Memoria para optar el título de Bioquímico / Las Células Madre Mesenquimales (MSCs) se han propuesto como una nueva terapia para las enfermedades autoinmunes debido a la inmunosupresión que ejercen sobre linfocitos T. Sin embargo, estudios in vitro han demostrado que bajo ciertas condiciones, las MSCs son capaces de favorecer la generación de linfocitos T CD4+ IL-17+ (Th17) proinflamatorios pero siempre suprimen a linfocitos T CD4+ IFNy+ (Th1). En el siguiente trabajo, decidimos evaluar el efecto in vivo de las MSCs en ratones con Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE), a diferentes tiempos de la enfermedad y estudiar las poblaciones linfocitarias Th1 y Th17 en Sistema Nervioso Central (SNC), bazo y nódulos linfáticos. Para ello, se indujo EAE en ratones hembras C57BL/6 (de 5 a 8 semanas) con 50 μg MOG35-55. 1x106 de MSCs fueron administradas intravenosamente a días 10 (n=6), 18 (n=7) y 30 (n=6) en diferentes grupos experimentales, manteniendo un control sin tratamiento (n=5). El puntaje clínico clásico y atípico fue asignado según se describió previamente por Domingues et al en el 2010. Al día 52 post inducción, se extrajeron nódulos linfáticos, bazo y SNC. Linfocitos Th1 y Th17 obtenidos de bazo y nódulos linfáticos fueron analizados a través de citometría de flujo y se observó la presencia de linfocitos Th17 en SNC mediante la detección de RORγT por PCR en tiempo real. El tratamiento con MSCs a los días 10 y 18 tiende a disminuir la severidad de la enfermedad, y el tratamiento al día 30 tiende a aumentarla, comparando con un control sin tratamiento, aunque no se observan diferencias significativas. La razón de linfocitos Th17/Th1 tiende a aumentar en ratones tratados al día 30 en bazo y en nódulos linfáticos, sin embargo el porcentaje de Th17 es mayor en ratones tratados con MSCs al día 10, lo que se observa tanto en nódulos linfáticos como en médula espinal. Luego del tratamiento con MSCs se observó en todos los grupos experimentales la aparición de signos atípicos relacionados con la infiltración de Th17 en cerebro. Aparentemente, la inyección de MSCs genera un aumento de Th17 en ratones con EAE, aunque de forma diferente, dependiendo del órgano observado y el tiempo de la inyección. A pesar de la disminución de severidad que se ha observado en este modelo en publicaciones anteriores, estos resultados nos indican que el tratamiento con MSCs genera la aparición de estirpes pro inflamatorias que pueden afectar la estabilidad de una enfermedad autoinmune / Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have been proposed as a new therapy in autoimmune pathology, due to the immune suppression exerted on T lymphocytes. Nevertheless in vitro studies show that in certain conditions MSCs favor the generation of CD4+ IL-17+ T Lymphocytes (Th17) but always suppresses CD4+ IFNy+ T Cells (Th1). We decided to evaluate the in vivo effect of MSCs in Experimental Autoimmune Encephalitis (EAE) at different times of the disease and to study the Th1 and Th17 population in Central Nervous System (SNC), spleen and lymph nodes. With this aim, EAE disease in female C57BL/6 (5-8 weeks) mice was induced with 50 μg MOG35-55. 1x106 MSCs was administrated intravenously at days 10 (n=6), 18 (n=7) and 30 (n=6), considering a not treatment control (n=5). The classical and atypical EAE scores were given as was describe previously (Domingues et al, 2010). At day 52, lymph nodes, spleen and spinal cord and where extracted. Th1 and Th17 cells from spleen and lymph nodes were evaluated through flow cytometry and Th17 were check in spinal cord by the detection of RORγT by Real Time PCR. Day 10 treatment with MSCs tends to ameliorate the disease as at 18, and day 30 treatment tends to increase the disease, compares with EAE control. No-significant changes were observed in cumulate score between groups. Th17/Th1 Ratio tends to increase in mice treated at day 30 in spleen and in lymph nodes, but Th17 percent is higher in day 10 MSCs treated mice lymph nodes similar what is shown in spinal cord. After MSCs Treatment, the appearance of atypical EAE signs, related to Th17 cells brain infiltration was observed. Apparently, the MSCs injection causes an increase of Th17 cells in EAE mice, but in a differently, depending on the tissue and the time of injection. Despite the decrease in the severity that was observed in this model in previous publications, these results indicate that treatment with MSCs creates the appearance of pro-inflammatory strains that may affect the stability of an autoimmune disease / Fondo de Ayuda a la Investigación Código FAI-MED-02-2010

Grado de doctor en ciencias biomédicas. / La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune y crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC), caracterizada por una pérdida de la de tolerancia inmunológica, que incluye la inactivación funcional de los linfocitos T reguladores (Tregs). Estudios recientes han descrito diversos mecanismos por los cuales el Interferón (IFN)- γ, una citoquina conocida clásicamente como inflamatoria, posee efectos reguladores y protectores en el modelo animal de la EM, la Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE). Resultados previos de nuestro laboratorio han mostrado que el tratamiento in vivo con IFN-γ en la fase crónica de la EAE induce una mejoría significativa de los síntomas, asociado con un aumento significativo de linfocitos Tregs en el SNC de los animales. En esta tesis, se investigó los mecanismos por los cuales IFN-γ induce dicho aumento de linfocitos Tregs supresores de la EAE. Los resultados obtenidos mostraron que la depleción de células expresando FOXP3 antagonizó los efectos protectores de IFN-γ, corroborando que el efecto terapéutico de esta citoquina es dependiente de los linfocitos Tregs. Ensayos realizados in vitro con linfocitos T CD4+CD25- provenientes de ratones con EAE, revelaron que IFN-γ no ejerce un efecto directo sobre la inducción ni funcionalidad de linfocitos Tregs. Además, se determinó que IFN-γ inhibe la expresión de FOXP3+ en condiciones de diferenciación de linfocitos Tregs inducibles (TGF-b + IL-2). Tampoco se observó un efecto directo de IFN- γ sobre la expresión de moléculas reguladoras, expresión de FOXP3+ o funcionalidad de linfocitos Tregs obtenidos de ratones con EAE. La administración in vivo conjunta de IFN-γ y anticuerpos neutralizantes contra IL-10, TGF-b o PD-1, mostró que el efecto terapéutico de IFN-γ en la fase crónica de la EAE depende de TGF-b y de la vía PD-1/PD-Ls, pero no así de IL-10. Análisis de la expresión de moléculas regulatorias en diferentes subpoblaciones celulares provenientes de ratones con EAE, determinó que IFN-γ indujo un incremento en la expresión de TGF-b y PD-L1 en diferentes subgrupos de células CD11b+ (células presentadoras de antígeno) y de TGF-b en linfocitos T CD8+. Además, se encontró que células CD11b+ estimuladas 9 con IFN-γ in vivo o in vitro son capaces de inducir, de manera dependiente de TGF-b y PD-L1, un aumento en la frecuencia de linfocitos Tregs a partir de linfocitos T CD4+ naïve provenientes de animales sanos (sin EAE) wild type o 2D2 (expresando un TCR específico para el péptido de mielina). En resumen, el conjunto de los resultados obtenidos en esta tesis revela que los efectos benéficos de IFN-γ en la fase crónica de la EAE se deben a un aumento de linfocitos Tregs en el SNC mediado por la expresión de FOXP3, TGF-b y la vía PD-1/PD-Ls, y asociado a un aumento en la expresión de TGF-b y PD-L1 en células CD11b+ y de TGFb en linfocitos T CD8+. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease affecting the central nervous system (CNS), characterized by a lost of immune tolerance, that includes a functional inactivation of regulatory T lymphocytes (Tregs). Recent studies have described different mechanisms by which Interferon (IFN)-γ, known classically as a proinflammatory cytokine, has regulatory and protective effects in the animal model of MS, the Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). Previous results of our laboratory have shown that in vivo treatment with IFN-γ during the chronic phase of EAE induced a significant amelioration of symptoms, associated with a significant increase of Tregs lymphocytes in the SNC of these mice. In this thesis, the mechanisms by which IFN-γ induced the increase of Tregs suppressing EAE was investigated. The results obtained shown that depletion of cells expressing FOXP3 suppressed the protective effects of IFN-γ, supporting the notion that the therapeutic effect of this cytokine is Tregs-dependent. Assays performed in vitro with T CD4+CD25- lymphocytes obtained from EAE mice revealed that IFN-γ did not exert a direct effect on the induction or functionality of Tregs. In addition, IFN-γ inhibited FOXP3 expression in conditions of iTregs differentiation (TGF-b + IL-2). Likewise, IFN-γ did not affect the expression of regulatory molecules, FOXP3 expression, or functionality of Tregs obtained from EAE mice. The in vivo combined administration of IFN-γ and neutralizing antibodies against IL-10, TGF-b or PD-1, showed that the protective effect of IFN-γ in the chronic phase of EAE depends of TGF-b or PD-1/PD-Ls pathway, but not on IL-10. Analysis of regulatory molecules expression in different cell subpopulations obtained from EAE mice determined that IFN-γ induced an increased expression of TGF-b and PD-L1 on different subgroups of CD11b+ cells (antigen presenting cells) and TGF-b on CD8+ T cells. In addition, it was found that in vivo and in vitro IFN-γ–stimulated CD11b+ cells were able to induce, in a TGF-b and PD-L1-dependent manner, an increase of Tregs frequency starting from naïve T CD4+ cells obtained from healthy (without EAE) wild type or 2D2 (expressing a specific TCR for myelin peptide)) mice. Overall, all results obtained in this thesis reveal that the beneficial effects of IFN-γ in the chronic phase of EAE are related with an increase of Tregs in the SNC mediated by the expression of FOXP3, TGF-b and PD-1/PD-Ls pathway, and associated with an enhance in the expression of TGF-b and PD-L1on CD11b+ cells and TGF-b on T CD8+ cells.

L'AMPc té un paper clau com a missatger intracel.lular regulant la transmissió dels senyals extracel•lulars en diferents teixits i controlant múltiples processos cel lulars. Els nivells intracel.lulars d'AMPc es controlen mitjançant la seva síntesi, catalitzada per l'enzim adenilat ciclasa, i mitjançant la seva degradació a través de l'acció de les fosfodiesterases (PDE) de nucleòtids cíclics. Hi ha 11 famílies de PDEs. La PDE4 representa a una família de fosfodiesterases específiques d'AMPc formada per quatre gens paràlegs (PDE4-D), cadascun dels quals és capaç de generar múltiples variants d’splicing. La PDE4A, la PDE4B i la PDE4D es troben expressades en diferents tipus de cèl lules inflamatòries on tenen un important paper com reguladores dels processos inflamatoris. La inhibició selectiva, tant in vitro com in vivo, de PDEs ha demostrat tenir diferents efectes antiinflamatoris. En aquest treball es mostra la implicació de la isoforma PDE4B, i en concret la seva variant de splicing PDE4B2, durant el procés neuroinflamatori del model animal d’Esclerosis Múltiple, l’Encefalomielitis Autoimmune Experimental (d’EAE). Els resultats mostren un augment de l’expressió de l’ARNm de PDE4B2 a la medul•la espinal de ratolins EAE que correlaciona amb l’expressió d’alguns marcadors inflamatoris de forma dependent a la simptomatologia clínica dels animals. També s’observa que l’enzim PDE4B es trova localitzat principalment en cèl•lules presentadores d’antigen (APCs) com les cèl•lules dendrítques i els macròfags/micròglia. A més, els ratolins PDE4B-/- mostren una aparició temprana dels símptomes clínics en comparació amb els ratolins wildtype, amb alteracions en l’expressió de l’ARNm d’algunes citocines. L’alteració selectiva de la PDE4B2 en el model d’EAE en ratolí i la seva participació en el desenvolupament de la malaltia com s’ha observat en els animals PDE4B-/- presenta noves possibilitats sobre l’ús d’inhibidors selectius per les diverses isoformes (i variants d’splicing) tant per aplicacions terapèutiques com per investigar mecanismes d’inflamació en malalties neurodegeneratives. / Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis that courses with neuroinflammation, axonal damage and demyelination. The model is characterized by T- and B-cell responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein which produce a wide range of pro- and anti-inflammatory cytokines. The modulation of cAMP levels through pharmacological manipulation of phosphodiesterases (PDEs) provokes profound anti-inflammatory responses. In the EAE model, amelioration of the clinical signs and delayed onset is observed after PDE4 inhibition and the PDE4B gene has been related to the inflammatory immune response in mice. Here we analyzed post-immunization changes in the expression of mRNA coding for the PDE4B2 splice variant by semiquantitative real-time PCR and in situ hybridization. The results showed an upregulation of PDE4B2 mRNA in the spinal cord of EAE mice which correlates with FoxP3 and TGF-β mRNAs expression in a score-dependent manner. We also found that PDE4B enzyme is mainly localized in antigen-presenting cells (APCs) such as dendritic cells and microglia/macrophages. PDE4B-/- mice show an earlier onset of the disease compared to wildtype mice, with alterations in some cytokine mRNA expression. The results point to a protective role of the PDE4B enzyme and PDE4B2 splice variant in particular, during EAE pathogenesis by modulating cAMP levels in APCs and controlling the cytokine environment for T-cell differentiation.