rats. Pathological angiogenesis represents a critical hallmark for chronic liver diseases. Understanding the mechanisms regulating angiogenesis is essential to develop new therapeutic strategies that specifically target pathological angiogenesis without affecting physiological angiogenesis. Here we investigated the contribution and therapeutic impact of the endogenous angioinhibitor vasohibin-1 in portal hypertension and cirrhosis. The spatiotemporal expression profiling of vasohibin-1 and its relationship with vascular endothelial growth factor (VEGF), angiogenesis, and fibrogenesis was determined through the analysis of human cirrhotic liver specimens, widely accepted in vivo animal models of portal hypertension and cirrhosis, and in vitro angiogenesis assays. Effects of vasohibin-1 overexpression by adenoviral-mediated gene transfer on angiogenesis, fibrogenesis, and portal hypertension-associated hemodynamic alterations were also studied in rats. We found that vasohibin-1 and VEGF are up-regulated, in mesentery and liver, in cirrhotic and precirrhotic portal hypertensive rats and cirrhosis patients. Our results are consistent with vasohibin-1/VEGF cascades being spatially and temporally coordinated through a negative-feedback loop driving pathological angiogenesis. Paradoxically, further overexpression of vasohibin-1 by adenoviral gene transfer exerts multifold beneficial effects in portal hypertension and cirrhosis: reduction of pathologic angiogenesis, attenuation of liver fibrogenesis partly mediated through inhibition of hepatic stellate cell activation, and significant decreases in portocollateralization, splanchnic blood flow, portohepatic resistance, and portal pressure. The explanation for this apparent contradiction is that, unlike endogenous vasohibin-1, the ectopic overexpression is not regulated by VEGF and therefore disrupts the negative-feedback loop, thus generating constant, but lower levels of VEGF synthesis sufficient to maintain vascular homeostasis but not pathological angiogenesis. Conclusion: Our study provides evidence that vasohibin-1 regulates portal hypertension-associated pathological angiogenesis and highlights that increasing vasohibin-1 might be a promising novel therapeutic strategy for portal hypertension and cirrhosis. 2) Antiangiogenic and antifibrogenic activity of pigment epithelium-derived factor (PEDF) in bile duct-ligated portal hypertensive rats. Antiangiogenic strategies have been proposed as a promising new approach for the therapy of portal hypertension and chronic liver disease. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is a powerful endogenous angiogenesis inhibitor whose role in portal hypertension remains unknown. Therefore, we aimed at determining the involvement of PEDF in cirrhotic portal hypertension and the therapeutic efficacy of its supplementation. PEDF expression profiling and its relationship with vascular endothelial growth factor (VEGF), neovascularisation and fibrogenesis was determined in bile duct-ligated (BDL) rats and human cirrhotic livers. The ability of exogenous PEDF overexpression by adenovirus-mediated gene transfer (AdPEDF) to inhibit angiogenesis, fibrogenesis and portal pressure was also evaluated in BDL rats, following prevention and intervention trials. PEDF was upregulated in cirrhotic human and BDL rat livers. PEDF and VEGF protein expression and localisation in mesentery and liver increased in parallel with portal hypertension progression, being closely linked in time and space with mesenteric neovascularisation and liver fibrogenesis in BDL rats. Furthermore, AdPEDF increased PEDF bioavailability in BDL rats, shifting the net balance in the local abundance of positive (VEGF) and negative (PEDF) angiogenesis drivers in favour of attenuation of portal hypertension-associated pathological neovascularisation. The antiangiogenic effects of AdPEDF targeted only pathological angiogenesis, without affecting normal vasculature, and were observed during early stages of disease. AdPEDF also significantly decreased liver fibrogenesis (through metalloproteinase upregulation), portosystemic collateralisation and portal pressure in BDL rats. This study provides compelling experimental evidence indicating that PEDF could be a novel therapeutic agent worthy of assessment in portal hypertension and cirrhosis.

Objetivos: Conocer la prevalencia y características de las alteraciones del metabolismo lipídico en la población trasplantada de nuestro medio. Estudiar su relación con la aparición de eventos cardiovasculares y con el desarrollo de nefropatía crónica del injerto. Analizar su repercusión sobre la supervivencia de injerto y paciente. Material y método: Se incluyen en el estudio 77 pacientes trasplantados en el Hospital La Fe en un periodo de 14 meses llevándose a cabo un seguimiento longitudinal de los mismos a lo largo de cuatro años. Se realizó una evaluación clínico-analítica de los pacientes en los distintos periodos de seguimiento (pretrasplante, 6 meses, 1, 2, 3 y 4 años postrasplante). El procesamiento de los datos se realizó mediante SPSS v.8, utilizándose técnicas de análisis estadístico tanto uni como multivariante. Resultados: Tras el trasplante se apreció un incremento en las cifras de colesterol total, colesterol LDL y HDL, así como de apolipopreteina B y especialmente en los niveles de Lipoproteína (a) [Lp(a)]. Por el contrario, los niveles de triglicéridos y de apolipoproteína A1 tendieron a disminuir. Los parámetros que, en el análisis multivariante, se mostraron como factores de riesgo para la aparición de eventos cardiovasculares en el postrasplante fueron: la edad, la HTA pretrasplante, la Lp(a)>30 mg/dl pre y postrasplante, la hipertrigliceridemia pre y postrasplante, la creatinina a los 6 meses y el sobrepeso al segundo año. En lo referente al desarrollo de nefropatía crónica del injerto, los parámetros que se comportaron como factor de riesgo independiente fueron: la Lp(a) > 30 mg/dl pre y postrasplante, la hipertrigliceridemia pre y postrasplante y la elevación de VLDL solo en el pretrasplante, por el contrario la edad y la dosis de Ciclosporina > 5 mg/Kg/día se mostraron como factores protectores. Conclusiones: En nuestra serie han sido la elevación de la Lp(a) y la hipertrigliceridemia las principales alteraciones del metabolismo Lipídico que se comportaron como factores de riesgo para la aparición de eventos cardiovasculares y de nefropatía crónica del injerto. / Background Chronic allograft disease (CAD) is the leading cause of late graft failure. Its patogenesis is poorly understood. The importante of the vascular lesions and its similarities with the atherosclerotic process have sugested that lipids may play a pathogenic role. Methods In order to determine the association between different lipid abnormalities and fibrinogen levels in the appareance of CAD we study a group of 77 kidney trasplant patients We make a follow&#8208;up of them with clinical and laboratory parameters befote and annually after trasplantation during four years. Multiple regression analysis was carried out in order to determine which alterations were independent risk factors for CAD. Results Duing the study 19 patients (24,7%) presented CAD. Between the pretransplant parameters analyzed in the multivariate model, the independent risk factors for CAD were the hypertrigliceridemia, VLDL > 25 mg/dl and the Lp (a)> 30 mg/dl. In the same way, the analysis of postrasplant parameters show that again the hypertriglyceridemia and the Lp(a) > 30 mg/dl at one year alter transplantation were independent risk factors for CAD. HDL > 45 mg/dl at one year and dosage of CsA > 5 mg/kg at two years, were related again with a decreased risk to develop CAD. Conclusions Our results show that hypertriglyceridemia and Lp(a) elevation are risk factors for CAD appearance, indeed when they are present before trasplantation. In this context it seems to have a major importance to get an adequate control of hyperlipidemia that could help to preseve renal function as possible.

No description available.

In the work presented in this dissertation, open-loop and closed-loop control strategies that were aimed at resolving major glucose control problems in the postprandial period were developed. A new model-based control algorithm for postprandial glucose regulation in open-loop, which is based on set-inversion technology, was developed. It automatically and efficiently coordinates the values of basal-bolus insulin to achieve certain predefined control objectives. The algorithm was designed to enable integration into existing smart insulin pumps. Closed-loop control strategies based on sliding mode techniques and insulin-on-board constraints were implemented to reduce the risk of late hypoglycaemic events and to obtain safer controller performance without increasing the period of hyperglycaemia. Extensive evaluation and validation of the control robustness was performed in a comprehensive virtual environment that was specifically designed and implemented to facilitate realistic simulations. A practical methodology to “virtualise” a cohort of real Type 1 diabetic patients was also developed / En aquesta investigació, es desenvolupen estratègies de control en llaç obert i llaç tancat encaminades a superar els principals problemes de control de glucosa al període postprandial. Es va desenvolupar un nou algoritme de control basat en models en llaç obert amb tecnologia d'inversió de conjunts. Aquest coordina automàticament els valors d'insulina basal-bol d'una manera eficient per tal d'aconseguir certs objectius de control predefinits. L'algoritme va ser dissenyat per permetre la seva integració en bombes d'insulina intel•ligents. També, es van implementar estratègies de regulació en llaç tancat basades en tècniques de control en mode lliscant i limitacions de la insulina a bord, per reduir el risc d'episodis d'hipoglucèmia tardana per tal d'aconseguir un acompliment més segur sense augmentar el temps a hiperglucèmia. La robustesa dels controladors va ser demostrada mitjançant una àmplia avaluació i validació en un entorn virtual integral específicament dissenyat i implementat en aquesta tesi per permetre simulacions realistes