La malaltia de Parkinson és una de les malalties neurodegeneratives humanes més freqüents, especialment en pacients d'edat avançada amb una simptomatologia provocada especialment per la manca de DA. La gènesi d'aquesta malaltia no és clara, si bé sembla haver un component genètic en un nombre reduït dels casos diagnosticats, la principal causa roman encara desconeguda. La hipòtesi neurotòxica està present des de fa molt temps i el que sembla més lògic és pensar en l'existència d'una condició mixta, es a dir, una predisposició genètica (congènita, heretada o adquirida) i un detonant que podria ser endogen o exogen. Diverses evidencies suggereixen un paper important de la dopamina en el dany neuronal observat durant la malaltia, per aquest motiu, mitjançant diversos experiments, el nostre laboratori ha determinat els efectes de diferents concentracions de dopamina (DA) sobre la viabilitat de les cèl·lules SH-SY5Y. El primer que s'ha fet es comprovar que la DA s'acumula dins la cèl·lula i aproximadament a quines concentracions ho fa. La DA entra ràpidament dins la cèl·lula, on arribarà a unes concentracions inferiors però properes a les utilitzades extracel·lularment.El primer pas dins de la toxicitat produïda per la DA sembla clarament implicar la seva oxidació intracel·lular. Totes les alteracions produïdes per la DA s'han bloquejat amb antioxidants d'acció intracel·lular com la N-acetilcisteïna. Així doncs, per garantitzar que la DA no sigui tòxica, cal que no s'oxidi. És difícil precisar si la toxicitat de la DA pot estar vinculada al seu procés d'oxidació o als metabòlits reactius que es produeixen. En el primer cas la DA, a l'oxidar-se, està donant lloc a peròxid d'hidrogen i, per tant, a un potencial estrès oxidatiu. En les nostres cèl·lules, l'augment de peroxidació per efecte de la DA és relativament suau, a menys que s'incorpori Fe3+ en el medi com a catalitzador d'aquest procés. En el segon cas s'ha de considerar que la DA està donant lloc a quinones i a aminocroms. Les primeres són prou reactives com per unir-se a grups tiol de forma covalent i per tant, potencialment, poder modificar qualsevol proteïna. Venim a suggerir i en part a demostrar que la DA, oxidant-se a dopaquinona i dopaminocrom, pot reduir-se novament en presència de NADH o NADPH i donar lloc a un cicle redox en el que es pot disminuir considerablement el contingut de la forma reduïda d'aquests coenzims, essencials pel bon funcionament cel·lular. A part d'aquesta alteració redox, s'han observat altres alteracions com a conseqüència de l'oxidació de la DA. Una de les més primerenques és l'acumulació de proteïnes ubiqüitinitzades. Com a conseqüència d'aquest fet i d'altres mecanismes s'activarien una sèrie de vies que modificarien l'expressió de tota una gama de gens implicats en la transducció de senyals i en mort o supervivència cel·lular com GADD153 i C/EBP-beta així com de l'alfa-sinucleïna. L'acumulació d'alfa-sinucleina, conjuntament amb la de les proteïnes alterades per les quinones i les proteïnes ubiqüitinitzades no degradades pel proteosoma pot afavorir la formació d'agregats de nucleació, amb característiques d'agressoma, que donen lloc a la formació al seu voltant de vacuoles autofàgiques i a l'activació d'un senyal d'estrès reticular. La DA desencadena doncs clarament i de forma dosi-dependent un procés d'autofàgia en el citoplasma cel·lular. Pensem que la finalitat de l'autofàgia és un cop més la de salvar la cèl·lula, però si l'agressió no s'atura la cèl·lula s'acaba morint per acció de la mateixa autofàgia, o bé mitjançant un procés apoptòtic en alguns casos o simple necrosi en d'altres. BNIP3 és una proteïna la expressió de la qual també incrementa després del tractament amb DA. BNIP3 ja s'ha descrit anteriorment com factor que s'indueix quan hi ha autofàgia. Un dels factors que la regulen és HIF-1-alfa, factor que s'indueix ràpidament en situacions d'hipòxia o d'estrès oxidatiu i com hem vist després del tractament amb DA. Per tant, la cèl·lula es comporta de forma semi-anaeròbica, de manera que la relació lactat/piruvat augmenta, i com a conseqüència d'aquest fet, els nivells d'AMP han d'estar augmentats, podent-se activar l'AMPK. Aquest procediment per si sol pot explicar l'aturada de la ruta de mTOR observada per part de la DA, sense descartar algun efecte més directe sobre TSC1/TSC2 o Rheb. / "Mechanisms of cell damage triggered by dopamine in SH-SY5Y cells."TEXT:Dopamine (DA) could play a central role in neuronal dopaminergic degeneration in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders. The mechanisms leading to neuronal damage and death are not yet fully understood.We have used human neuroblastoma SH-SY5Y cells that are sensitive to dopamine, with the aim to further understand the molecular mechanisms through which dopamine may damage the cell. DA enters the cell in a dose-dependent and saturating way. DA triggers a redox cycle that causes a slight increase in peroxidation (DCFH) and a decrease in the reductive power of the cell that could be assessed by MTT, NADH concentration and GSH/GSSG relationships. Such an effect is reflected in a decrease in cell viability, a decrease in oxygen consumption and an increase in cytosolic calcium concentration. The transcription factors C/EBPß and GADD153/CHOP increase their expression. Parameters of endoplasmic reticulum stress (grp78) are activated and a consistent autophagy is observed using electronic microscopy.Autophagy is a process characterized by the presence of double or multiple-membrane cytoplasmic vesicles sequestering cytoplasm and organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum.The genes related with autophagy and their products are currently known as ATG. The microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) (the mammalian orthologue of yeast ATG8) is a useful procedure for autophagy detection. We show that dopamine increases LC3 expression and its proteolysis product LC3-II which is localized in autophagosamal membranes.The PI3K-AKT-mTOR pathway is involved in autophagy induced by starvation. The activation of S6K (a downstream substrate of mTOR) decreases after incubation with dopamine. This is indicative of a mTOR inhibition by dopamine. 3-Methyladenine blockes autophagy but not the LC3 increase. Beclin 1 (ATG6) is also involved in this process.Moreover, a multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) showed an increase in BNIP3, NOXA and PUMA expression after DA treatment. BNIP3 and p53 expression were confirmed by WB. BNIP3 is a member of the BH3-only family, which are factors involved in apoptosis and autophagy. Since BNIP3 is induced under hypoxic conditions we studied and found an increase of hypoxia inducible factor (HIF 1alpha) expression, suggesting a hypoxic-like condition caused by dopamine.

En esta Tesis Doctoral se pone de manifiesto que el reflejo de sobresalto acústico está anormalmente reducido o incluso ausente en la parálisis supranuclear progresiva pero es normal en la atrofia multisistémica y normal o discretamente retrasado en la enfermedad de Parkinson. Por otro lado, las respuestas faciales a estímulos somestésicos periféricos registradas en el músculo orbicularis oculi están ausentes en la parálisis supranuclear progresiva en relación a otros parkinsonismos. La curva de recuperación de la excitabilidad del reflejo de parpadeo está alterada, sin embargo, de forma similar en los distintos síndromes parkinsonianos.Es otra de las conclusiones de la Tesis que el reflejo de sobresalto acústico origina una activación de la vía retículoespinal que facilita la ejecución de un acto motor determinado y acorta el tiempo de reacción. Este fenómeno se demuestra en sujetos sanos y en pacientes con enfermedad de Parkinson y con atrofia multisistémica, pero no en pacientes con parálisis supranuclear progresiva. La ausencia de efecto sobre el tiempo de reacción en estos pacientes se relaciona con el hecho de que el reflejo de sobresalto está ausente o anormalmente reducido. La magnitud del efecto producido se modifica con las condiciones ambientales y el nivel de atención. La preparación para la ejecución de un acto motor reduce la habituación de la reacción de sobresalto y facilita su aplicabilidad clínica.En resumen se puede decir que, en la parálisis supranuclear progresiva el reflejo palmomentoniano presenta una anormal distribución de la respuesta en los músculos faciales; el reflejo de sobresalto está ausente o reducido; el tiempo de reacción no experimenta aceleración tras un sobresalto acústico; además existe una alteración de la curva de recuperación de la excitabilidad del reflejo de parpadeo. En la enfermedad de Parkinson y en la atrofia multisistémica los hallazgos neurofisiológicos son similares tanto en lo que se refiere a las alteraciones en la recuperación de la curva de excitabilidad del reflejo de parpadeo como al efecto producido sobre el tiempo de reacción por un sobresalto acústico y a las respuestas faciales producidas por estímulos somestésicos periféricos. Las diferencias detectadas en el estudio neurofisiológico entre los distintos tipos de parkinsonismo pueden deberse a trastornos en la modulación que ejercen los ganglios basales sobre el núcleo pedúnculopontino y otros núcleos del tronco cerebral o bien ser la expresión de cambios estructurales específicos en circuitos retículoespinales.

L'AMPc té un paper clau com a missatger intracel.lular regulant la transmissió dels senyals extracel•lulars en diferents teixits i controlant múltiples processos cel lulars. Els nivells intracel.lulars d'AMPc es controlen mitjançant la seva síntesi, catalitzada per l'enzim adenilat ciclasa, i mitjançant la seva degradació a través de l'acció de les fosfodiesterases (PDE) de nucleòtids cíclics. Hi ha 11 famílies de PDEs. La PDE4 representa a una família de fosfodiesterases específiques d'AMPc formada per quatre gens paràlegs (PDE4-D), cadascun dels quals és capaç de generar múltiples variants d’splicing. La PDE4A, la PDE4B i la PDE4D es troben expressades en diferents tipus de cèl lules inflamatòries on tenen un important paper com reguladores dels processos inflamatoris. La inhibició selectiva, tant in vitro com in vivo, de PDEs ha demostrat tenir diferents efectes antiinflamatoris. En aquest treball es mostra la implicació de la isoforma PDE4B, i en concret la seva variant de splicing PDE4B2, durant el procés neuroinflamatori del model animal d’Esclerosis Múltiple, l’Encefalomielitis Autoimmune Experimental (d’EAE). Els resultats mostren un augment de l’expressió de l’ARNm de PDE4B2 a la medul•la espinal de ratolins EAE que correlaciona amb l’expressió d’alguns marcadors inflamatoris de forma dependent a la simptomatologia clínica dels animals. També s’observa que l’enzim PDE4B es trova localitzat principalment en cèl•lules presentadores d’antigen (APCs) com les cèl•lules dendrítques i els macròfags/micròglia. A més, els ratolins PDE4B-/- mostren una aparició temprana dels símptomes clínics en comparació amb els ratolins wildtype, amb alteracions en l’expressió de l’ARNm d’algunes citocines. L’alteració selectiva de la PDE4B2 en el model d’EAE en ratolí i la seva participació en el desenvolupament de la malaltia com s’ha observat en els animals PDE4B-/- presenta noves possibilitats sobre l’ús d’inhibidors selectius per les diverses isoformes (i variants d’splicing) tant per aplicacions terapèutiques com per investigar mecanismes d’inflamació en malalties neurodegeneratives. / Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis that courses with neuroinflammation, axonal damage and demyelination. The model is characterized by T- and B-cell responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein which produce a wide range of pro- and anti-inflammatory cytokines. The modulation of cAMP levels through pharmacological manipulation of phosphodiesterases (PDEs) provokes profound anti-inflammatory responses. In the EAE model, amelioration of the clinical signs and delayed onset is observed after PDE4 inhibition and the PDE4B gene has been related to the inflammatory immune response in mice. Here we analyzed post-immunization changes in the expression of mRNA coding for the PDE4B2 splice variant by semiquantitative real-time PCR and in situ hybridization. The results showed an upregulation of PDE4B2 mRNA in the spinal cord of EAE mice which correlates with FoxP3 and TGF-β mRNAs expression in a score-dependent manner. We also found that PDE4B enzyme is mainly localized in antigen-presenting cells (APCs) such as dendritic cells and microglia/macrophages. PDE4B-/- mice show an earlier onset of the disease compared to wildtype mice, with alterations in some cytokine mRNA expression. The results point to a protective role of the PDE4B enzyme and PDE4B2 splice variant in particular, during EAE pathogenesis by modulating cAMP levels in APCs and controlling the cytokine environment for T-cell differentiation.

L'objectiu general d'aquest treball és el d'aprofundir en l'estudi de les sinucleïnopaties, principalment a nivell bioquímic, en les interaccions de l'alfa-sinucleïna amb altres proteïnes del cervell humà per tal d'estudiar l'efecte de la unió en aquestes patologies. També hem volgut comprovar la similitud de les sinucleïnopaties humanes amb un model animal transgènic per a la forma humana mutada de l'alfa-sinucleïna. D'altra banda i també relacionat amb aquestes neurodegenarions, s'ha estudiat de quina manera resultaven afectats diferents marcadors de l'estrès oxidatiu, que se sap juga un important paper en el desenvolupament d'aquestes patologies. Mitjançant estudis d'immunoprecipitació i de pull-down en cervell humà s'ha trobat interacció de l'alfa-sinucleïna amb les proteïnes sinàptiques rab3a i rabfilina a córtex de la sinucleïnopatia anomenada Demència amb cossos de Lewy (DLBD), i no en cervells control. Donada la interacció anòmala amb aquestes proteïnes sinàptiques podem afirmar que a DLBDs la transmissió sinàptica es troba alterada, i una de les causes és la interacció anòmala de l'alfa-sinucleïna amb rab3a i rabfilina. Aquest tipus d'interacció també s'ha estudiat a l'MSA o Atròfia Sistèmica Múltiple, una sinucleïnopatia que té afectat sobretot el cerebel, i no el córtex, com les DLBDs. Doncs, tot i estar classificada com a sinucleïnopatia a part, hem observat la mateixa interacció anòmala tan a cerebel com escorça de pacients d'MSA, suggerint-se un mecanisme comú de neurodegeneració per a totes les sinucleïnopaties. Paral.lelament també hem estudiat la via de transducció glutamatèrgica a pacients amb DLBDs, i s'ha trobat que en condicions normals exiteix interacció de l'alfa-sinucleïna amb un efector del receptors metabotròpics del glutmat tipus I, com és la PLC-beta-1. Al mateix temps, i a través d'estudis de solubilitat, s'han observat canvis en la solubilitat de PLC-beta-1 en aquestes patologies, tal com succeeix amb l'alfa-sinucleïna.Quan s'han estudiat marcadors d'estrès oxidatiu per una forma primerenca de la malaltia de Parkinson s'han trobat alterats a córtex d'aquest pacients, quan la patología, en els primers estadis només es detecta fins ara a substància negra. Per tant, l'estrès oxidatiu a córtex d'una forma pre-clínica de la malaltia de Parkinson, ja té un paper en el desenvolupament d'estadis posterior de la malaltia, com podrien ser les DLBDs. / The aim of this work is to study alpha-synuclein interactions in human brain to deep on the knowledge of a group of neurodegenerative diseases called synucleinopathies in which alpha-synuclein accumulates in the form of Lewy bodies. In human cortex we found alpha-synuclein interactions with the synaptic proteins rab3a and rabphilin in Dementia with Lewy Bodies (DLBDs) patients, and not in control brains. This interaction is corroborated in transgenic mice expressing human A30P human mutated alpha-synuclein. When a different synucleipathy , like Multiple Systemic Atrophy (MSA), is studied we found the same anomalous interaction even different areas were affected, cerebellum vs cortex in the case of MSA and DLBDs, indicating a common neurodegenerative mechanism for the synucleinopathies group. Also in DLBDs we studied the glutamatergic signal transduction pathway immunoprecipitating alpha-synuclein from brain cortex and we found that PLC-beta-1, an effector of the metabotropic glutamate receptors (mGLuR1) binds to alpha-synuclein only in control conditions and not in DLBDs. At the same time PLC-beta-1 showed changes in solubility like alpha-synuclein in DLBDs. So, the results presented here indicate a kind of relation between alpha-synuclein and PLC-beta-1 in DLBDs which damage can affect the mGLuR1 transduction pathway which is altered in cortex from DLBDs.The other factor studied in this work is the oxidative stress effect in brain cortex from early stages Parkinson's disease (PD) patients. We found an increase of the oxidative stress markers used in this work indicating that oxidative stress in cortex from PD patients starts at early stages in human cortex, even though in early stages only the substantia nigra seems to be affected. This markers of oxidative stress were also studied in Alzheimer's disease (AD) obtaining similar results. Finally another point of this work is the study of the Amyloid Precursor Protein (A-beta-PP) mRNA isoforms in human cortex from DLBDs. We found a relative increase of the isoforms contained the Kunitz Protease Inhibitor, implicating A-beta-PP the isoforms processing in the developing of DLBDs

La activación glial es un proceso que se ha implicado en diversas patologías entre las que se incluyen diferentes enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer o la Esclerosis Lateral Amiotrófica. Esto se debe a que durante la activación glial se producen mediadores proinflamatorios, como la ciclooxigenasa (COX-2), el óxido nítrico (NO), factor de necrosis tumoral (TNF-alfa), la interleuquina-1 (IL-1) o la interleuquina-6 (IL-6), que presentan un potencial neurotóxico.El grupo de factores de transcripción C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins) pertenecen a la familia bZIP y está compuesta por seis miembros. C/EBP-alfa, C/EBP-beta y C/EBP-delta participan en procesos como la proliferación y diferenciación celular o el control del metabolismo. Además, estos factores de transcripción se encuentran implicados en procesos inflamatorios como la respuesta de fase aguda o la activación de macrófagos, donde regulan la transcripción de muchos mediadores proinflamatorios, que se han relacionado con los efectos más neurotóxicos de la activación glial. En este trabajo se ha caracterizado la expresión de C/EBP-alfa, C/EBP-beta y C/EBP-delta en los astrocitos y la microglía en condiciones basales y también durante la activación glial. En primer lugar, C/EBP-alfa se expresa principalmente en la microglía y sus niveles disminuyen de forma tiempo y concentración dependiente cuando las células se tratan con lipopolisacárido (LPS) como estímulo proinflamatorio. Además del LPS, que es un agonista del receptor TLR4, la activación de los receptores TLR2, TLR3 y TLR9 también produce la disminución de este factor de transcripción.La síntesis de C/EBP-delta tiene lugar tanto en astrocitos como en microglía durante la activación glial in vitro, cuando estas células se tratan con LPS. Los agonistas de los receptores TLR2, TLR3 y TLR9 producen un aumento similar al producido por el LPS en las células microgliales. Dicho aumento está mediado por la actividad del enzima ERK1/2 y supone un incremento de la unión de C/EBP-delta al promotor de COX-2. En la microglía activada, C/EBP-delta forma dímeros con otros factores de transcripción como p65 (un componente de NF-kB) y C/EBP-beta.Por su parte, C/EBP-beta se encuentra presente de una forma mayoritaria en las células microgliales, aunque también se encuentra en menor cantidad en los astrocitos. El tratamiento con LPS supone el aumento tiempo y concentración dependiente de los niveles nucleares de C/EBP-beta gracias a la síntesis del novo. Este aumento está mediado por la enzima JNK. Para estudiar la funcián de C/EBP-beta en la activación glial se han generado clones de la línea microglial BV2 que sobreexpresan LIP, una isoforma de C/EBP-beta que actúa como un dominante negativo y se han utilizado ratones deficientes en C/EBP-beta. La inhibición de C/EBP-beta supone una atenuación en la producción del ARNm de los mediadores proinflamatorios NOS-II, COX-2 e IL-6 cuando las células gliales se activan, y también en la producción de NO cuando las células se tratan con LPS e IFN-gamma.Los resultados de este trabajo sugieren la implicación de C/EBP-alfa, C/EBP-beta y C/EBP-gamma en la regulación de la síntesis de diversos mediadores proinflamatorios, y su importancia en la parte más neurotóxica de la activación glial.

DE LA TESIS:Una de las consecuencias de los avances científicos y tecnológicos del ultimo siglo es el aumento de esperanza de vida en las sociedades modernas lo que, en términos demográficos, se traduce en un incremento en la media de edad de la población. Sin embargo, este envejecimiento progresivo comporta una mayor incidencia en la sociedad de enfermedades que se manifiestan a edades avanzadas, destacando las que afectan al sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer o la de Parkinson. El dramático incremento en la incidencia de este tipo de enfermedades se ha traducido en una sensibilización social frente a ellas, así como en un creciente interés en el estudio de los procesos neurodegenerativos asociados a la edad y en su posible tratamiento.La etiología de la muerte neuronal en los procesos de neurodegeneración continúa siendo un enigma por descifrar pero cada vez se sabe más acerca de las causas y trastornos que la envuelven. Un factor que parece estar implicado directamente en estos procesos es el glutamato, el neurotransmisor excitador mayoritario del sistema nervioso central. La paradoja de ésta molécula estriba en que a pesar de estar implicada en procesos fisiológicos normales como el aprendizaje, la memoria o la construcción de conexiones sinápticas durante el desarrollo, también puede ser tóxica para las neuronas. El glutamato juega un papel central en muchos procesos neurodegenerativos y está implicado en patologías tan diversas como la corea de Huntington, la epilepsia, el daño cerebral isquémico o la enfermedad de Alzheimer. El modo mediante el que el glutamato ejerce su función tóxica consiste en la sobreactivación de sus receptores sinápticos, provocando una serie de fenómenos patológicos que llevan a la muerte de la neurona y que son conocidos con el nombre de excitotoxicidad. El mecanismo por el que todo esto sucede es todavía objeto de estudio.Dentro de este marco, los objetivosprincipales sobre los que se fundamenta el trabajo aquí expuesto eran:- Caracterizar en términos histológicos, bioquímicos y funcionales la lesión excitotóxica de la rata creada en la vía septohipocampal por la microinyección en el septo medio de un agonista de los receptores del glutamato (el ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilsoxazol-4-propiónico, o AMPA) y comparar los efectos provocados en función de la dosis administrada con los que aparecen en función del tiempo postlesión transcurrido.- Bajo las condiciones de neurodegeneración seleccionadas, estudiar in vivo las respuestas adaptativas de los sistemas de activación e inhibición hipocampales controlados por los núcleos de la región septal para así establecer la relevancia de cada sistema en este modelo animal.- De forma paralela y en otro modelo animal de aprendizaje y memoria en el que previamente se habían caracterizado variaciones de los receptores hipocampales del glutamato, nos propusimos estudiar el origen celular del aumento de receptores AMPA asociados al deterioro cognoscitivo provocado por el envejecimiento.- Investigar la posible relación entre la vulnerabilidad humana a la hipoxiaisquemia durante el periodo perinatal, la calcificación cerebral en el mismo periodo y su evolución, con el fin de establecer posibles paralelismos con la lesión excitotóxica inducida en nuestro modelo en diferentes condiciones de dosis y tiempo.- Analizar los mecanismos moleculares que puedan estar interrelacionados para dar lugar tanto a la formación de precipitados intracelulares de calcio como a la progresividad del proceso neurodegenerativo.

El presente trabajo está centrado en la posible relación entre la formprecursora del Factor de Crecimiento de Neuronas (pro-NGF) y la muertecelular inducida durante el patogénesis de la Enfermedad de Alzheimer (EA).Hemos estudiado el efecto fisiológico de pro-NGF aislado de cerebrohumano, utilizando diversos modelos celulares expresores de p75NTR. Enpresencia de pro-NGF aislado de cerebro afectado por EA (hbi-pro-NGF) seobserva una fuerte inducción de apoptosis. El pro-NGF aislado de cerebroshumanos control no es capaz de inducir muerte celular en los modelosestudiados.P75 NTR esta descrito como receptor especifico para pro-NGF.Hemos observado niveles aumentados de su producto de procesamiento p75ICD en tejido de cerebro afectado de EA.En los modelos celulares estudiados, la inducción de apoptosis esposterior al procesamiento de p75NTR con liberación de su dominio intracelular(ICD). La liberación de p75NTR ICD depende de γ-Secretasa. La actividad deγ-Secretasa es imprescindible para la inducción de apoptosis. El fragmento ICDliberado se transloca hacia el núcleo. Hbi-pro-NGF aislado de cerebro controlno es capaz de inducir procesamiento de p75NTR, ni translocación de su ICD.Los niveles de modificaciones post-tranductionales no enzimáticos depro-NGF en hippocampo y en cortex entorhinal, se muestran aumentados enlos cerebros humanos afectados por EA.Pro-NGF modificado in vitro por glyoxal y methylglyoxal demuestra unaaumentada resistencia al procesamiento por furina y por consíguente unacapacidad más elevada de inducir muerte celular por p75NTR. Ratonesinyectados en ventrículo cerebral con este pro-NGF modificado presentandificultades significativas en procesos de aprendizaje comparados con losratones inyectados con pro-NGF no modificado y con ratones inyectados conBSA modificado de misma manera.Los resultados descritos hasta ahora abren una posible vía deinterpretación de los efectos de pro-NGF en cerebro humano durante desarrollode EA pudiendo ser causantes de neurodegeneración a través de una viadependiente de γ-Secretasa y activación de p75NTR. / The aim of the present work is to investigate a possible relationshipbetween the pro-form of the Neurotrophic Growth Factor (pro-NGF) and the celldeath induced during pathogenesis of Alzheimer Disease (AD).We studied the physiological effect of pro-NGF isolated from humanbrain (hbi-pro-NGF) in different cell models that express p75NTR. We show thathbi-pro-NGF is a potent pro-apoptotic agent. Interestingly, the hbi-pro-NGFisolated from control human brain was shown to be unable to induce cell deathin the used models.The specific receptor of pro-NGF was described to be p75NTR. Wedescribe that higher amounts of its processing products - p75NTR ICD, areobserved in brain tissue affected from AD.In the cellular models that we used, the induction of apoptosis waspreceded by processing of p75NTR with liberation of its ICD. p75NTRprocessing is γ-Secretase dependent. The induction of pro-apoptotic effect wasshown to be entirely dependent of γ-Secretase activity. Released p75NTR ICDis shown to be translocated to nuclei. Hbi-pro-NGF isolated from control brain isnot able to induce processing of p75NTR neither translocation of its ICD.The levels of non enzymatic post-translational modifications of pro-NGFin the hippocampus and enthorinal cortex increase in AD affected brains. Thiscan explain the greater stability and elevated physiological activity of pro-NGFisolated from human brains affected with AD.The in vitro modified pro-NGF by glyoxal and methylglyoxal showsgreater resistance against the furine cleavage and consequently greater abilityto induce cell death trough p75NTR. Mice intracerebroventricularly injected withthis modified rh-pro-NGF present significant learning difficulties compared withcontrols intracerebroventricularly injected with non modified pro-NGF and evengreater differences compared with modified BSA.The results that we describe suggest the possibility that highest levels ofnon enzymatic modifications of pro-NGF in human brain during the progress ofAD could lead to neuron loss by a γ-Secretase dependent activation ofp75NTR.

La hipòtesi de treball d'aquesta tesi es que les malalties neurodegenerativespoden considerarse formes accelerades de l'envelliment, selectives per adeterminades localitzacions anatòmiques del teixit nerviós. D'acord a això, aquellsprocessos subjacents a les bases biològiques de l'envelliment (estrès oxidatiu,accumulació de proteïnes agregades, disfunció mitocondrial) i les sevesconseqüències son més intenses i prematures en aquestes poblacions cel.lulars.L'objectiu d'aquest treball es investigar la possible relació entre estrès oxidatiu ide retícle (ER) i les vies de senyalització iniciades per ambdós processos, com amecanisme patogènic en el desenvolupament de les malalties neurodegeneratives, dediferents localitzacions i caracteritzades per la presència d'agregats proteics. Així,hem caracteritzat la modificació oxidativa proteica, els seus causants més importants iles seves conseqüències fisiopatològiques en la forma esporàdica de l'esclerosi lateralamiotròfica (ELA) amb inici lumbar, en la taupatia frontotemporal malaltia de Pick(MdP) i en la malaltia de granuls argirofílics (MGA). Els resultats dels analisis demostres de pacients amb ELA s'han comparat amb els obtinguts en models in vitro dela malaltia.Desprès de la caracterització anatomopatològica exhaustiva, les mostres demèdul.la espinal (ME) i d'escorça frontal (EF) de malalts amb ELA, d'escorça occipital(EO) i EF de malalts amb MdP, i d'hipocamp (HC) de malalts amb MGA, es varenanaltizar en comparació amb mostres d'individus sans amb edats comparables. Laconcentració de marcadors de vies específiques de modificació oxidativa proteica(oxidació directa, glicoxidació i lipoxidació), així com la composició en àcids grasos esva analitzar mitjançant espectrometria de masses combinada amb separaciócromotogràfica. Com a factors reguladors d'oxidació proteica es varen emprar laquantitat de complexes respiratoris mitocondrials, sistemes de defensa antioxidant isistemes proteolíticis, estimats mitjançant western-blot. A més s'establí, emprant lamateixa metodologia, les conseqüències en forma d'ER i de resposta a proteïnesdesplegades (RPD). Així mateix, s'estimà la biogènesi mitcondrial mitjançant anàliside la quantitat de factors reguladors de la mateixa, mitjançant western-blot.Les mostres dels pacients amb ELA mostraren increments en els marcadorsd'oxidació directa, glicoxidació i lipoxidació en ME, i, de forma menys important, enmostres d'EF. Això s'associava a un increment en peroxidizabilitat lipídica, i a unadisminució de respostes neuroprotectores, degut a la disminució en el contingut d'àciddocosahexaenoic, i a alteracions proteasomals i en el contingut de complexesrespiratoris mitocondrials. Es va evidenciar estrés de reticle en ME, però no a l'EF.Així, es va concloure que l'ELA esporàdica duu a increments en lesió oxidativaproteica i a estrés de reticle en ME, mentres que a EF, hi ha menys afectació, bo i noestar indemne.D'altra banda, en mostres de EF, però no en EO de MdP, es varen detectarevidències compatibles amb estrés de reticle, com la RPD, associada a deplecció dexaperones de reticle. Aquestes troballes es relacionen amb un increment en laubiquitinització, compatible amb alteracions en l'activitat proteasomal. En EF, es varentrobar increments en lesió oxidativa directa i lipoxidació, afectant a enzimsantioxidants, amb disminució en la concentració de marcadors de glicoxidació.Sorprenentment, es varen evidenciar increments a la majoria de marcadors de lesióoxidativa en EO, localització morfològicament preservada a la MdP. Els canvispresents en aquesta malaltia s'associaven a canvis en la dotació de complexesrespiratoris mitocondrials, compatibles amb pèrdues de biogenesi mitocondrial i dedefensa antioxidant, combinats amb deplecció de l'àcid docosahexaenoic, consideratun neuroprotector, en EF. En aquest context, el contingut dels factors de transcripciórelacionat amb respostes antioxidants i amb biogènesi mitocondrial, mostrarendisminucions significatives en EF i de forma menys marcada, a EO. En contrast,mentres que a EO es va veure increment d'estrés oxidatiu, les cadenes respiratoriesmitocondrials i la biogenesi no semblaven afectades, de forma conjunta amb unincrement d'àcid docosahexaenoic, suggerint una resposta apropiada a l'estrésoxidatiu.L'anàlisi dels marcadors d'estrés oxidatiu en HC de MGA revelarendisminucions significatives en marcadors de glicoxidació, de manera similar a MdP,troballes compatibles amb un dèficit glicolitic. Aquests defectes glicolítics, s'han descritpreviament en altres malalties neurodegeneratives i podrien associarse amodificacions oxidatives d'enzims glicolítics, també evidenciats aquí. Això suggerreixun paper preferencial d'altres modalitats de lesió oxidativa, com la lipoxidació, comevidencien els increments en concentració de malondialdehid-lisina en aquestamalaltia. La medició dels carbonils proteics va reforçar l'existència d'estrés oxidatiu aHC, atribuible a la disfunció mitocondrial, evidenciada per canvis en complexes i en elnombre de mitocondris. Així mateix, diverses molecules clau en la RPD varen mostrarincrements a les mostres procedents de malalts de MGA, causant increments a lesxaperones de reticul endoplasmàtic. De forma remarcable, a pesar de les troballescompatibles amb la reducció mitocondrial, els factors transcripcionals implicats en laseva biogènesi no s'elevaren, suggerint que un defecte en biogènesi mitocondrialpodria estar implicat a la patogenesi de la MGA.Els resultats descrits a la present memòria de tesi, indiquen la relació entreestrés oxidatiu i de retícul endoplasmàtic, en ELA, MdP i MGA, suggerint la sevarelació recíproca, a travès de disfunció proteolítica, i un paper clau de la funciómitocondrial, o la seva pèrdua, conduint al procès neurodegeneratiu. / La hipótesis a contrastar en esta tesis es que las enfermedadesneurodegenerativas (ENDs) pueden ser una forma acelerada del envejecimiento,selectiva para determinadas localizaciones anatómicas del tejido nervioso.Consiguientemente, aquellos procesos subyacentes en las bases biológicas delenvejecimiento (estrés oxidativo, acumulación de proteínas con alto grado deagregación, disfunción mitocondrial) y sus consecuencias son más intensas yprematuras en estas poblaciones celulares.El objetivo de este trabajo es investigar la posible interrelación entre estrésoxidativo y de retículo (ER) y vías de señalización iniciadas por ambos procesos,como mecanismo patogénico en el desarrollo de ENDs de diferentes localizaciones ycaracterizadas por la presencia de agregados proteicos. Así, hemos caracterizado lamodificación oxidativa proteica, sus causantes más importantes y sus consecuenciasfisiopatológicas en la forma esporádica de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) coninicio lumbar, en la taupatía frontotemporal enfermedad de Pick (EdP) y en laenfermedad de granos argirofílicos (EGA). Los resultados de los análisis de muestras de pacientes con ELA se ha comparado con los obtenidos en modelos in vitro de laenfermedad.Tras caracterización anatomopatógica exhaustiva, las muestras de médulaespinal (ME) y de córtex frontal (CF) de pacientes de ELA; de córtex occipital (CO) yCF de enfermos de EdP, y de hipocampo (HC) de pacientes con EGA, se analizaronen comparación con muestras de individuos sanos con edades comparables. Laconcentración de marcadores de vías específica de modificación oxidativa proteica(oxidación directa, glicoxidación y lipoxidación), así como la composición en ácidosgrasos se analizaron mediante espectrometría de masas combinada concromatografía. Como factores reguladores de oxidación proteica se tomaron lacantidad de complejos respiratorios mitocondriales, sistemas de defensa antioxidantey sistemas proteolíticos, estimados mediante análisis de wester-blot. Además, seestableció mediante la misma metodología, las consecuencias en forma de ER y derespuesta a proteínas desplegadas (RPD). Asimismo, se estimó la biogenésismitocondrial mediante análisis de la cantidad de factores reguladores de la misma,mediante western-blot.Las muestras con ELA mostraron incrementos en los marcadores de oxidacióndirecta, glicoxidación y lipoxidación en ME, y, de forma menor cuantitativamente, enmuestras de CF. Ello se asoció a un incremento en la peroxidizabilidad lipídica, y auna disminución de respuestas neuroprotectoras debido a la disminución en el contenido de ácido docosahexaenoico y a alteraciones del proteasoma y en elcontenido de complejos respiratorios mitocondriales. Se evidenció estrés de retículoen ME, pero no en CF. Consiguientemente, se concluyó que la ELA esporádicaconlleva incremento en lesión oxidativa proteica y a estrés de retículo en médulaespinal, mientras que el CF, muestra menor afectación, pero no esta indemne.Por otro lado, en muestras de CF, pero no en CO de EdP, se detectaronevidencias de estrés de retículo, como RPD, asociadas a pérdida de chaperonas deretículo. Estos hallazgos se relacionan con un incremento en la ubiquitinizacióncompatible con alteraciones en la actividad proteasomal. En esta localización (CF), sehallaron incrementos en lesión oxidativa directa y lipoxidación, dirigidas a enzimasantioxidantes, con disminución en la concentración de marcadores de glicoxidación.Sorprendentemente, se demostraron incrementos en la mayoría de marcadores delesión oxidativa en CO, localización morfológicamente preservada en EdP. Loscambios presentes en esta enfermedad se asociaron a cambios en la dotación decomplejos respiratorios mitocondriales, compatibles con pérdida de biogénesismitocondrial y de defensa antioxiante, combinados con depleción del ácidodocosahexaenoico, considerado como neuroprotector, en CF. En este contexto, elcontenido de los factores de transcripción relacionados con respuestas antioxidantesy con biogénesis mitocondrial, mostraron cambios significativos en CF y menosmarcados en CO. En contraste, mientras que en CO se observó incremento en lesiónoxidativo en EdP, las cadenas respiratorias mitocondriales y la biogénesis podríanestar preservadas, de forma conjunta con un incremento de ácido docosahexaenoico,sugiriendo una respuesta apropiada al estrés oxidativo.El análisis de los marcadores de estrés oxidativo en HC de EGA revelarondisminuciones significativas en marcadores de glicoxidación, de modo similar a EdP,hallazgos compatibles con un déficit de glicolisis en esta situación. Estos defectos sehan descrito previamente en otras ENDs y pueden asociarse a modificacionesoxidativas de enzimas glicolíticos, tambien evidenciados aquí. Ello sugiere un papelpreferencial de otros modos de lesión oxidativa, como la lipoxidación, como evidencian los incrementos en concentración de malondialdehido-lisina en estaenfermedad. La medición, mediante western-blot, de los carbonilos proteicos reactivosreforzó la existencia de estrés oxidativo en HC, atribuible a la disfunción mitocondrialevidenciable por cambios en la función respiratoria y en su número. Asimismo,diversas moléculas clave en la RPD mostraron incrementos en las muestrasprocedentes de enfermos, causando incrementos en chaperonas de retículoendoplasmatico. De forma remarcable, a pesar del número reducido de mitocondrias,los factores transcripcionales implicados en su biogénesis no se elevaron, sugiriendo que un defecto en biogénesis mitocondrial puede estar implicado en la patogénesis deEGA.Los resultados descritos en esta memoria de tesis indican la interrelación entreestrés oxidativo y de retículo endoplasmatico, en ELA, EdP y EGA sugiriendo surelación recíproca a través de disfunción proteolítica, y un papel clave de la funciónmitocondrial, conduciendo al proceso neurodegenerativo. / It is hypothesized that the neurodegenerative diseases (NDDs) could be anaccelerated form of aging selective for nervous tissue in specific anatomic locations.Accordingly, the processes observed in the biological basis of aging (oxidative stress,accumulation of highly modified protein aggregates, mitochondrial dysfunction) and theensuing processes that it triggers are more intense and premature in these cellpopulations.The aim of this work was to investigate the potential interplay betweenoxidative and endoplasmic reticulum (ER) stress and the underling signallingpathways, as a potential mechanism involved in the pathogenesis of theneurodegenerative disorders affecting different locations, and characterized by proteinaggregates. We characterized protein oxidative damage, its major contributors and itspathophysiological consequences in the sporadic form of amyotrophic lateral sclerosis(ALS) patients with lumbar onset disease, in the frontotemporal tauopathy Pick'sdisease (PiD) and in the argyrophilic grain disease (AGD) patients. The results of ALSsamples were compared with in vitro models of the disease.After extensive pathological characterization, samples from spinal cords (SC)and frontal cortex (FC) from ALS patients, FC and occipital cortex (OC) from PiDpatients, and hippocampus (HC) from AGD patients were analyzed in comparison withage-matched control samples. The concentration of markers for specific pathways ofprotein oxidative damage (direct oxidation, glycoxidation and lipoxidation) and fattyacid composition were assessed by mass spectrometry. Contributors to proteinoxidation (mitochondrial respiratory complexes, antioxidant defence and proteolysis)and its consequences (endoplasmic reticulum stress and/or unfolded protein response(UPR)) were evaluated by western-blot of specific markers. Furthermore, themitochondrial biogenesis system was assessed by measuring by western blot thelevels of key factors.ALS was associated to increased direct oxidative, glycoxidative and lipoxidativedamage in SC and, to a lower extent, in FC samples. This was associated to increasedlipid peroxidizability, and to impaired neuroprotective responses because of decreaseddocosahexaenoic content as well as alterations of the mitochondrial respiratorycomplexes and proteasomal impairment. Endoplasmic reticulum stress was evidencedin SC, but not in FC. Therefore, it could be concluded that sporadic ALS leads toincreased oxidative damage in proteins and to ER stress in SC, while FC is lessaffected, but not preserved.In samples from FC, but not in OC of PiD, there were evidences of ER stresssuch as activated UPR, associated to specific depletion in ER chaperones. Thosefindings are related to increased ubiquitination compatible with alteration in ubiquitinproteasomesystem. In the same location, evidences for increased direct oxidative andlipoxidative damages targeting antioxidant enzymes were found, with decreasedamount of glycoxidation markers. Strinkingly, increases in most of the examinedparameters of oxidative stress in morphologically preserved OC of PiD patients weredetected as well. The changes registered in PiD could be associated with disturbancesin mitochondrial respiratory complexes compatible with diminished mitochondrialbiogenesis and lack of antioxidant defence, combined with depletion in the contents ofthe neuroprotective docosahexaenoic acid observed in FC. In this line, the content ofthe transcription factors related to antioxidant responses and mitochondrial biogenesisshowed significant changes in FC but less marked in OC. In contrast, while OCshowed increased oxidative damage, mitochondrial respiratory chain and biogenesiswere preserved, a finding associated to increased docosahexaenoic content,suggesting an appropriate response to the generated increase in oxidative stress.Analysis of various oxidative stress biomarkers in HC of AGD revealedsignificantly decreased levels of the markers of glycoxidation, similarly to PiD, which iscompatible with defects in glycolytic potential in this location. Those defects have beenpreviously reported in other NDDs and may be associated to oxidative modifications ofglycolytic enzymes also evidenced here. There were no changes in the concentrationsof direct protein oxidation markers. This suggests a preferential role of other forms ofoxidative damage, such as lipoxidation, as evidenced by increased malondialdehydelysinelevels in this disease. Western blot measurements also revealed increasedprotein reactive carbonyl groups further supporting elevated oxidative damage in HCof AGD samples, which can be attributed to the mitochondrial dysfunction evidencedby disturbance in the respiratory chain function and reduced mitochondria number.Furthermore, the key molecules critically involved in UPR were found activated, whichcaused elevation in ER chaperones. Most importantly, despite the reduced number ofmitochondria, transcription factors for their biogenesis were not increased, suggestingthat impaired mitochondria biogenesis may be implicated in AGD pathogenesis.The described results indicate the implication of oxidative and endoplasmicreticulum stress in sporadic ALS, PiD and AGD suggesting a possible interplaybetween them through proteolysis dysfunction, with a predominant role ofmitochondrial impairment leading to the neurodegenerative process.

The aim of this 4 year long work was to study the Connexin32 (Cx32), a protein that forms hemichannels anchored in the plasma membrane. Two hemichannels of adjacent cells form a gap junction. Mutations in Cx32 have been associated to the X-linked form of Charcot-Marie-Tooth disease, a neurodegenerative illness affecting the peripheral nervous system. Cx32 is expressed in Schwann cells, in the paranodal zones. Using Xenopus laevis oocytes to express Cx32 hemichannels, we have monitored simultaneously the release of ATP and the ionic currents. ATP in the medium was detected with luciferin-luciferase reaction and the ionic currents were recorded under two electrode voltage clamp. Depolarization of oocytes expressing Cx32, from -40mV to +80mV induced an outward current and at the end of the pulse a transitory peak of ATP release. Using Cx32 transfected HeLa cells, we captured the luminescence due to ATP release, when cells were under a hypotonic solution containing luciferin-luciferase mixture. Isotonic solution was 280 mOsm and hypotonic solution was 150 mOsm. We also studied the release of ATP in Schwann cell cultures and again the hypotonic conditions induced a rapid increase of extracellular ATP. Finally, when we repeated the voltage clamp experiments expressing Cx32 and also syntaxin 1A, we saw a partial inhibition that of the currents and the release of ATP, which didn't happen when we repeated the hypotonic shock with HeLa cells expressing Cx32 and syntaxin. In order to keep on working in the ATP release through Cx32 hemichannels and its relation with CMT disease five different mutation already described in CMTX patients were generated in the lab, to study the ATP release through Cx32 mutated hemichannels in TEVC experiments with oocytes and transfecting mammal cells. This last part is not finished but it is conyinued by a predoctoral student of Dr. Solsona. / L'objectiu d'aquest treball desenvolupat Durant 4 anys ha estat estudiar la Connexina32 (Cx32), sis unitats d'aquest proteína formen un hemicanal anclat a la membrana plasmàtica, dos hemicanals de cèl·lules adjacents formen una unió tipus gap. Mutacions en la Cx32 s'han relacionat amb la forma lligada al cromosoma X de la malaltia de Charcot-Marie-Tooth, una malaltia neurodegenerativa perifèrica. La Cx32 s'expressa en molts teixits però les mutacions només afecten les cèl·lules de Schwann, on la Cx32 s'expressa als paranodes i a les cissures d'Schmidt-Lanterman. Utilitzant oòcits de Xenopus per expressar Cx32, hem mesurat l'alliberació d'ATP i la corrent generada després de sotmetre el oòcits a una despolarització. L'ATP es va detectar utilitzant els enzims luciferina i luciferasa i les corrents utilitzant el sistema de fixació de voltatge amb dos elèctrodes. Després vem estimula electricament nervi ciàtic sencer de rata i ratolí i vem poder captar alliberació d'ATP amb preferència per certes regions diferènciades. Per tal de diferenciar si aquest ATP alliberat provenia de les cèl·lules de Schwann i no dels axons de les neurones també vam estudiar l'alliberació d'ATP en cèl·lules de Schwann en cultiu i el xoc hipotònic també provoca alliberació d'ATP. Vem veure que les cèl·lules de Schwann alliberen ATP però no si ho fan a través de connexines. Primer vem realitzar inmunofuorescències per detectar la presència i posició de les connexines expressades a les cel·lules de Schwann (Cx32, Cx29 i Cx43) i vem trobar presència de Cx32 i Cx29 en les regions paranodals i a les cissures d'Schmidt-Lanterman, i Cx43 al llarg de la veina formada per la cel·lula de Schwann, amb certa preferència per les regions paranodals. Finalment, donada la periodicitat de la Cx32 era un bon candidat per l'alliberació d'ATP a través de les c'el·lules de Schwann que envolten els axons del nervi ciàtic, per veure i la Cx32 alliberava ATP vem Utilitzar cèl·lules HeLa transfectades amb Cx32 i vam capturar l'alliberació d'ATP després d'un xoc hipotònic, també utilitzant la luciferina i la luciferasa, però no vem trobar diferències entre les cèl·lules transfectades amb Cx32 i les que no ho estaven. Així, la Cx32 no allibera ATP en resposta a un estímul hipotònic, però podria en resposta a una depolarització, l'estíml fisiològic que activa l'obertura d'hemicanals de Cx32. Finalment, en experiments de fixació de voltatge expressant la Cx32 amb sintaxina 1A hi havia una inhibició parcial de les corrents d'entrada i de sortia, i de l'ATP alliberat, inhibició que no es va reproduir en els experiments de xoc hipotònic en cèl·lules HeLa transfectades amb Cx32 i sintaxina. Per seguir traballant en la línia de l'estudi de la Cx32 i l'alliberació d'ATP, i la relació que això pot tenir an el desenvolupament de la malaltia de CMT es van triar i generar cinc constructes de Cx32 humana amb mutacions diferents descrites en malalts de CMTX, per tal d'observar l'alliberació d'ATP a través d'hemicanals de Cx32 mutada tant en els experiments de TEVC amb oòctis, com en experiments amb cèl·lules de mamífer transfectades. Aquesta darrera part no va ser acabad però en l'actualitat està esssent realitzada per un altre becari predoctoral del Dr. Solsona.

Numerosos estudios han relacionado la enfermedad de Alzheimer (EA) con defectos mitocondriales. Tales defectos incluyen anomalías de tipo estructural, bioquímico y genético. Entre las de tipo genético destacan los reordenamientos y las mutaciones puntuales descritas en el DNA mitocondrial (mtDNA). Otros estudios no han podido confirmar esos hallazgos. Objetivo: Estudiar la incidencia de defectos en el mtDNA (mutaciones puntuales, reordenamientos, depleción, reducción en la expresión de genes mitocondriales) de pacientes con EA y la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial y determinar las posibles diferencias respecto a individuos control. Pacientes y métodos. Necropsias de cerebelo, córtex frontal e hipocampo de pacientes con EA y controles. También se dispuso de sangre de enfermos vivos diagnosticados de EA y de controles. Resultados: No se observaron diferencias entre pacientes y controles, ni en tejidos cerebrales ni en sangre en los análisis realizados mediante Southern. No se halló asociación entre las mutaciones puntuales analizadas, reordenamientos, depleción o reducción en la expresión de genes mitocondriales y la EA. Pacientes y controles mostraros similares tasas de respiración y actividades enzimáticas de los complejos respiratorios, tampoco hubo diferencias significativas al estudiar la peroxidación (indicador del estrés oxidativo) en pacientes y controles. Conclusiones. Los resultados obtenidos no apoyan la hipótesis de una implicación mitocondrial en la EA en los pacientes analizados, lo cual no descarta la posible existencia de otras mutaciones puntuales en otras regiones no analizadas y/o eventualmente de otros defectos mitocondriales no analizados en esta tesis que contribuyan al desarrollo de la EA. / There is mounting evidence for mitochondrial involvement in neurodegenerative diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis. Defects in mitochondrial oxidative phosphorylation have frequently been associated with Alzheimer's disease (AD). Cybrid technology has facilitated the study of energy metabolism in AD, suggesting that the most consistent mitochondrial electron transport chain (ETC) defect reported in AD, a deficit in cytochrome c oxidase, could be determined by the mitochondrial genome (mtDNA). These and other findings have raised the issue of whether genetic alterations, inherited or acquired, underlie the disordered energy metabolism. The study of mitochondrial genetics in AD patients has been performed with the idea that any mtDNA defect has potential consequences in ETC, contributing to mitochondrial dysfunction through ATP production impairment, which could interfere among others, with calcium homeostasis, amyloid metabolism and reactive oxygen species generation, enhancing the susceptibility of neurons to cell death.