La apoptosis es un mecanismo fisiológico que contribuye a regular el número de células de un organismo de tal forma que aquéllas que realizan funciones transitorias, que están lesionadas, o en exceso, serán eliminadas. Éste es un proceso estrictamente regulado durante el desarrollo embrionario e íntimamente ligado con el inicio o progresión de determinadas patologías. Así pues, el exceso de apoptosis contribuye al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas mientras que su defecto sería el origen de neoplasias. El principal regulador del proceso apoptótico es la activación de las caspasas, cisteína-proteasas con especificidad para residuos de aspartato. Los principales mecanismos que activan las caspasas son la salida de citocromo C de la mitocondria por una alteración de la función mitocondrial, y la activación de proteínas de membrana denominadas receptores de muerte (DRs, Death Receptors). Estos últimos han sido ampliamente caracterizados en el sistema inmune, mientras que en tejidos como el sistema nervioso sus funciones están en las fases iniciales de caracterización.El objetivo del presente trabajo es contribuir a esclarecer los mecanismos moleculares que regulan la actividad de estos receptores en el sistema nervioso, a través de la caracterización funcional de dos nuevas proteínas, FAIM y Lifeguard, propuestas inicialmente como antagonistas del receptor de muerte CD95/Fas/APO-1. Para ello se han usado las líneas celulares PC12 y SH-SY5Y, ampliamente utilizadas en modelos de diferenciación y muerte celular, junto con cultivos primarios de neuronas corticales y neuronas granulares de cerebelo.En la primera parte de este trabajo se describe la clonación del ortólogo de ratón de Lifeguard, y su caracterización como antagonista funcional de CD95 en el sistema nervioso. Hemos demostrado que su sobreexpresión es capaz de bloquear la muerte inducida por CD95 en el modelo del neuroblastoma humano SH-SY5Y así como en neuronas corticales murinas. También hemos comprobado que la disminución de sus niveles endógenos sensibiliza a las neuronas granulares y las corticales de ratón. Además, se ha constatado que su mecanismo molecular de acción depende de su localización exclusiva en microdominios de membrana llamados Lipid Rafts, donde puede interaccionar con CD95 e inhibir la activación de caspasas iniciadoras.De los resultados obtenidos en la segunda parte del trabajo se deduce que los niveles de la isoforma larga del antagonista FAIM, FAIML, específica del sistema nervioso, aumentan durante el desarrollo embrionario. Su máxima expresión es en los períodos del desarrollo en los que se modelan y ajustan las estructuras neurales que darán lugar al cerebro adulto. Funcionalmente, hemos demostrado que no participa en procesos de neuritogénesis (a diferencia de la isoforma corta de FAIM, FAIMS) y que no bloquea la muerte apoptótica inducida a través de estímulos mitocondriales. Sin embargo, FAIML es capaz de antagonizar la apoptosis inducida a través de los DRs CD95 y TNFR1. Los ensayos >con RNA de interferencia nos han permitido elucidar que FAIML es, al menos en parte, responsable del bloqueo de la actividad de caspasas iniciadoras activadas por DRs.Por tanto, este trabajo aporta claves sobre las bases moleculares que regulan la actividad de los DRs en el sistema nervioso y que pueden constituir una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas en neuropatologías en las que los DRs participan de forma relevante. / Apoptosis is a physiological process by which the number of cells in metazoan organisms is regulated. Thus, cells with transient function, supranumerary cells or damaged ones are selectively eliminated by this process. Apoptosis is strictly regulated and recently it has been suggested that it could be involved in the pathogenesis of some nervous system diseases. In that sense, an excess of cell death could contribute to neurodegenerative disorders and, on the other hand, a defect could be one of the reasons for neoplasia development. The main regulator of apoptosis is the activation of caspases. These are cysteine-proteases which have cleavage specificity for aspartic residues. Caspases are activated by two main mechanisms: (1) release of citocrome C from altered mitochondria to the cytoplasm and (2) activation of membrane receptors called death receptors (DRs). These proteins have been widely characterized in the immune system, whereas in the nervous system their functions are at the initial stages of characterization.The present project is focussed on the characterization of two novel antagonists of the death receptor CD95/Fas/APO-1 which are specifically expressed in the nervous system, Lifeguard and FAIM. For this purpose PC12 and SH-SY5Y cell lines, widely used in models of differentiation and cell death, have been used along with primary cultures of cortical neurons and cerebellar granule neurons.Results obtained in the first part of this study allowed us to clone mouse Lifeguard, and describe its function as an antagonist of CD95 in the nervous system. We have demonstrated that its overexpression is able to block CD95 induced cell death in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, and in mouse embryonic cortical neurons. Furthermore, reduction of Lifeguard endogenous levels sensitizes both, mouse granular and cortical neurons to CD95 induced apoptosis. In addition, it has been stated that the molecular mechanism of action of Lifeguard depends on its exclusive location in plasma membrane microdomains called Lipid Rafts, where it can interact with CD95 and inhibit the activation of initiator caspases.In the second part of this study, our results demonstrate that the expression of the long form of the CD95 antagonist FAIM, FAIML, specific of the nervous system, increases during the embryonic development. It reaches maximum levels in the periods of the development in which the neural structures are being defined, thus creating adult brain structures.Functionally, we have demonstrated that FAIML, in contrast to the short form of FAIM (FAIMS), does not participate in neurotrophic factor induced neurite outgrowth and it is not able to block apoptotic induced cell death through mitochondrial stimuli. Nevertheless, FAIML is able to antagonize the apoptosis induced through DRs CD95 and TNFR1. FAIML RNA interference efficiently reduced its endogenous levels and allowed us to conclude that FAIML is one of the molecules responsible for maintaining initiator caspases inactive upon receptor engagement.Therefore, this work will contribute to the understanding of the molecular basis for DRs activity regulation in the nervous system, and it could constitute a starting point for the development of new therapeutic strategies for DRs associated neuropathologies.

D'entre totes les catecolamines, la dopamina és la més important del sistema nerviós central, on regula funcions com la conducta motora, les emocions i la cognició. Donada la implicació del sistema dopaminèrgic en diverses disfuncions cerebrals, com ara l'esquizofrènia, la malaltia de Parkinson o el trastorn per dèficit d'atenció amb hiperactivitat, l'estudi d'aquest sistema ha esdevingut de gran importància. Els dos mecanismes més importants de terminació de l'activitat dopaminèrgica a nivell sinàptic són la recaptació mitjançant el transportador de la dopamina (DAT) i la degradació a través de la catecol-o-metiltransferasa (COMT). El gen del DAT presenta un polimorfisme consistent en un número variable de repeticions en tàndem (VNTR) de 40 parells de bases (bp). Aquest polimorfisme es troba en una regió no codificant del gen i, per tant, no està associat a mutacions en la seqüència d'aminoàcids de la proteïna, però sí s'han observat diferències en la disponibilitat de la proteïna associades al VNTR. Tot i que els estudis in vivo han estat poc concloents, els estudis in vitro suggereixen una major expressió de la proteïna associada a l'al·lel de 10 repeticions, la qual conduiria a menors nivells de dopamina sinàptica. La COMT és un enzim que pot catalitzar la metilació de petites molècules com fàrmacs, hormones i neurotransmissors o de macromolècules com les proteïnes, l'ARN o l'ADN. El gen de la COMT mostra un polimorfisme funcional causat per la transició d'una guanina a una adenina que suposa un canvi de l'aminoàcid valina per l'aminoàcid metionina al codó 108/158, depenent de si la forma de l'enzim codificada és la citosòlica (codó 108) o la membranal (codó 158). L'enzim que conté l'aminoàcid metionina és termolàbil a 37 ºC, mentre que l'enzim que conté l'aminoàcid valina mostra major estabilitat a temperatures entre els 37 i els 56 ºC. La major estabilitat comporta uns majors nivells d'activitat enzimàtica i, en conseqüència, una menor disponibilitat dopaminèrgica a nivell sinàptic. En els dos estudis que formen aquesta tesi vàrem avaluar l'efecte de les variants genètiques de la COMT i del DAT sobre l'activació cerebral relacionada amb la memòria de treball i el processament d'emocions, així com el seu impacte sobre les funcions cognitives prefrontals. A tal efecte, es va estudiar, mitjançant la tècnica de ressonància magnètica funcional (RMf) i l'administració de proves prefrontals, una mostra de subjectes sans dels quals s'havien obtingut prèviament el genotip per als polimorfismes Val108/158 Met de la COMT i 40 bp VNTR del DAT. Les anàlisis van mostrar una relació entre el genotip de la COMT i l'execució en el Wisconsin Card Sorting Tests (WCST). Concretament, el nombre d'al·lels Val estava relacionat amb un pitjor rendiment en aquest test, reflectit pel major nombre d'errors perseveratius. Pel que fa al genotip del DAT, es va observar un efecte sobre la variable temps de reacció del Continuous Performance Test (CPT). Els subjectes homozigots per a l'al·lel de 9 repeticions van ser els que van mostrar els temps de reacció més elevats, mentre que els subjectes homozigots per a l'al·lel de 10 repeticions van mostrar els temps de reacció més baixos. Tots dos genotips es van relacionar amb el nombre d'errors de comissió en el CPT. El nombre d'al·lels Val de la COMT i el nombre d'al·lels de 10 repeticions del DAT estaven relacionats amb un major nombre d'errors de comissió. Pel que fa a les dades de RMf no es va observar cap efecte dels genotips de la COMT i del DAT independentment, però sí un efecte additiu dels dos genotips sobre l'activació cerebral a la circumvolució frontal mitja (BA 9) durant la realització de l'N-back. Durant el processament d'emocions es va observar un efecte principal del genotip de la COMT en l'activació de l'amígdala dreta. Anàlisis posteriors van revelar una major activació de l'amígdala dreta en els subjectes homozigots per a l'al·lel Met en relació als portadors de l'al·lel Val. Els nostres resultats mostren, per tant, que les variacions genètiques que afecten la transmissió dopaminèrgica tenen un impacte sobre la fisiologia cerebral i sobre el rendiment cognitiu.

Determinades situacions patològiques en el cervell així com estímuls inflamatoris provoquen un augment en l’expressió de la COX-2. En el context de la isquèmia cerebral, l’augment en l’expressió de la COX-2 està relacionada amb efectes perjudicials. Les cèl•lules del sistema nerviós central (SNC) disposen de sistemes de reconeixement que els permeten detectar i reconèixer agents infecciosos i iniciar una resposta immune per a fer front a una intrusió. Els astròcits expressen receptors tipus Toll-Like, responen als agonistes d’aquests receptors amb l'alliberació de molècules, i són capaços de modular la resposta immune innata. Els astròcits tenen una ubicació estratègica a la interfase entre els vasos sanguinis i el parènquima cerebral, participant així en la funció de la BHE, en la regulació del flux sanguini cerebral, mitjançant l'alliberament de mediadors vasoactius i expressant molècules implicades en la patogènesi d'algunes malalties autoimmunes que afecten la permeabilitat de la BHE. A més, els astròcits formen una intricada xarxa intercomunicativa amb altres cèl•lules nervioses. La senyalització iniciada en els astròcits pot afectar la funció sinàptica cerebral, i tenir un gran impacte en la unitat neurovascular. En aquesta tesi ens hem plantejat l’ objectiu d’esbrinar les vies de senyalització intracel•lular i els mediadors inflamatoris que participen en la resposta dels astròcits a l’activació dels receptors d’immunitat innata, concretament TLR-4, i determinar el paper de la Cox-2 astroglial en la resposta inflamatòria induïda per aquest receptor. L’activació de TLR-4 indueix en els astròcits senyalització a través de NFκB, les vies MAPK i JAK1/STAT1, que al seu torn regulen l'expressió d'una àmplia gamma de molècules proinflamatòries. Malgrat que el LPS no sembla induir IFN-β en els astròcits, sí que promou l'activació JAK1/STAT1 de manera independent de MyD88, i STAT1 pot regular negativament l'expressió de gens que s'indueixen a través de la via MyD88. Aquests resultats mostren l’activació d’una complexa xarxa de senyalització iniciada per l’activació del receptor TLR-4 en astròcits. Les cèl•lules astroglials són sensibles a la immunitat innata, desencadenant una resposta específica del tipus cel•lular i generant un ambient pro-inflamatòri que podria afectar la resposta o viabilitat de les cèl•lules circumdants. El LPS augmenta l’expressió de la COX-2 en astròcits, i també provoca un augment en la producció i alliberació de prostanoïds dependent de l'expressió de la COX-2. El paper clau de la Cox-2 en la producció de prostanoids després de LPS i l'evidència que la manca de l’enzim Cox-2 exacerba l'expressió de diversos mediadors inflamatoris. Aquest efecte es deu, almenys en part, a la manca de mecanismes naturals de regulació negativa induïts per la PGE2. Els mecanismes de retroalimentació d'aquest tipus podrien estar implicats en la resolució natural del procés inflamatori. / Brain pathological conditions and pro-inflammatory stimuli induce cyclooxygenase-2 (Cox-2). Cox-2 is regarded as an inflammatory mediator but Cox-2 deficiency exaggerates the cerebral inflammatory response to lipopolysaccharide (LPS). Here we investigate the role of Cox-2 in LPS-induced prostanoids and inflammation in glia. Intracerebral administration of LPS in rodents induced Cox-2 mainly in astroglia and microglia, while Cox-1 expression was constitutive and predominant in microglia, and it did not increase after LPS. In cultured astrocytes, LPS induced Cox-2 and microsomal prostaglandin-E2 (PGE2) synthase-1 expression. Cox-2 fully mediated LPS-induced production of PGE2 and other prostanoids, as demonstrated in Cox-2-deficient cells and using Cox inhibitors. However, Cox-2-deficient astrocytes produced more TNF-alpha and other inflammatory mediators after LPS than the corresponding wild-type cells. Treatment with PGE2 prevented the exacerbated production of TNF-alpha after LPS in Cox-2 KO cells, and an EP4 agonist also attenuated LPS-induced TNF-alpha, supporting that PGE2/EP4 exerted selective feedback regulatory functions. However, Cox-2 inhibitor NS-398 only caused a very mild increase in LPS-induced TNF-alpha in wild-type astrocytes. This difference might be due to certain Cox-2-independent actions of NS-398 since it decreased TNF-alpha in Cox-2 KO cells, and enhanced the reduction of TNFalpha induced by treatment with PGE2. Therefore, Cox-2 deficiency exacerbates LPS-induced TNF-alpha by preventing a natural negative feedback regulation mediated by the Cox-2/PGE2/EP4 axis. In addition to this effect, NS-398 exerts Cox-2-independent actions becoming apparent in the absence of Cox-2 or in the presence of PGE2. The balance between these different effects determines how Cox-2 inhibition modulates inflammatory responses in astrocytes.

El posicionament de les neurones en el sistema nerviós central i el creixement dels seus axons són processos essencials que s'han de desenvolupar degudament per assolir un funcionament correcte del cervell. La gran varietat de processos migratoris que es produeixen durant tot el desenvolupament desemboquen en la formació de les estructures cerebrals. La Reelina, així com d'altres proteïnes secretables, és una senyal extracel·lular que controla els processos migratoris que es produeixen durant el desenvolupament en estructures laminades com l'escorça, l'hipocamp, el cerebel i el bulb olfactori. També en el cervell adult la Reelina pot intervenir en processos de sinaptogènesi i plasticitat neuronal, a més de mantenir el control de la migració de neurones al bulb olfactori. L'estudi detallat de la transducció de senyal que es desencadena en les neurones estimulades amb Reelina permet identificar les proteïnes que hi participen. Així, els receptors VLDLR i ApoER2, la proteïna adaptadora mDab1, les proteïnes quinasa de la família Src, la PI3K, la Akt1, la GSK3â i la MAP1B formen part d'aquest sistema de senyalització intracel·lular que acabarà donant resposta a l'estímul originat per la Reelina. En aquesta tesi doctoral es fa un estudi descriptiu de la distribució d'mDab1, que participa en els primers passos de la transducció de la senyalització induïda per la Reelina, i s'analitza la seva implicació en axogènesi i en l'establiment del patró de projeccions que innerven l'hipocamp. Els resultats obtinguts indiquen que l'mDab1 s'expressa en les regions d'origen de les fibres de la via perforant i de les connexions comissurals durant l'etapa de formació d'aquestes connexions. Els axons procedents de l'escorça entorínica i de CA3 contenen la proteïna mDab1 en els seus tractes axonals i també a nivell dels cons de creixement. Els ratolins mdab1 -/- presenten el mateix fenotip que els ratolins reeler en aquestes connexions. L'mDab1 és important tant en les regions d'origen de les fibres de la via perforant com en les regions diana d'aquesta connexió. D'altra banda, la Reelina indueix col·lapse axonal sobre els axons de CA3 i incrementa la ramificació axonal en neurones hipocàmpiques. El cultiu d'explants de les regions CA1/CA3, EC i DRG sobre substrats que contenen la Reelina en promou una disminució del creixement axonal. A continuació s'estudien nous processos de senyalització que s'activen en resposta a la Reelina, centrant l'estudi en la via de senyalització d'ERKs. La Reelina indueix la fosforilació de les MAPKs Erk1 i Erk2, i no en canvi de les Jnk1/2/3 ni de la p38. La fosforilació de les Erk1/2 es correspon amb l'activació d'aquestes proteïnes. L'increment d'activitat de les Erk1/2 és depenent de la prèvia activació de les SFKs, de l'mDab1 i de la via de PI3K; i no requereix la participació de la proteïna Ras. A conseqüència de l'activació de la via d'ERK, s'indueix un increment de la transcripció gènica de l'egr-1 per acció de l'estímul de la Reelina. També s'estudia la implicació de l'activació d'ERK en models de migració in vitro de la regió SVZ. L'activació de la via d'ERK és necessària per a la desadhesió neuronal induïda per la Reelina sobre les neurones de la SVZ. Finalment es genera un model animal per a l'estudi de la funció de la proteïna Reelina en processos de desenvolupament i plasticitat de l'edat adulta. La sobreexpressió regulada de Reelina en cervell anterior d'animals postnatals es limita a les regions on s'expressa el promotor CamKIIá. Per aconseguir-ho es generen animals dobles transgènics d'expressió de la Reelina mitjançant un sistema Tet-Off. Els ratolins dobles transgènics expressen la Reelina en neurones principals de l'estriat, de CA1 de l'hipocamp i del gir dentat. / To study the participation of Reelin and its signaling pathway in the development of the central nervous system, different experimental approaches were performed. First, we analyzed the participation of mDab1 and Reelin in the development of hippocampal connections. Second, we reported the activation of ERK pathway by Reelin stimulus to induce egr-1 upregulation and SVZ detachment. And third, we generate a new mouse model to study Reelin functions.The results indicate that mDab1, which participates in the first step of intracellular transduction of Reelin signaling, is expressed in the regions of origin of the perforant and comissural pathways. Entorhinal and CA3 axons contain mDab1 protein in their axonal tracts and also in the growth cones. mdab1 -/- mice show the same phenotype as reelers in the development of those connections. mDab1 is required in the regions where perforant axons originate and in the terminal areas. Moreover, Reelin induces CA3 growth cone collapse, increased axonal branching in hippocampal primary cultures and reduced outgrowth of CA1/CA3, EC and DRG explants.Reelin induces the phosphorylation and activation of MAPKs Erk1 and Erk2, but not of Jnk1/2/3 or p38. The activation of Erk1/2 occurs downstream of the sequential activation of SFKs/mDab1 and PI3K pathway without Ras participation. The activation of the ERK pathway induces the increased transcription of egr-1 after Reelin stimulation, and the detachment of neurons from the SVZ.Finally, to study adult processes of development and plasticity, transgenic mice was designed and generated to express Reelin in postnatal forebrain under the control of CamKIIá promoter. Using the Tet-Off binary system, the double transgenic animals express Reelin in principal neurons of the striatum, CA1 hippocampal region and dentate gyrus.

Durant el període de formació del Sistema Nerviós Central (SNC) una multitud de factors participen en el desenvolupament de les diferents estructures cerebrals. Aquests factors controlen tant la migració cel·lular com el correcte posicionament de les diferents cèl·lules dins el SNC. La Reelina és un proteïna soluble de matriu extracel·lular expressada al llarg del desenvolupament i de l'edat adulta, encara que la seva funció principal s'hipotetitza durant el desenvolupment. La present tesi abarca tres funcions diferents de la Reelina en el control de la migració cel·lular durant el desenvolupament i l'edat adulta.En el primer apartat d'aquesta Tesi, hem demostrat que la Reelina pot controlar el nivell de fosforilació en mode I de la proteïna MAP1B durant la migració de les neurones que formen l'escorça cerebral. Aquesta fosforilació en mode I s'ha associat al control de l'estabilitat dels microtúbuls durant la migració cel·lular. L'estudi morfològic que hem desenvolupat en l'animal deficient per la proteïna MAP1B ens ha corraborat que existeix una relació entre la cascada de senyalització desencadenada per la Reelina i l'activitat de la proteïna MAP1B. Finalment també hem descrit que en resposta a la Reelina la quinasa GSK3-beta fosforila principalment MAP1B en mode I, encara que la participació, en menor grau, de la quinasa Cdk5/p35 no pot ser descartada.En el següent punt del nostre estudi, hem relacionat la via de senyalització MAPK/ERK amb la cascada activada per la Reelina. Hem comprovat que la Reelina pot induir la fosforilació d'mDab1 i la subseqüent activació de la proteïna PI3K, que a la seva vegada pot fosforilar a la proteïna Akt1/PKB. A partir d'aquest resultats, hem demostrat que l'activació de PI3K en reposta a la Reelina indueix l'activació de MEK1/2 i que aquesta activació desenvoca en la fosforilació de les proteïnes Erk1 i Erk2. També hem descrit que les formes fosforilades d'Erk1/2 en resposta a Reelina es transloquen a nucli en neurones corticals on indueixen l'expressió del factor de transcripció Egr-1. Un punt important d'aquest estudi es basa en el fet que hem pogut relacionar la cascada Reelin-MAPK/ERK en el procés de desadhesió de les cèl·lules de la zona subventricular (o SVZ) que participen en la via de la migració rostral (o RMS). A partir del fet que en presència de la Reelina, les cèl·lules que surten d'explants de SVZ no migren homofílicament sino que pateixen un proces de desadhesió migrant de forma individualitzada, hem descrit que si bloquegem farmacològicament o genèticament la via d'activació MAPK/ERK l'efecte de desadhesió induït per la Reelina queda inhibit. Amb aquest resultat podem concloure que en resposta a la Reelina les proteïnes Erk1/2 es fosforilen i que aquesta fosforilació és necessària per que la Reelina desenvolupi els seu paper en desadhesió dels neuroblasts que participen en la RMS.El tercer i darrer punt d'aquesta Tesi es basa en el control per part de la Reelina de la migració radial de les cèl·lules granulars del cerebel. En resposta a Reelina les cèl·lules granulars del cerebel inhibeixen la seva migració i aquesta resposta es induïda mitjançant l'activació de la via de les MAPK/ERK. El bloqueig farmacològic d'aquesta via inhibeix l'efecte de la Reelina. Amb aquestes dades podem concloure que l'activació, induïda per la Reelina, de la via de les MAPK/ERK no només és important en el control de la migració en el cerbell anterior sino que també és important en el cerebel, y que aquesta pot ser una cascada de senyalització que participa àmplimant en les funcions on s'hipotetitza la funcionalitat de la Reelina. / "Role of Reelin signalling during neuronal migration in the Central Nervous System"During the development of the Central Nervous System (CNS) a multitude of factors work together to generate the different brain structures. Some of these factors control both cellular migration and cellular positioning inside the CNS. Reelin is a soluble protein of the extracellular matrix expressed during both development and adulthood, however its principal function is hypothesized to occur during development. This current Thesis addresses three different functions of Reelin on neuronal migration during embryonic and postnatal development.In the first chapter, we have shown that Reelin controls mode I phosphorylation of MAP1B protein during neuronal migration in the neocortex. Mode I phosphorylation has been related to the microtubule stability during cell migration. We developed morphological studies on map1b-deficient mice that corroborated the relationship between Reelin signalling cascade and MAP1B activity. Furthermore, we also described that this relation is done through the Reelin-dependent GSK3 activation, which phosphorylates MAP1B in mode I.In the second chapter, we addressed the relationship of Reelin signalling and the MAPK/ERK pathway. We showed that Reelin induces the phosphorylation of Dab1 and subsequent PI3K/Akt1 activation. Based on these results, we first described that Reelin-dependent PI3K activation induces MEK activation, which triggers Erk1 and Erk2 (Erk1/2) phosphorylation. We also showed that these active phospho-Erk1/2 proteins translocate into the nucleus inducing the expression of the Egr-1 transcription factor. Furthermore, we have demonstrated that this Reelin-induced pathway is activated during rostral migratory stream migration when neuroblasts face Reelin expressed in the olfactory bulb. The activation of ERK pathway in response to Reelin is crucial to change neuroblast migration from tangential chain migration to radial individual migration into the olfactory bulb.In the last chapter, we studied the role of Reelin in the control of radial migration of granule cells during the postnatal development of the mouse cerebellum. We shared that cerebellar granule cell migration is blocked by Reelin stimulation through MAPK/ERK activation. Furthermore, when ERK activation was pharmacologically block the Reelin effect on granule cells migration was inhibit.

DE LA TESIS:Una de las consecuencias de los avances científicos y tecnológicos del ultimo siglo es el aumento de esperanza de vida en las sociedades modernas lo que, en términos demográficos, se traduce en un incremento en la media de edad de la población. Sin embargo, este envejecimiento progresivo comporta una mayor incidencia en la sociedad de enfermedades que se manifiestan a edades avanzadas, destacando las que afectan al sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer o la de Parkinson. El dramático incremento en la incidencia de este tipo de enfermedades se ha traducido en una sensibilización social frente a ellas, así como en un creciente interés en el estudio de los procesos neurodegenerativos asociados a la edad y en su posible tratamiento.La etiología de la muerte neuronal en los procesos de neurodegeneración continúa siendo un enigma por descifrar pero cada vez se sabe más acerca de las causas y trastornos que la envuelven. Un factor que parece estar implicado directamente en estos procesos es el glutamato, el neurotransmisor excitador mayoritario del sistema nervioso central. La paradoja de ésta molécula estriba en que a pesar de estar implicada en procesos fisiológicos normales como el aprendizaje, la memoria o la construcción de conexiones sinápticas durante el desarrollo, también puede ser tóxica para las neuronas. El glutamato juega un papel central en muchos procesos neurodegenerativos y está implicado en patologías tan diversas como la corea de Huntington, la epilepsia, el daño cerebral isquémico o la enfermedad de Alzheimer. El modo mediante el que el glutamato ejerce su función tóxica consiste en la sobreactivación de sus receptores sinápticos, provocando una serie de fenómenos patológicos que llevan a la muerte de la neurona y que son conocidos con el nombre de excitotoxicidad. El mecanismo por el que todo esto sucede es todavía objeto de estudio.Dentro de este marco, los objetivosprincipales sobre los que se fundamenta el trabajo aquí expuesto eran:- Caracterizar en términos histológicos, bioquímicos y funcionales la lesión excitotóxica de la rata creada en la vía septohipocampal por la microinyección en el septo medio de un agonista de los receptores del glutamato (el ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilsoxazol-4-propiónico, o AMPA) y comparar los efectos provocados en función de la dosis administrada con los que aparecen en función del tiempo postlesión transcurrido.- Bajo las condiciones de neurodegeneración seleccionadas, estudiar in vivo las respuestas adaptativas de los sistemas de activación e inhibición hipocampales controlados por los núcleos de la región septal para así establecer la relevancia de cada sistema en este modelo animal.- De forma paralela y en otro modelo animal de aprendizaje y memoria en el que previamente se habían caracterizado variaciones de los receptores hipocampales del glutamato, nos propusimos estudiar el origen celular del aumento de receptores AMPA asociados al deterioro cognoscitivo provocado por el envejecimiento.- Investigar la posible relación entre la vulnerabilidad humana a la hipoxiaisquemia durante el periodo perinatal, la calcificación cerebral en el mismo periodo y su evolución, con el fin de establecer posibles paralelismos con la lesión excitotóxica inducida en nuestro modelo en diferentes condiciones de dosis y tiempo.- Analizar los mecanismos moleculares que puedan estar interrelacionados para dar lugar tanto a la formación de precipitados intracelulares de calcio como a la progresividad del proceso neurodegenerativo.

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Dorsoventral patterning of the vertebrate nervous system is achieved by the combined activity of morphogenetic signals secreted from dorsal and ventral signalling centres. The Shh/Gli pathway plays a major role in patterning the ventral neural tube; however, the molecular mechanisms that limit target gene responses to specific progenitor domains remain unclear. Here, we show that Wnt1 and Wnt3a, by signalling through the canonical β-catenin/Tcf pathway, control expression of dorsal genes and suppression of the ventral programme, and thatthis role in DV patterning depends on Gli activity. Additionally, we show that Gli3 expression is controlled by Wnt activity. Identification and characterization of highly conserved non-coding DNA regions around the human Gli3 gene revealed the presence of transcriptionally active Tcf-binding sequences. These indicated that dorsal Gli3 expression might be directly regulated by canonical Wnt activity. In turn, Gli3, by acting as a transcriptional repressor, restricted graded Shh/Gli ventral activity to properly pattern the spinal cord.Additionally, the Wnt canonical pathway and Hedgehog signalling have been linked to cell proliferation in a variety of systems, however interaction of these pathways to control cell cycle progression have not been studied. In the developing vertebrate nervous system, although Shh and Wnt ligands are expressed at the opposite ventral and dorsal signalling centres, reports demonstrate that proliferation of neural progenitors require both activities throughout the dorsoventral axis. Here we demonstrate the integration of both pathways to control the length of G1 phase, and the absolute requirement of an upstream Hedgehog activity for the Wnt-mediated regulation of the key cell cycle activator CyclinD1 expression and for G1 progression. Although Wnt canonical activity appeared restricted to the control of G1 phase, Hedgehog activity additionally regulates the length of G2 phase through the regulation of ate cell cycle activators such as CyclinA2 and CyclinB2/3. These findings support a key role for Hedgehog in growth control, as a regulator of G1 and G2 phases of cell cycle and importantly as an upstream regulator of the canonical Wnt activity.KEY WORDS: SHH, WNT, Neural Tube, Patterning, CNS, Cell Cycle. / "La integración de las vías de señalización de Shh y Wnt controla la morfogénesis del SNC"TEXTO: La formación del patrón dorsoventral del sistema nervioso central en vertebrados está controlada por la acción de señales morfogenéticas. Estasseñales son secretadas por centros de señalización situados en el extremo dorsal, ectodermo y placa del techo, y ventral, notocorda y placa del suelo, del tubo neural. La vía de señalización de Shh/Gli juega un papel principal en el establecimiento temprano de la región ventral del tubo neural. Sin embargo, losmecanismos moleculares que restringen la expresión de los genes responsables de establecer este patrón a un dominio concreto no son del todo conocidos. En este trabajo mostramos que las señales morphogenéticas Wnt1y Wnt3a, activando la vía de señalización canónica mediada por β-catenina/Tcf, regulan la expresión de genes dorsales y reprimen el programa ventral, mediante un mecanismo que depende de la actividad Gli. Además, mostramosque la expresión de Gli3 está controlada por la vía de Wnt. La identificación y caracterización de regiones no codificantes altamente conservadas alrededor del locus de Gli3 humano revela que contienen sitios de unión consenso para los factores Tcf/Lef-1 activos. Esto indica que la expresión dorsal de Gli3 está controlada directamente por la actividad de la vía canónica de Wnt. A su vez, Gli3, actuando como un represor transcripcional, restringe la actividad del gradiente ventral Shh/Gli para establecer el patrón dorsoventral del tubo neural correctamente.Por otro lado, las vías canónicas de señalización celular de Wnt y Hedgehog regulan la proliferación celular en varios contextos de forma conjunta, Sin embargo, posiblesm interacciones de estas vías de señalización en el control del ciclo celular no han siso estudiadas. Durante el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados, aunque las proteínas Shh y Wnts se expresan en extremos dorso-ventralmente opuestos del tubo neural, varios trabajos demuestran que la proliferación de los progenitores neuronales requiere ambas actividades a lo largo de todo el eje dorsoventral. En este trabajo, demostramos que esnecesaria la integración de ambas vías de señalización para controlar la duración de la fase G1 del ciclo celular. Además, mostramos el requerimiento de la actividad Hedgehog para la regulación mediada por Wnt de la expresión del activador de ciclo celular ciclina D1, componente clave para la progresión através de G1. Aunque la actividad de la vía canónica de Wnt se limita al control de la transición G1/S, adicionalmente, la actividad Hedgehog regula la duración de la fase G2 mediante la regulación de las ciclinas de fase G2 ciclina A2 y Ciclinas B2/B3. En conjunto, estos resultados proponen un papel fundamentalen el control del crecimiento para la actividad Shh/Gli como reguladora de las fases G1 y G2 del ciclo celular y además como reguladora por encima de la actividad canónica de Wnt.

Esta tesis plantea por primera vez la existencia de canalopatías autoinmunes en el sistema nervioso central, aportando los resultados obtenidos de dos trabajos importantes. Se conocía la existencia de autoanticuerpos contra canales iónicos dependientes de voltaje en síndromes neurológicos periféricos. Dada la asociación entre síndromes que afectan al SNP y síndromes neurológicos centrales, se quiso estudiar si los autoanticuerpos contra canales iónicos dependientes de voltaje presentes en los síndromes neurológicos periféricos, podían estar presentes en síndromes neurológicos centrales. Esto se quiso estudiar en los anticuerpos contra canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC) presentes en el síndrome miasténico de Eaton-Lambert (SMEL). Dada la conocida asociación entre el SMEL y la degeneración cerebelosa paraneoplásica subaguda (DCP), quedaba por determinar si la DCP podía estar asociada o no los anticuerpos anti-VGCC. Posteriormente, se amplió el estudio de los anticuerpos antineuronales contra canales iónicos en asociación con síndromes neurológicos del SNC, a los canales de potasio dependientes de voltaje (VGKC). Se conocía la presencia de anticuerpos anti-VGKC en la neuromiotonía. Surgió la posibilidad de una asociación entre la encefalitis límbica y otros anticuerpos o trastornos. Además, un 40% de los pacientes con encefalitis límbica quedaban por determinar séricamente, por la ausencia de anticuerpos (seronegativos) o la presencia de anticuerpos no caracterizados. Se estudió de la presencia de anticuerpos anti-VGKC en pacientes con una encefalitis límbica, de origen paraneoplásico o idiopático.Con los trabajos realizados, se ha abierto la posibilidad a la existencia de canalopatías autoinmunes en el SNC, como la ataxia causada por la degeneración cerebelosa asociada al cáncer de pulmón de célula pequeña y la encefalitis límbica. La relación causal del anticuerpo con el síndrome neurológico no se ha dilucidado, dado que es difícil demostrar si los anticuerpos son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica o si son sintetizados en el propio SNC, causando la posterior disfunción neuronal.Los anticuerpos descritos hasta ahora en el SNC eran utilizados como marcadores de síndromes paraneoplásicos y por lo tanto, no eran patogénicos y su diana era intracelular. En cambio, los anticuerpos que se han descrito en esta tesis como causantes de las canalopatías autoinmunes son patogénicos y en principio tienen dianas extracelulares: los canales iónicos neuronales. Esta diferencia plantea interesantes preguntas sobre la relación entre el SNC y el sistema inmune. Aunque a nivel práctico, nos permite tener una herramienta diagnóstico-terapéutica frente a pacientes que presenten estos síndromes, pues aquellos pacientes que presentan anticuerpos, especialmente si tienen una encefalitis límbica, responden muy bien a tratamiento inmunosupresor. Por lo tanto, los anticuerpos descritos en esta tesis permiten ser utilizados como un marcador diagnóstico y de control de mejoría clínico-inmunológica. Esto es un avance para manejo de estos pacientes neurológicos.

El linfoma de células del manto (LCM) es una entidad heterogénea tanto en sus aspectos biológicos como en su comportamiento clínico. La existencia de pacientes con mala respuesta al tratamiento sugiere que, de manera análoga a otros síndromes linfoproliferativos crónicos, existen alteraciones en los mecanismos de citotoxicidad inducida por fármacos. La heterogeneidad clínica del LCM queda reflejada, entre otros, por la variabilidad en la presentación de expresión hemoperiférica e infiltración del sistema nervioso central (SNC), dos complicaciones controvertidas y no suficientemente estudiadas. La hipótesis planteada en la presente tesis fue que la heterogeneidad observada en el LCM podría ser debida a la existencia de alteraciones en los mecanismos de apoptosis en un subgrupo de pacientes y se relacionaría con el pronóstico de éstos. Por otro lado, el análisis exhaustivo de los pacientes con expresión hemoperiférica o infiltración del SNC permitiría establecer cuáles son las características clínicas y biológicas que determinan la aparición de estas complicaciones en determinados enfermos. Para confirmar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos: 1) estudiar las bases moleculares de la regulación de la apoptosis en el LCM, tanto en líneas celulares como en células primarias de pacientes afectos; 2) analizar la incidencia y el impacto pronóstico de la expresión hemoperiférica en los enfermos con LCM mediante citología y citometría de flujo y 3) estudiar la incidencia y los factores determinantes de la infiltración del SNC en pacientes afectos de esta hemopatía.Para el estudio de las bases moleculares de la apoptosis en el LCM se analizaron cuatro líneas celulares portadoras de la t(11;14)(q13;q32), característica de esta entidad, y células primarias de 10 pacientes con LCM. El análisis de la viabilidad celular mediante marcaje con anexina V y yoduro de propidio, la detección de la pérdida de potencial de membrana y la producción de ROS, la determinación de caspasa 3 activa y de los cambios de conformación de BAX y BAK se llevaron a cabo mediante citometría de flujo (CMF). El análisis de diversas proteínas de la familia de BCL-2 se realizó mediante "Western blot". El estudio del ciclo celular se efectuó asimismo mediante CMF. El análisis de las alteraciones cromosómicas existentes en los LCM leucemizados se realizó mediante hibridación genómica comparada (CGH). Las diferencias entre subgrupos de pacientes se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher y la t de Student. El análisis de supervivencia se llevó a cabo mediante el método de Kaplan y Meier y las diferencias observadas en términos de supervivencia se analizaron con el "log-rank test". El análisis de variables dependientes del tiempo se efectuó mediante el método de Mantel y Byar. Los resultados obtenidos en el primer trabajo demuestran que la citotoxicidad inducida por mitoxantrona en las células del LCM fue debida a la activación de la vía mitocondrial de apoptosis, y tiene lugar, probablemente, de manera dependiente de la integridad de los sensores de daño al ADN. Los resultados del segundo trabajo permiten concluir que la expresión hemoperiférica detectada mediante CMF se observa en la mayoría de los pacientes con LCM, incluso en aquellos con recuentos linfocitarios normales. Aunque la leucemización morfológica no se asoció en nuestro estudio con ninguna alteración citogenética específica detectable mediante CGH, los casos con linfocitosis >/5 x 10(9)/L presentaron anomalías citogenéticas diferenciales y un peor pronóstico. Los resultados del tercer trabajo demuestran que la infiltración del SNC se presenta fundamentalmente en pacientes con LCM blastoide, índice proliferativo elevado, niveles de LDH sérica elevados e IPI de riesgo intermedio/alto o alto, en general en el contexto de recidivas o progresiones sistémicas. / "BIOLOGICAL AND CLINICAL PROGNOSTIC FACTORS IN MANTLE CELL LYMPHOMA"TEXT:Mantle cell lymphoma (MCL) is characterized by the presence of translocation t(11;14)(q13;q32), an aggressive clinical course and poor response to chemotherapy. Few data concerning drug-induced apoptosis in MCL have been reported. The aim of the first study that constitutes the present thesis was to analyze the mechanisms of drug-induced apoptosis in MCL. Four cell lines carrying the t(11;14) and primary cells of 10 patients with MCL were incubated in vitro with several drugs currently used in the treatment of lymphoproliferative disorders and drug-induced cell death was characterized. Our results support that MCL cells have functional apoptotic machinery but require the integrity of functional DNA-damage response genes for its activation. From a clinical standpoint, extranodal involvement is a well-known feature in patients with MCL. Relatively few studies to date have focused on the peripheral blood (PB) involvement and the incidence of leukemic expression in MCL varies highly in different studies. The objective of our second study was to analyze the incidence, and the biological and clinical significance of leukemic involvement in patients with MCL. We investigated the incidence of PB involvement by both morphologic and flow cytometry (FC) analyses. Clinical features, genetic abnormalities detected by comparative genomic hybridization (CGH) and patient outcome were also determined. Leukemic expression at diagnosis detected by FC was a highly common feature, even in patients with a normal lymphocyte count. Although morphologically apparent leukemic expression was not associated with specific chromosomal alterations detected by CGH, a lymphocyte count >/ 5 x 10(9)/L was correlated with particular genetic abnormalities and a poor outcome.The incidence of central nervous system (CNS) involvement in patients with MCL is also highly variable in different studies, and predicting factors and outcome of CNS infiltration in these patients have not been thoroughly investigated. The aim of our study was to assess the incidence and factors for CNS involvement in MCL. In addition, we analyzed the clinical features, therapy and outcome of patients with MCL once CNS infiltration was detected. Our results suggest that, in most cases, CNS involvement occur late in the course of the disease, as part of a generalized relapse or progression. Blastoid histology, high proliferative index, high serum LDH and high-risk IPI are the variables associated with a higher risk to develop this complication.