Nucleosides analogues have become an important class of agents for both viral and cancer chemotherapy. Bicyclic nucleosides have restricted conformational mobility, and have been widely used in the synthesis of new oligonucleotides. In this Ph D we've developed a new synthetic strategy for the synthesis of new bicyclic nucleosides by using glucose as starting material. Our synthesis is based in the obtention of a bicyclocarbohydrate through the transformation of a cyclic sulphite by treatment in basic media. The coupling of the bicyclic carbohydrate with the nitrogenated base has been accomplished using Niedballa and Vorbrüggen conditions. Bicyclic analogues of ddC and ddA have been obtained with good yields after conventional transformations. Conformational analyses of these compounds have been done with different experimental procedures and applying PSEUROT program. In vitro essays of our compounds gave no biological activity.Some branched nucleosides are effective against different kinds of viruses and bacterias. Particularly, some natural psiconucleosides are potent antibiotics and/or antitumoral drugs. In our research, we've been interested in the obtention of new nucleosides branched at the anomeric position, using mannitol or glycidol as starting materials. The key step of this synthesis was the obtention of the tetrahydrofuran unit through the cyclization of an alquenpoliol induced by iodine electrophiles. This compound has been transformed into an exoglycal by the treatment in basic media. The activation of the exocyclic double bond with a fluorine or an iodine electrophile followed by the nucleophilic attack of a nitrogenated base have led to the desired 1'-fluoromethyl and 1'-iodomethyl-nucleosides.2',3'-dideoxynucleosides are generally unstable because of the hydrolitic cleavage of the glycosidic bond. Isonucleosides are synthetic nucleosides with the nitrogenated base anchored at position 2' or 3', and are stable from the hydrolitic cleavage. In this Ph D, we've synthesized a new class of 2'-iso-2'-branched-nucleosides. The obtention of these compounds was planned through the activation of an exocyclic double bond with an electrophile, followed by the nucleophilic attack of a nitrogenated base. The tetrahydrofuran ring has been prepared through a radical cyclization of a propargyltioether or a propargylsulfone. / Les infeccions d'origen víric constitueixen actualment una causa molt important de malaltia i de mortalitat en tot el mon. Des de finals del segle XIX la vacunació ha constituït la primera resposta terepèutica eficaç contra la patogènesi viral, havent repotat nombrosos èxits en el tractament de diverses malalties. Actualment però, aquesta aproximació immunoterapèutica es veu limitada, fet que ha propiciat el desenvolupament de nous fàrmacs d'origen sintètic per a tractar aquest tipus de malalties. En aquest sentit, els anàlegs de nucleòsids ocupen un lloc preponderant en la llista de molècules aprovades per a ser utilitzades en clínica humana. En concret, aquests productes s'empren en el tractament de malaties com la SIDA i en diferents tipus de càncers i tumors.Els nucleòsids bicíclics tenen mobilitat conformacional restringida, i han estat àmpliament utilitzats en la síntesi de nous oligonucleòtids. En aquesta Tesi Doctoral s'ha desenvolupat una estratègia de síntesi de nous nucleòsids bicíclics, emprant la glucosa com a producte de partida. L'estratègia sintètica emprada transcorre a través d'un sulfit cíclic que condueix eficaçment a l'obtenció del biciclocarbohidrat mitjançant un tractament en medi bàsic. L'acoblament del carbohidrat bicíclic amb les diferents bases nitrogenades s'ha portat a terme emprant les condicions de Niedballa i Vorbrüggen, obtenint-se eficaçment els nucleòsids bicíclics anàlegs del ddC i del ddA després d'una sèrie de transformacions sintètiques convencionals. L'estudi conformacional dels compostos obtinguts s'ha realitzat emprant diferents tècniques experimentals i programes de càlcul. Els compostos preparats no han mostrat activitat inhibitòria contra els virus HIV i HBV en els assajos realitzats in vitro.Alguns nucleòsids que incorporen ramificacions en diferents posicions de l'anell de carbohirat han resultat ser eficaços contra diferents virus i bacteris. En aquest sentit, hem realitzat la síntesi de nous nucleòsids ramificats en posició anomèrica emprant el glicidol o el manitol com a productes de partida. L'etapa clau d'aquesta síntesi consisteix en l'obtenció de la unitat de tetrahidrofurà mitjançant una reacció de ciclació d'un alquenpoliol induïda per electròfils de iode. Aquest compost s'ha transformat en un exoglical mitjançant un tractament en medi bàsic. L'activació del glical exocíclic amb un reactiu electròfil de iode o fluor seguida de l'atac nucleòfil d'una base nitrogenada ha permès d'obtenir eficaçment l'1'-fluorometil i l'1'-iodometilnucleòsid d'interés.Els 2',3'-didesoxinucleòsids solen ser inestables front a la ruptura hidrolítica de l'enllaç glicosídic. Per tal de solventar aquesta deficiència s'ha desenvolupat la síntesi dels isonucleòsids, en els quals la base nitrogenada està ancorada als carbonis 2' o 3', mentres que es manté la relació cis amb el grup hidroximetil. Tenint en compte aquests antecedents, s'ha realitzat la síntesi de nous 2'-isonucleòsids ramificats en la posició 2'. L'obtenció d'aquests compostos s'ha plantejat a partir de l'activació d'un doble enllaç exocíclic amb un reactiu electròfil i posterior atac nucleòfil d'una base nitrogenada. L'anell de tetrahidrofurà s'ha preparat mitjançant una reacció de ciclació radicalària reductiva a partir d'un propargiltioéter o bé d'una propargilsulfona. / Las infecciones de origen vírico constituyen actualmente una causa muy importante de enfermedad y mortalidad en todo el mundo. Desde finales del siglo XIX la vacunación ha constituído la primera respuesta terapéutica eficaz contra la patogénesis viral, habiendo reportado numerosos éxitos en el tratamiento de numerosas enfermedades. Actualmente, esta aproximación inmunoterapéutica se ve limitada, hecho que ha propiciado el desarrollo de nuevos fármacos de origen sintético para tratar estas enfermedades. En este sentido, los análogos de nucleósidos ocupan un lugar preponderante en la lista de moléculas aprobadas para ser utilizadas en clínica humana. En concreto, estos productos se utilizan en el tratamiento de enfermedades como el SIDA y en diferentes tipos de cáncer y de tumores.Los nucleósidos bicíclicos tienen movilidad conformacional restringida, y han sido ampliamente utilizados en la síntesis de nuevos oligonucleótidos. En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado una estrategia de síntesis de nuevos nucleósidos bicíclicos, utilizando la glucosa como producto de partida. La estrategia sintética utilizada transcurre a través de un sulfito cíclico que conduce eficazmente a la obtención del biciclocarbohidrato mediante un tratamiento en medio básico. El acoplamiento del carbohidrato bicíclico con las diferentes bases nitrogenadas se ha llevado a cabo empleando las condiciones de Niedballa y Vorbrügen, obteniéndose eficazmente los nucleósidos bicíclicos análogos del ddC y del ddA después de una serie de transformaciones convencionales. El estudio conformacional de los compuestos obtenidos se ha realizado empleando diferentes técnicas experimentales y programas de cálculo. Los ensayos in vitro realizados a partir de estos compuestos han demostrado que no poseen actividad biológica.Algunos nucleósidos que incorporan ramificaciones en diferentes posiciones del anillo de carbohidrato han resultado ser eficaces contra diferentes virus y bacterias. En este sentido, hemos realizado la síntesis de nuevos nucleósidos ramificados en posición anomérica empleando el glicidol o el manitol como productos de partida. La etapa clave de esta síntesis consiste en la obtención de la unidad de tetrahidrofurano mediante una reacción de ciclación de un alquenpoliol inducida por electrófilos de yodo. Este compuesto se ha transformado en un exoglical mediante un tratamiento en medio básico. La activación del glical exocíclico con un reactivo electrófilo de yodo o de fluor seguida del ataque nucleófilo de una base nitrogenada ha permitido obtener eficazmente los 1'-yodometil y 1'-fluorometilnucleósidos de interés.Los 2',3'-didesoxinucleósidos suelen ser inestables frente a la ruptura hidrolítica del enlace glicosídico. Con el fin de solventar esta deficiencia se ha desarrollado la síntesis de isonucleósidos, en los cuales la base nitrogenada está anclada a los carbonos 2' o 3' mientras que se mantiene la relación cis con el grupo hidroximetilo. Teniendo en cuenta estos antecedentes, se ha realizado la síntesis de nuevos 2'-isonucleósidos ramificados en la posición 2'. La obtención de estos compuestos se ha planteado a partir de la activación de un doble enlace exocíclico con un reactivo electrófilo y posterior ataque nucleófilo de una base nitrogenada. El anillo de tetrahidrofurano se ha preparado mediante una reacción de ciclación radicalaria reductiva a partir de un propargiltioéter o bien de una propargilsulfona.

En los últimos años ha habido un incremento en la aparición de nuevas enfermedades infecciosas y en la reemergencia de otras que se consideraban ya controladas. La situación actual es preocupante porque muchos de estos nuevos agentes patógenos causan enfermedades graves. En muchas de estas infecciones, la resistencia a los fármacos se está convirtiendo en uno de los obstáculos principales para su control, con la aparición de cepas multiresistentes a los antibióticos normalmente utilizados. ¿Cuales son las claves para el éxito de estas bacterias patógenas? Para responder esta pregunta, se realizan estudios sobre los mecanismos por los cuales los microorganismos causan la enfermedad, es decir, la patogénesis. Pero también existen cuestiones importantes sobre la evolución de la patogénesis de estos microorganismos que continúan siendo una incógnita: ¿cuales son los factores que determinan la emergencia de un nuevo patógeno?, ¿cuando se desarrollan determinados clones patógenos?, ¿porqué cepas no patógenas presentan genes asociados a la virulencia? Los estudios de genética de poblaciones contribuyen a este conocimiento, proporcionando información sobre la estructura poblacional y la naturaleza de la variación genética que existe en las poblaciones naturales ya que la cantidad de variación genética de una población es un parámetro fundamental, debido a que determina el potencial evolutivo de ésta. Los cortos períodos de generación de la mayoría de las bacterias y el enorme tamaño de sus poblaciones, hace que los cambios evolutivos sean muy rápidos. La dinámica de aparición y selección de mutantes o la importancia relativa de la mutación y de la recombinación en estas poblaciones, son efectos esenciales para comprender los cambios epidemiológicos que se producen en ellas. Estudiar las poblaciones bacterianas también nos permite caracterizar las cepas de las especies patógenas; pero también es importante comprender las relaciones genéticas existentes entre cepas patógenas, causantes de la enfermedad, y cepas no patógenas de una misma especie bacteriana. La comparación entre ambas poblaciones puede ayudarnos a explicar los orígenes de las cepas patógenas e identificar las diferencias genéticas entre las dos. Se ha observado que, generalmente, se da una asociación aparente entre determinados clones de la bacteria, que se encuentran en pequeña proporción, y el desarrollo de una enfermedad; por tanto, esto sugiere que hay una menor diversidad en las cepas patógenas que en las de vida "libre". Estas observaciones han sugerido que la mayoría de las bacterias presentan una estructura poblacional clonal. Más recientemente, el aumento del número de bacterias estudiadas y la aplicación de técnicas moleculares, han dado lugar a la observación de que la estructura clonal de las poblaciones se puede "romper" por acción de la recombinación genética, aunque su papel no es igual en todas las especies bacterianas. La transferencia horizontal de genes tiene una gran relevancia en la epidemiología de las enfermedades causadas por bacterias patógenas. Se ha observado una marcada diferencia en el grado de recombinación entre cepas patógenas y cepas no patógenas, aunque no se conocen las causas. La adquisición de material extracromosómico tiene consecuencias importantes en la evolución de las bacterias, tanto a corto plazo, por la distribución horizontal de genes de resistencia, como a largo plazo, por la adquisición de nuevos determinantes de virulencia o propiedades metabólicas que puedan producir un cambio significativo en la patogenicidad o que afecten al hábitat ecológico donde residen. Por tanto, la variación genotípica en las poblaciones de los microorganismos patógenos, plantea importantes dificultades en el control de les enfermedades infecciosas (emergencia de nuevas cepas patógenas, aparición de poblaciones de bacterias resistentes a los antibióticos, dificultades asociadas a la obtención de vacunas contra microorganismos antigénicamente diversos o variantes).P. aeruginosa es una bacteria Gram negativa y cosmopolita, y es una de las principales causas de infecciones en cáncer, transplantes, quemados y en pacientes con fibrosis cística. Estas infecciones son muy difíciles de erradicar ya que este microorganismo presenta una elevada resistencia intrínseca a múltiples antibióticos, lo que lo hace responsable de infecciones nosocomiales de difícil tratamiento y de elevada morbi-mortalidad. En los últimos años se ha observado un incremento progresivo en la incidencia de cepas resistentes a diversos antibióticos de última generación como por ejemplo el imipenem y de cepas que presentan una sensibilidad disminuida simultáneamente a diversos grupos de antibióticos como penicilinas, cefalosporinas con actividad anti-pseudomónica, quinolonas y aminoglicósidos, situación que ha agravado notablemente la dificultad terapéutica que habitualmente comportan las infecciones causadas por este patógeno. ¿Tienen las cepas patógenas que viven en el interior de los hospitales alguna relación genética con las cepas que viven libremente en el entorno de éstos? ¿Qué mecanismos de resistencia han utilizado estas cepas patógenas para "evadir" la acción de los antimicrobianos utilizados contra ellas? En este trabajo hemos tratado de hacer una aproximación a la respuesta de estas preguntas, centrándonos en las poblaciones de Pseudomonas aeruginosa del hospital de Bellvitge y su entorno.La línea principal de investigación de nuestro grupo de trabajo se centra en los mecanismos moleculares de extensión de los caracteres de resistencia de las bacterias Gram negativas a los agentes antimicrobianos. La presente tesis se inscribe en el núcleo de la actividad del grupo. Se ha pretendido explorar las relaciones existentes entre aislamientos clínicos y ambientales de Pseudomonas aeruginosa en relación a la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.Este objetivo de carácter general se puede subdividir en los siguientes apartados: 1. Aislar cepas ambientales y seleccionar cepas clínicas aisladas en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Bellvitge.2. Determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de los distintos aislamientos y comparar las posibles diferencias de susceptibilidad entre los grupos.3. Explorar la contribución de las propiedades de la membrana externa a los perfiles de susceptibilidad a los antimicrobianos. 4. Analizar la variabilidad fenotípica y genotípica de los aislados en base a la información obtenida de metodologías moleculares como: perfiles electroforéticos de las proteínas de la membrana externa (OMPs), electroforesis en campo pulsante (PFGE) y amplificación de fragmentos de DNA con cebadores aleatorios (RAPD). 5. Elaborar un modelo aproximativo de la estructura de las poblaciones de P. aeruginosa en el ambiente "Hospital Universitario de Bellvitge" (Hospital y entorno).6. Estudiar la eventual presencia de integrones en los dos grupos de bacterias y determinar los genes que incorporan.7. Estudiar las mutaciones de la proteína OprD y su relación con la resistencia a los antibióticos en las cepas estudiadas.8. Realizar una aproximación al modelo estructural de la proteína OprD.Las conclusiones obtenidas después de llevar a cabo los experimentos para la consecución de los diversos obtenidos, son las siguientes: 1. Las cepas clínicas son más resistentes a los antibióticos que las cepas ambientales, debido a la fuerte presión que existe en el entorno hospitalario, y que favorece a las cepas que desarrollan mecanismos para evadir la acción de diferentes antimicrobianos. Estas diferencias en la susceptibilidad sugieren, además, cierto grado de aislamiento ecológico entre las dos poblaciones, ya que las cepas clínicas se encontrarían en un hábitat, que presenta una elevada presión selectiva por parte de los antibióticos y desinfectantes, y en cambio las cepas ambientales estarían en otro hábitat separado donde esta presión no existe.2. Técnicas que miden la variabilidad fenotípica y genotípica como las proteínas totales (PT), proteínas de membrana externa (OMPs), la electroforesis de campo pulsante (PFGE) y la amplificación de polimorfismos de DNA al azar (RAPD) utilizando el primer 208, confirman la distancia entre los aislados de los dos orígenes.3. El conjunto de los resultados nos sugiere que la población de P. aeruginosa en nuestro entorno (Hospital de Bellvitge y alrededores), podría ser una población clonal epidémica, en la cual todas las cepas provienen de una población ambiental muy diversa, y de la que un clon ha emergido para dar lugar a la población clínica que, una vez establecida, vuelve a diversificarse.4. La ausencia/presencia de la proteína OprD en la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa, no explica totalmente los patrones de resistencia/susceptibilidad observados en las cepas investigadas. 5. La existencia de cepas sensibles al imipenem que no presentan OprD en sus membranas externas, sugiere la presencia de otro mecanismo secundario de entrada del imipenem a las células, independiente de OprD.6. A falta de un modelo estructural basado en la cristalización, nuestro modelo tridimensional de la proteína OprD confirma las predicciones, anteriormente realizadas, de la estructura del heterómero del que está constituido esta porina.

El presente trabajo está centrado en la posible relación entre la formprecursora del Factor de Crecimiento de Neuronas (pro-NGF) y la muertecelular inducida durante el patogénesis de la Enfermedad de Alzheimer (EA).Hemos estudiado el efecto fisiológico de pro-NGF aislado de cerebrohumano, utilizando diversos modelos celulares expresores de p75NTR. Enpresencia de pro-NGF aislado de cerebro afectado por EA (hbi-pro-NGF) seobserva una fuerte inducción de apoptosis. El pro-NGF aislado de cerebroshumanos control no es capaz de inducir muerte celular en los modelosestudiados.P75 NTR esta descrito como receptor especifico para pro-NGF.Hemos observado niveles aumentados de su producto de procesamiento p75ICD en tejido de cerebro afectado de EA.En los modelos celulares estudiados, la inducción de apoptosis esposterior al procesamiento de p75NTR con liberación de su dominio intracelular(ICD). La liberación de p75NTR ICD depende de γ-Secretasa. La actividad deγ-Secretasa es imprescindible para la inducción de apoptosis. El fragmento ICDliberado se transloca hacia el núcleo. Hbi-pro-NGF aislado de cerebro controlno es capaz de inducir procesamiento de p75NTR, ni translocación de su ICD.Los niveles de modificaciones post-tranductionales no enzimáticos depro-NGF en hippocampo y en cortex entorhinal, se muestran aumentados enlos cerebros humanos afectados por EA.Pro-NGF modificado in vitro por glyoxal y methylglyoxal demuestra unaaumentada resistencia al procesamiento por furina y por consíguente unacapacidad más elevada de inducir muerte celular por p75NTR. Ratonesinyectados en ventrículo cerebral con este pro-NGF modificado presentandificultades significativas en procesos de aprendizaje comparados con losratones inyectados con pro-NGF no modificado y con ratones inyectados conBSA modificado de misma manera.Los resultados descritos hasta ahora abren una posible vía deinterpretación de los efectos de pro-NGF en cerebro humano durante desarrollode EA pudiendo ser causantes de neurodegeneración a través de una viadependiente de γ-Secretasa y activación de p75NTR. / The aim of the present work is to investigate a possible relationshipbetween the pro-form of the Neurotrophic Growth Factor (pro-NGF) and the celldeath induced during pathogenesis of Alzheimer Disease (AD).We studied the physiological effect of pro-NGF isolated from humanbrain (hbi-pro-NGF) in different cell models that express p75NTR. We show thathbi-pro-NGF is a potent pro-apoptotic agent. Interestingly, the hbi-pro-NGFisolated from control human brain was shown to be unable to induce cell deathin the used models.The specific receptor of pro-NGF was described to be p75NTR. Wedescribe that higher amounts of its processing products - p75NTR ICD, areobserved in brain tissue affected from AD.In the cellular models that we used, the induction of apoptosis waspreceded by processing of p75NTR with liberation of its ICD. p75NTRprocessing is γ-Secretase dependent. The induction of pro-apoptotic effect wasshown to be entirely dependent of γ-Secretase activity. Released p75NTR ICDis shown to be translocated to nuclei. Hbi-pro-NGF isolated from control brain isnot able to induce processing of p75NTR neither translocation of its ICD.The levels of non enzymatic post-translational modifications of pro-NGFin the hippocampus and enthorinal cortex increase in AD affected brains. Thiscan explain the greater stability and elevated physiological activity of pro-NGFisolated from human brains affected with AD.The in vitro modified pro-NGF by glyoxal and methylglyoxal showsgreater resistance against the furine cleavage and consequently greater abilityto induce cell death trough p75NTR. Mice intracerebroventricularly injected withthis modified rh-pro-NGF present significant learning difficulties compared withcontrols intracerebroventricularly injected with non modified pro-NGF and evengreater differences compared with modified BSA.The results that we describe suggest the possibility that highest levels ofnon enzymatic modifications of pro-NGF in human brain during the progress ofAD could lead to neuron loss by a γ-Secretase dependent activation ofp75NTR.